專利名稱：一種適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種哺乳動物細胞高效表達載體。
背景技術：
按照宿主細胞的類型，可將基因表達系統大致分為原核、酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細胞表達系統。與其它系統相比，哺乳動物細胞表達系統的優勢在于能夠指導蛋白質的正確折疊，提供復雜的N型糖基化和準確的0型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達產物在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質分子。從最開始以裸露DNA直接轉染哺乳動物細胞至今的30余年間，哺乳動物細胞表達系統不僅已成為多種基因工程藥物的生產平臺，在新基因的發現、蛋白質的結構和功能研究中亦起了極為重要的作用。但是動物細胞外源蛋白表達效率低，且成本高，因此提高動物細胞外源蛋白表達效率，降低生產成本是當前急需完成的工作。高水平的哺乳動物細胞表達載體應具有以下特點有高效的啟動子，以啟動目的基因的轉錄；有效的轉錄終止信號，保證轉錄的正確終止；具有篩選與基因擴增標志，方便篩選染色體中高拷貝整合目的基因的細胞。在外源基因進行表達過程中，選用什么表達載體需要從多方面考慮，同一個表達載體，同一個啟動子在不同的細胞類型中效果差異較大， 這和該細胞中轉錄調控因子的存在狀況有關，需要不斷的摸索。CHO(中國倉鼠卵巢)細胞是目前表達外源基因最常選用的工程細胞。其中 CHO-dhfr—和CHO-GS是哺乳動物細胞表達的主流細胞株，CHO-dhfr-system是廣泛應用的工程細胞株(國外和國內多個保藏機構有售)，它可以在氨甲喋呤(MTX)壓力下使外源基因的拷貝數擴增，使外源蛋白得到高水平的表達。而且，此細胞株易于轉染，可以進行懸浮培養、無血清培養和高密度發酵。適宜在工業上大量生產重組蛋白。CHO-GS system 是Lonza公司開發的一種高效的外源蛋白表達系統。在哺乳動物細胞內，谷氨酰胺合成酶 (Glutamine synthetase, GS)催化谷氨酸鹽(glutamate)和銨鹽(ammonium)合成谷氨酰胺(glutamine)，這一反應是細胞內谷氨酰胺的唯一來源。但是，有些體外培養的細胞(如小鼠骨髓瘤細胞)天然不能產生足夠的GS分子，它們需要在培養基中添加外源性的谷氨酰胺才能維持正常的生長代謝。因此，GS被認為是理想的轉染克隆篩選標記在無外源性谷氨酰胺的條件下，只有整合入外來GS基因的細胞才能生長并形成克隆。在MSX的加壓下可以使得CHO-GS細胞高效表達外源基因，通過優化表達載體的方式，可以提高宿主細胞對外源基因的表達，因此，構建一種適用于哺乳動物細胞，尤其是CHO細胞的高效表達載體在工業生產中意義重大。

發明內容
本發明的目的在于提供一種適用于哺乳動物細胞并能高效表達外源蛋白的雙順反子表達載體及其應用，以降低外源蛋白的生產成本。本發明一方面公開了一種適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體，所述載體包括以下5’ -3’方向的連接元件(1)開放閱讀框1 包含依次排列的巨細胞病毒(CMV)早期啟動子/增強子及內含子序列、多克隆位點、牛生長激素終止子序列；(2)開放閱讀框2 包含依次排列的巨細胞病毒(CMV)早期啟動子/增強子及內含子序列、多克隆位點、牛生長激素轉錄終止子及猿猴病毒SV40啟動子序列；(3)篩選標記基因、猿猴病毒SV40終止子序列。較優的，所述開放閱讀框1和開放閱讀框2的巨細胞病毒(CMV)早期啟動子/增強子及內含子序列為SEQ ID NO :1。較優的，所述開放閱讀框1的牛生長激素轉錄終止子序列為SEQ ID NO :2。較優的，所述開放閱讀框2的牛生長激素轉錄終止子及猿猴病毒SV40啟動子序列為 SEQID NO :3ο較優的，所述猿猴病毒SV40終止子序列為SEQ ID NO :4。較優的，所述開放閱讀框1的多克隆位點包括NheI酶切位點和MluI酶切位點；所述開放閱讀框2的多克隆位點包括EcoRI酶切位點和NotI酶切位點。較優的，所述篩選標記基因選自二氫葉酸還原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)基因。較優的，所述適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體是由質粒Pcmob3H改造獲得。更優的，所述適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體是在質粒Pcmob3H多克隆位點的MlI酶切位點和NheI酶切位點之間，自5’ -3’方向插入有所述開放閱讀框1、開放閱讀框2以及篩選標記基因和猿猴病毒SV40終止子序列。較優的，所述動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。更優的，所述動物細胞選自CHO-Kl或CHO-dhfr—細胞株。本發明第二方面公開了一種適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體在哺乳動物細胞表達蛋白中的應用。 較優的，所述蛋白為抗體，包括一條重鏈和一條輕鏈。更優的，所述抗體為全人TNF α單克隆抗體，包括全人TNF α單克隆抗體的輕鏈和全人TNF α單克隆抗體的重鏈。最優的，所述全人TNF α單克隆抗體的輕鏈序列為SEQ ID NO 5 ；所述全人TNF α 單克隆抗體的重鏈序列為SEQ ID NO :6。本發明適用于哺乳動物細胞并能高效表達外源蛋白的雙順反子表達載體，在其兩個開放閱讀框中分別設有多克隆酶切位點，可以通過雙酶切、連接的方法將外源蛋白的基因序列插入到所述多克隆位酶切點處將本發明中的表達載體經限制性內切酶雙酶切、電泳，回收片段大小符合要求的表達載體片段，將大小符合要求的表達載體片段與經過相同的限制性內切酶處理的外源蛋白的基因進行連接，獲得相對應蛋白的高效表達載體。本發明第三方面公開了一種裝載有全人TNFa單克隆抗體基因的雙順反子表達載體，所述載體為在本發明所述適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體的基礎上構建， 其中，所述開放閱讀框1的多克隆位點插入有全人TNF α單克隆抗體輕鏈DNA序列，所述開放閱讀框2的多克隆位點插入有全人TNF α單克隆抗體重鏈DNA序列。
較優的，所述全人TNF α單克隆抗體的輕鏈DNA序列為SEQ ID NO :5，全人TNF α 單克隆抗體的重鏈DNA序列為SEQ ID NO :6。較優的，所述開放閱讀框1的多克隆位點包括NheI酶切位點和MluI酶切位點，所述全人TNF α單克隆抗體輕鏈DNA序列插入于NheI酶切位點和MluI酶切位點之間；所述開放閱讀框2的多克隆位點包括EcoRI酶切位點和NotI酶切位點，所述全人TNF α單克隆抗體重鏈DNA序列插入于EcoRI酶切位點和NotI酶切位點之間。本發明的有益效果為(1)具有巨細胞病毒(CMV)的早期啟動子與增強子序列， 可高效進行外源基因的轉錄；( 含有一段內含子序列，可提高信使RNA(mRNA)的穩定性， 延長其半衰期；C3)含有牛生長激素多聚腺苷酸轉錄終止信號，保正mRNA轉錄的及時終止； (4)含有二氫葉酸還原酶(DHFR)，作為篩選及擴增標志，可篩選得到穩定整合目的基因的細胞株，并使細胞在MTX選擇壓力下，提高目的基因的表達。(5)將輕鏈和重鏈區放在同一載體中共同轉錄和表達，使重鏈、輕鏈能保證1 1的比例表達，組成全分子抗體。因此，本發明的載體具有高效的啟動子，以啟動目的基因的轉錄；有效的轉錄終止信號，保證轉錄的正確終止；具有篩選與基因擴增標志，方便篩選染色體中高拷貝整合目的基因的細胞。抗體的表達量的測定結果表明，與現有動物細胞雙順反子表達載體相比，本發明的雙順反子表達載體的抗體表達量獲得大幅提升，表達水平提高了約10-20倍，提高了動物源性抗體的制備效率，降低生產成本。


圖1 雙順反子表達載體的結構圖2 :pHAI-H質粒的構建過程圖3 :pHAI-DH質粒的構建過程圖4 :pHAI-N-DH質粒的構建過程
具體實施例方式下述實施例詳細說明本發明，但并不對其發明范圍進行限制。實施例lpCMV-intron-L-BGH PA 片段的擴增(l)pCMV啟動子與內含子的PCR擴增質粒pCI-neo為真核表達質粒載體，以pCI-neo質粒為模板，以巨細胞病毒(CMV) 早期啟動子/增強子及內含子序列(SEQ ID NO 1)為參考，設計含McI酶切位點或NheI 酶切位點的引物P1/P2進行PCR反應，擴增兩端帶有酶切位點的巨細胞病毒(CMV)早期啟動子/增強子及內含子序列，PCR反應條件如表1。上游引物(Pl):5' -GCGGAGCTCGGGCTATTGGCCATTGCATACGC-3 ‘(下劃線為 SacI 酶切位點)(SEQ ID NO 7)下游引物(P2)5' -TGAACTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAGCTAGCGC-3'(下劃線為 NheI 酶切位點)(SEQ ID NO 8)于100 μ 1薄壁離心管建立以下反應體系
6質粒 pCI-neo2 μ (1 η;IOxPCR反應緩沖液5 μ dNTP (IOmM)2μ1上游引物(Pl) (5 pmol/μ )1 μ 下游引物(P2) (5 pmol/μ )1 μ Pfu DNA聚合酶(3υ/μ1)0.5 μ
加滅菌重蒸水至終體積50 μ
權利要求
1.一種適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體，所述載體包括以下5’-3’方向的連接元件(1)開放閱讀框1包含依次排列的巨細胞病毒早期啟動子/增強子及內含子序列、多克隆位點、牛生長激素轉錄終止子序列；(2)開放閱讀框2包含依次排列的巨細胞病毒早期啟動子/增強子及內含子序列、多克隆位點、牛生長激素轉錄終止子及猿猴病毒SV40啟動子序列；(3)篩選標記基因、猿猴病毒SV40終止子序列。
2.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述開放閱讀框1和開放閱讀框2的巨細胞病毒早期啟動子/增強子及內含子序列為SEQ ID NO :1。
3.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述開放閱讀框1的牛生長激素轉錄終止子序列為SEQ ID NO :2。
4.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述開放閱讀框2的牛生長激素轉錄終止子及猿猴病毒SV40啟動子序列為SEQ ID NO :3。
5.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述猿猴病毒SV40終止子序列為 SEQ ID NO :4ο
6.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述開放閱讀框1的多克隆位點包括NheI酶切位點和MluI酶切位點；所述開放閱讀框2的多克隆位點包括EcoRI酶切位點和NotI酶切位點。
7.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述篩選標記基因選自二氫葉酸還原酶基因。
8.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體是由質粒Pcmob3H改造獲得。
9.如權利要求8所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體是在質粒PcmobIBH多克隆位點的Mil酶切位點和NheI酶切位點之間， 自5’-3’方向插入所述開放閱讀框1、開放閱讀框2、篩選標記基因以及猿猴病毒SV40終止子序列。
10.如權利要求1所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
11.如權利要求10所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述中國倉鼠卵巢細胞選自CHO-Kl或CHO-dhff細胞株。
12.如權利要求1-11任一權利要求所述適用于哺乳動物細胞的雙順反子表達載體在哺乳動物細胞表達蛋白中的應用。
13.如權利要求12所述的應用，其特征在于，所述蛋白為抗體，包括一條重鏈和一條輕鏈。
14.如權利要求13所述的應用，其特征在于，所述抗體為全人TNFα單克隆抗體，包括全人TNF α單克隆抗體的輕鏈和全人TNF α單克隆抗體的重鏈。
15.如權利要求14所述的應用，其特征在于，所述全人TNFα單克隆抗體的輕鏈的DNA 序列為SEQ ID NO :5，全人TNFa單克隆抗體的重鏈的DNA序列為SEQ ID NO :6。
16.一種裝載有全人TNFa單克隆抗體基因的雙順反子表達載體，所述載體為在權利要求1-11任一權利要求所述雙順反子表達載體的基礎上構建，其中，所述開放閱讀框1的多克隆位點插入有全人TN α單克隆抗體輕鏈DNA序列，所述開放閱讀框2的多克隆位點插入有全人TNF α單克隆抗體重鏈DNA序列。
17.如權利要求16所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述全人TNFα單克隆抗體的輕鏈DNA序列為SEQ ID NO :5，全人TNFa單克隆抗體的重鏈DNA序列為SEQ ID NO :6。
18.如權利要求16所述的雙順反子表達載體，其特征在于，所述開放閱讀框1的多克隆位點包括NheI酶切位點和MluI酶切位點，所述全人TNF α單克隆抗體輕鏈DNA序列插入于NheI酶切位點和MluI酶切位點之間；所述開放閱讀框2的多克隆位點包括EcoRI酶切位點和NotI酶切位點，所述全人TNF α單克隆抗體重鏈DNA序列插入于EcoRI酶切位點和 NotI酶切位點之間。
全文摘要
本發明公開了一種適用于哺乳動物細胞并能高效表達外源基因的雙順反子表達載體及其應用。該雙順反子表達載體包括5’-3’方向的連接元件(1)開放閱讀框1包含依次排列的巨細胞病毒的早期啟動子/增強子及內含子序列、多克隆位點、牛生長激素轉錄終止子序列；(2)開放閱讀框2包含依次排列的巨細胞病毒的早期啟動子/增強子及內含子序列、多克隆位點、牛生長激素轉錄終止子及猿猴病毒啟動子序列；(3)篩選標記基因、猿猴病毒SV40終止子序列。本發明的雙順反子載體具有高效的啟動子，有效的轉錄終止信號，具有篩選與基因擴增標記，具有兩個開放閱讀框，提高了外源蛋白的表達效率，降低生產成本。
文檔編號C12N15/85GK102392047SQ20111035513
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者倪健, 梁輝 申請人:蘇州工業園區晨健抗體組藥物開發有限公司