專利名稱：一種花藥特異表達啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和植物學領域；更具體地，本發明涉及一種花藥特異表達啟動子及其應用。
背景技術：
人類通過對自然突變基因和重組體的選擇與利用，對作物的品種進行改良已有近千年的歷史。近百年來，通常采用人工雜交的方法，實現優良基因的重組和外源基因的導入培育作物新品種。雜交育種技術能夠實現種內基因轉移，但是，親緣關系較遠的品種之間的基因轉移則存在障礙；另一方面，雜交育種技術不能準確選擇和操縱某個基因，因此，增加了育種結果的復雜性。通過轉基因的手段進行作物品種的選育，其優勢在于轉基因不受生物體間親緣關系的限制，從轉基因的技術角度來講，候選轉化的基因來源幾乎不受限制；因此，本發明人可以通過轉基因的手段聚合各種有效基因，培育高產、優質、抗逆的作物新品種。另一方面， 轉基因技術所操作和轉移的基因是功能明確、控制目標性狀的基因，因此，轉基因后代的表型更具有可預見性。目前，轉基因技術已經成為作物品種改良的重要手段，轉基因大豆、玉米、棉花和油菜的種植面積已達4種作物全球總種植面積的25% (James, 2005 ；Sankula et al.，2005)。在植物的轉基因中需要兩個必需的元件，即啟動子和目的基因。啟動子是位于基因轉錄起始位點上游的順式調控序列，與反式作用的識別因子結合，通過識別因子與RNA 聚合酶的相互作用，啟動基因的轉錄；因此，啟動子調控基因的表達模式，即目的基因表達的時空特異性及表達的強度，是轉基因成敗或成效高低的關鍵因素之一。針對轉基因的目的不同，轉化的基因選擇不同的表達模式，主要包括組成型高表達、組織特異性表達及誘導型表達等。如在棉花、玉米、水稻等農作物中轉入蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)的抗蟲蛋白采用的是組成型高表達的方式，在作物中高劑量表達Bt抗蟲蛋白的優勢在于高劑量可以確保殺蟲的效果，同時有利于延長Bt抗蟲蛋白的有效期。在金稻谷(Golden rice)的創制過程中，其目標是通過在水稻胚乳中引入了維生素A前體的合成途徑，從而在稻米中強化維生素A，解決維生素A營養缺乏的問題；因此，轉基因時采用的啟動子為在水稻胚乳中特異表達的谷蛋白啟動子。在植物抗病基因的轉化中，常采用病原菌誘導表達的啟動子。隨著轉基因農作物在全球的大面積推廣，啟動子在轉基因中的重要性得到廣泛的共識，本發明人需要不同類型的啟動子幫助本發明人提供轉基因表達模式的解決方案。例如，在水稻組織特異啟動子的研究領域中，人們最為關注的是花藥特異的啟動子。水稻花藥是水稻雄性配子花粉產生的器官，與水稻穗的發育、育種及水稻的產量等密切相關。因此，本領域需要進一步研究植物花藥特異性表達的啟動子，以用于在花藥中特異性表達一些功能基因或結構基因，達到品種改良的目的。

發明內容
本發明的目的在于提供一種花藥特異表達啟動子及其應用。在本發明的第一方面，提供一種分離的多核苷酸(啟動子)，所述的多核苷酸(a)位于 osigcfa001gl2 基因(GenBank 登錄號CT833313)的 5，端及其上游；
(b)堿基長度為200-2000個；(c)具有引發轉錄的必要位點及轉錄起始點；且(d)具有在植物花藥中特異表達功能。在本發明的一個優選例中，所述的OSigCfa001gl2基因來源于禾本科植物；更佳地來源于水稻(Oryza Sativa)。在本發明的一個優選例中，(a)中，位于OSigCfa001gl2基因上游-1000至編碼區第100位。在本發明的另一優選例中，所述的多核苷酸是(I)SEQ ID NO 1中第1-521位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(2) SEQ ID NO 1中第1_552位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(3) (1)或(2)任一限定的多核苷酸，其中第1-22位堿基缺失(即=SEQ ID NO 1 中第23-552位所示的核苷酸序列的多核苷酸；或SEQ ID NO 1中第23-521位所示的核苷酸序列的多核苷酸)；(4)由SEQ ID NO :1中(1_22) (521-552)位所示的核苷酸序列構成的多核苷酸；(6)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與(1)-⑷任一限定的多核苷酸序列雜交且具有指導目的基因在植物花藥中特異表達功能的多核苷酸；(7)核苷酸序列與(1)44)任一限定的多核苷酸序列有80%以上(較佳地85%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上；)同源性且具有指導目的基因在植物花藥中特異表達功能的多核苷酸；或(8)核苷酸序列與(1)-⑷任一限定的多核苷酸序列完全互補的多核苷酸。在本發明的另一優選例中，所述的多核苷酸是基于SEQ ID N0:1中第1_521位或SEQ ID NO 1中第1-552位所示核苷酸序列，第436-442位、第146-153位、第278-283, 第305-311位和/或第觀7-312位Q6bp)核苷酸序列不變，其它位點與(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列具有50% (較佳地60% ；更佳地70% ；更佳地80% ；更佳地90% ；更佳地 95% ；更佳地99%)以上相同性的，且指導目的基因在植物花藥中特異表達功能的多核苷酸。在本發明的另一優選例中，所述的多核苷酸是基于SEQ ID NO 1中第1_521位或 SEQ ID NO 1中第1-552位所示核苷酸序列，第99-104位、第115-120位和/或第131-138 位核苷酸序列不變，其它位點與(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列具有50% (較佳地60%; 更佳地70% ；更佳地80% ；更佳地90% ；更佳地95% ；更佳地99% )以上相同性的，且具有指導目的基因在植物花藥中特異表達功能的多核苷酸。在本發明的另一優選例中，所述的植物是單子葉植物。在本發明的另一優選例中，所述的植物包括(但不限于)禾本科植物、石蒜科植物、百合科植物、鳶尾科植物、或薯蕷科植物等。
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更優選的，所述的植物是禾本科植物。例如所述植物包括但不限于水稻、小麥、大
麥、玉米、高粱等。在本發明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于指導目的基因在植物花藥中特異表達。在本發明的另一方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的多核苷酸，作為啟動子元件。在本發明的一個優選例中，所述的載體還含有與所述的多核苷酸操作性連接的目的基因。在本發明的另一優選例中，所述的目的基因是結構基因。在本發明的另一優選例中，所述的目的基因可編碼具有特定功能的蛋白。在本發明的另一優選例中，所述的目的基因是外源基因。在本發明的另一優選例中，所述的目的基因包括(但不限于)細胞毒基因 (Cytotoxic gene)，如來自于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的核糖核酸酶(Barnase)基因或者連接來自于曲霉菌(Aspergillus oryzae)的核糖核酸酶Tl (RNase Tl)基因；擬南芥中影響花藥絨粘層功能及花粉形成的DYTl基因，ABORTED MICROSPORE 基因(AMS)及MALE STERILITY 1基因(MSl)等；水稻中影響絨粘層功能及花粉形成的 MULTIPLE SP0R0CYTE1 基因(MSPl)，0sTDLlA 基因，UNDEVELOPED TAPETUM 基因(OsUDTl)及 TAPETUM DEGENERATION RETARDATION 基因(OsTDR)等。在本發明的另一優選例中，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游，且與所述多核苷酸的間隔小于1000bp。優選的，小于500bp ；更優選的，小于IOObp ；最優選的，小于 50bp。在本發明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的細胞含有所述的載體；或其基因組中整合有外源的所述的多核苷酸。在本發明的另一方面，提供一種使目的基因在植物花藥中特異表達的方法，所述的方法包括將構建物轉化植物細胞，所述的構建物含有所述的多核苷酸以及與所述的多核苷酸操作性連接的目的基因；篩選出轉入了所述構建物或染色體中整合有所述構建物的植物細胞；和
將所述植物細胞再生成植株。在本發明的另一優選例中，所述的方法包括(a)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述表達載體中含有構建物，所述的構建物含有所述的多核苷酸以及與所述的多核苷酸操作性連接的目的基因；(b)將植物細胞、組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使所述的構建物轉入植物細胞。在本發明的另一優選例中，所述方法還包括(c)選擇出轉入了所述構建物的植物細胞、組織或器官；以及(d)將步驟(C)中的植物細胞、組織或器官再生成植物。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了 PCR擴增潮霉素序列(轉基因載體中用于抗性篩選的基因)，鑒定轉基因水稻苗中是否含有T-DNA插入的電泳結果。M，DNA Marker DL2000 (DNA分子量標準)； 1-12代表來自于不同轉基因系(lines)的不同轉基因植株的鑒定結果。圖2顯示了啟動子轉基因水稻中各不同組織⑶S報告基因染色的結果。其中A，水稻幼穗中的⑶S染色；B,水稻穎花中的⑶S染色；C，與圖B為同一階段，將穎花的兩片穎殼(內穎與外穎)剝開來，箭頭所指的為特異染成藍色的花藥組織；D，水稻穎花中的⑶S染色；a，花藥；s，柱頭；o，子房。E，開花后的穎花的⑶S染色；F，與圖E為同一階段，將穎花的兩片穎殼剝掉，顯示雄蕊及雌蕊的染色；a，花藥； s，柱頭；O，子房。G，與圖E為同一階段，放大的花藥部分，顯示花藥染色；H，與圖E為同一階段，顯示花粉染色；I，根的⑶S染色；J，葉片的⑶S染色；K，葉鞘、葉舌、葉耳的⑶S染色；L，莖的⑶S染色；圖中，G、H中的標尺為100 μ m,其它圖中的標尺均為1mm。圖3顯示了花藥切片中⑶S染色結果，藍色表明⑶S染色為陽性。A，花藥；T，絨粘層；L 穎殼；E，表皮；MC，減數分裂的細胞。圖4顯示了⑶S基因在穗中特異高表達的定量結果的柱形圖。圖5、Ml啟動子轉基因水稻中各不同組織⑶S報告基因染色的結果。A，根的⑶S染色；B，葉片的⑶S染色；C，葉鞘、葉舌、葉耳的⑶S染色；D，莖的⑶S 染色；E，花的GUS染色。圖中的標尺均為1mm。圖6、M2啟動子轉基因水稻中各不同組織⑶S報告基因染色的結果。A，根的⑶S染色；B，葉片的⑶S染色；C，葉鞘、葉舌、葉耳的⑶S染色；D，莖的⑶S 染色；E，花的GUS染色。圖中的標尺均為1mm。圖7、M3啟動子轉基因水稻中各不同組織⑶S報告基因染色的結果。A，根的⑶S染色；B，葉片的⑶S染色；C，葉鞘、葉舌、葉耳的⑶S染色；D，莖的⑶S 染色；E，花的GUS染色。圖中的標尺均為1mm。圖8、M4啟動子轉基因水稻中各不同組織⑶S報告基因染色的結果。A，根的⑶S染色；B，葉片的⑶S染色；C，葉鞘、葉舌、葉耳的⑶S染色；D，莖的⑶S 染色；E，花的GUS染色。圖中的標尺均為1mm。圖9、啟動子及其截短形式的⑶S定量結果。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，首次分離到一個可在植物花藥中特異性表達的啟動子。所述的啟動子可指導目的基因在植物花藥中特異性高表達，而在植物的其它組織中低表達或不表達。術語如本文所用，所述的“植物”主要是指單子葉植物，包括(但不限于)禾本科植物、 石蒜科植物、百合科植物、鳶尾科植物、或薯蕷科植物等。更優選的，所述的植物是禾本科植物，包括但不限于水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。如本文所用，所述的“可操作地連接”或“操作性連接”是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被“可操作地連接” 到該核酸序列上。如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變等來獲得。如本文所用，術語“特異性表達”是指目的基因在特定的時間和/或特定的組織表達。如本文所用，“組織特異性啟動子”又稱“器官特異性啟動子”，在這類啟動子調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現出發育調節的特性。本發明中， 所述的“組織特異性啟動子”是植物花藥特異表達啟動子。通常，如果在某組織或器官中mRNA以比在其它組織或器官中高至少10倍，優選至少高100倍，更優選至少高1000倍水平被表達，則該啟動子被認為是組織或器官特異性的。如本文所用，“外源的”或“異源的”是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關系。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對于該目的基因來說是外源的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來說是“外源的”。如本文所用，“順式調控元件”是指對基因的轉錄起始和轉錄效率起調節作用的保守性堿基序列。如本文所用，“目的基因”是指可由本發明的啟動子啟動或指導表達的基因。合適的目的基因包括但不限于改良植物品質、性狀或代謝相關的基因。合適的目的基因包括但不限于細胞毒基因(Cytotoxic gene)，如來自于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的核糖核酸酶(Barnase)基因或者連接來自于曲霉菌(Aspergillus oryzae)的核糖核酸酶Tl (RNase Tl)基因；擬南芥中影響花藥絨粘層功能及花粉形成的 DYTl 基因，ABORTED MICROSPORE 基因(AMS)及 MALE STERILITY 1 基因(MSl)等。水稻中影響絨粘層功能及花粉形成的MULTIPLE SP0R0CYTE1基因(MSPl)，OsTDLIA基因， UNDEVELOPED TAPETUM基因(OsUDTl)及 TAPETUM DEGENERATION RETARDATION基因(OsTDR)寸。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構
成”、“基本上由......構成”、和“由......構成”；“主要由......構成”、“基本上
由......構成”和“由......構成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，所述的“SEQ ID NO 1中(1_22) (521-552)位所示的核苷酸序列” 也即指所述序列可起始于SEQ ID NO :1中第1位至第22中的任一位的堿基，終止于SEQ ID NO :1中第521位至第552位的任一位的堿基。啟動子本發明提供一種花藥特異性表達啟動子，所述的啟動子具有以下特點(a)位于 osigcfa001gl2基因的5，端及其上游；(b)堿基長度為200-2000個；(c)具有引發轉錄的必要位點及轉錄起始點；且(d)具有在植物花藥中特異表達功能。本發明的啟動子具有引發轉錄的必要位點及轉錄起始點，本發明人具體地研究了該啟動子的發揮功能的關鍵位點，包括TATA盒(TATAAAT), CAAT盒 (CCAATGCA)，
E.-.享，(^序列及26bp 序列(CTGCTGCACAGGCTAAATCAAACACG)，這些位
點是本發明的啟動子發揮啟動基因表達功能以及發揮花藥特異性表達功能的關鍵區域。作為本發明的一種實施方式，所述的啟動子具有SEQ ID NO 1中第1_521位、第 1-552位、第23-552位所示的核苷酸序列。多核苷酸的雜交是本領域技術人員熟知的技術，特定的一對核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發明還涉及與前述指定的核苷酸序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80% (例如85%、90%、95%、96%、97%、 98%、或99%)相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸?！皣栏駰l件”(或“嚴緊條件”)是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優選60% 以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優選是95%以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸也具有指導目的基因在花藥中特異性表達的功能。本發明還包括與本發明的任一種啟動子序列具有50%或以上(優選60%以上， 70%以上，80%以上，更優選90%以上，最優選95%以上，如98%、99% )相同性的核酸，所述核酸也具有指導目的基因在花藥中特異性表達功能?！跋嗤浴笔侵赴凑瘴恢孟嗤陌俜直龋瑑蓷l或多條核酸之間的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。應理解，盡管本發明的實例中提供了來源于水稻的該啟動子及其功能，然而，來源于其它單子葉植物的與該啟動子具有一定相同性(保守性)的啟動子也包括在本發明的范圍內，只要本領域技術人員在閱讀了本申請后根據本申請提供的信息可以方便地從其它植物中分離得到該啟動子。啟動目的基因表達本發明的啟動子可以被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對于啟動子而言可以是外源(異源)的。對所述目的基因的核酸序列沒有特別的限制(如一種結構性核酸序列)，所述的目的基因優選編碼具有特定功能的蛋白，例如某些在農業或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。本發明的啟動子還可以被可操作地連接到被改進的目的基因序列上，該目的基因相對于啟動子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進來產生各種期望的特性。例如，目的基因可以被改進來增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻譯，改變翻譯后的修飾(如磷酸化位點)，將翻譯產物轉運到細胞外，改善蛋白的穩定性，插入或刪除細胞信號等。此外，啟動子和目的基因可以設計成下調特定基因。這一般是通過將啟動子連接到目的基因序列上來實現，該序列以反義反向被引導。本領域的普通技術人員熟悉這種反義技術。任何核酸序列可以以這種方式被調節。任何一種前述的啟動子和/或目的基因序列可被包含在重組載體中。作為一種方式，所述的重組載體包括本發明的啟動子，在所述啟動子的下游包含多克隆位點或至少一個酶切位點。當需要表達目的基因時，將目的基因連接入適合的多克隆位點或酶切位點內，從而將目的基因與啟動子可操作地連接。作為另一種方式，所述的重組載體包括(從5’到3’方向)啟動子，和目的基因。 如果需要，所述的重組載體還可以包括3’轉錄終止子，3’多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉運和靶向核酸序列、抗性選擇標記、增強子或操作子。用于制備重組載體的方法是本領域熟知的。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要其能夠在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都是可以被采用的。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含有本發明所述的啟動子和/或目的基因序列的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。 表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白 (GFP)等。重組載體中除了含有本發明的啟動子，還可含有一種或多種其它啟動子。所述的其它啟動子例如是組織特異性的、組成型的或誘導型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花葉病毒 19S 和!35S(CaMV19S CaMV35S)、增強的 CaMV、煙草 RB7 等。包含上述適當的啟動子和目的基因的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母； 植物細胞等。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、幼胚轉化法、花芽浸泡法等。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得轉基因的植物。作為一種方式，制備轉基因植物的方法是將攜帶啟動子和目的基因(兩者可操作地連接)的載體轉入農桿菌，農桿菌再將含啟動子和目的基因的載體片段整合到植物的染色體上。涉及的轉基因受體植物例如是水稻、小麥、擬南芥、煙草、果樹等。在本發明的實例中，所述的重組載體是pCambia載體，其自帶β -葡萄糖苷酶 (GUS)基因，將本發明的啟動子構建到該載體中GUS基因的上游，轉化植株，啟動子將激活 GUS基因的表達，所述啟動受到啟動子區各順式作用元件的調控，模擬了基因在體內被激活轉錄的狀況。葡萄糖苷酶(GUQ能催化裂解一系列的葡萄糖苷，產生具有發色團或熒光的物質，可用分光光度計、熒光計或組織化學等方法對GUS活性進行定量和空間定位分析。在本技術領域中，GUS基因已被廣泛地用作轉基因植物、細菌和真菌的報告基因，特別是其可被用于研究外源基因表達的具體細胞和組織部位。應用本發明的花藥特異性啟動子在理論研究和農藝改良中具有重要的應用價值。本發明可廣泛應用于植物基因工程啟動子作為植物基因工程中一個重要工具可與目標基因融合，通過轉基因載體，轉化植物并獲得轉基因植株。水稻花藥特異啟動子的應用價值，包括但不限于以下的方面a、利用水稻花藥特異啟動子創制水稻雄性不育系在水稻雜交育種的過程中需要雄性不育系(Male sterility)，人們利用雄性不育這一特性，免去了人工去雄的操作過程，從而節約了雜交育種的大量人力和時間。因此，雄性不育的植株具有重大的經濟價值。利用水稻花藥特異啟動子可以創制雄性不育系。水稻花藥特異啟動子連接細胞毒基因(Cytotoxic gene)，如來自于解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的核糖核酸酶(Barnase)基因或者連接來自于曲霉菌(Aspergillus oryzae)的核糖核酸酶Tl (RNase Tl)基因，Barnase與RNase Tl基因在其表達的細胞中破壞細胞的正常發育，因此，借助于Barnase或者RNase Tl基因在花藥中的特異表達，可以抑制花藥的正常發育，從而獲得水稻雄性不育系。b、利用水稻花藥特異啟動子控制轉基因在田間的基因擴散目前，轉基因田間控制的一個重要問題是轉基因作物的飄粉問題。轉基因花粉不受控制的傳播會對周圍環境中的其他物種造成基因污染，水稻花藥特異啟動子可以幫助解決這個問題。如上所述，將水稻花藥特異啟動子連接Barnase，一同轉化水稻，這樣得到的水稻轉基因植株，不能形成正常的花粉；因此，避免了轉基因植株的花粉對周圍環境中其他物種造成的基因污染。C、利用水稻花藥特異啟動子研究影響水稻穗發育的重要基因，為增加農作物產量、改進品質、增加抗性提供優異的種源花藥特異啟動子調控基因在花藥中特異表達，其表達部位集中在花藥，在其他組織中不表達，或者表達量很低。與組成型啟動子相比較，花藥特異啟動子的優勢在于，它使得目的基因特異作用于花藥器官，減少了對水稻其他組織可能的影響。為通過基因工程的方法進行水稻品種的改良提供重要的操作手段。
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下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、水稻組織特異啟動子的篩選及基因表達的鑒定本發明人構建了水稻孕穗期的穗、14天幼苗的地上部分及根等組織的全長cDNA 文庫(Liu, XH, Lu TT, Yu SL, Li Y, Huang YC. , Huang Τ. , Zhang L. , Zhu JJ, Zhao Q, Fan DL, Mu J, Shangguan YY, Feng Q, Guan JP, Ying K, Zhang Y, Lin ZX, Sun ZX, Qian Q, Lu YP, Han B. (2007)A collection of 10，096indica rice full-length cDNAs reveals highly expressed sequence divergencebetween Oryza sativa indica and japonica subspecies. Plant Mol Biol. 65 :403-415)。在每個文庫分別進行2萬個克隆的5，末端測序。在每個文庫cDNA冗余度統計的過程中，本發明人發現每種組織的cDNA文庫中都存在一些拷貝數很高的cDNA克隆。將每個文庫中cDNA的拷貝數，按照從高到低排序，找出每個文庫中cDNA拷貝數位于前20位的cDNA ；然后，統計這些cDNA在水稻其他組織的cDNA文庫中的拷貝數，如果這些cDNA在其他組織的文庫不出現，則這些cDNA成為組織特異性高表達啟動子分離的候選基因。然后，本發明人在水稻孕穗期的穗、14天幼苗的地上部分以及根中，通過Real time RT-PCR的方法對候選基因表達的組織特異性進行鑒定，進一步確定候選基因。水稻花藥特異啟動子的克隆及水稻的轉化通過候選基因全長cDNA序列與水稻基因組序列的比對，可以得到基因的上游調控區序列，即啟動子序列。然后通過PCR方法克隆啟動子序列，將啟動子序列插入到pCambia1305. 2 (獲自Cambia公司)表達載體(含⑶S 報告基因)的BamHI及NcoI位點間，常規農桿菌法轉化水稻，通過檢測轉基因水稻中GUS 基因的表達來鑒定啟動子的表達特性。實施例2、水稻花藥特異啟動子的篩選及基因表達組織特異性的鑒定通過對水稻穗全長cDNA文庫中全長cDNA拷貝數的統計，本發明人得到了一個水稻穗特異表達基因的候選基因，osigcfa001gl2 (GenBank登錄號CT833313)。然后，本發明人對OSigCfa001gl2在水稻孕穗期的穗、14天幼苗的地上部分及根中的表達進行Realtime RT-PCR的鑒定。以水稻組成型表達基因actinl作為參照基因，結果如表1。表中OSigCfa001gl2基因的表達量是相對于參照基因actinl的相對表達量。表1
基因名稱根中表達幼苗中表達穗中表達-
osigcfaOO Ig 12 0.005_0.00141413.408上述結果表明，OSigCfa001gl2在穗中的表達非常高，而在水稻根及幼苗中表達非常低。OSigCfa001gl2是在穗中特異高表達的基因。
實施例3、水稻花藥特異啟動子的序列分析、啟動子的克隆及轉基因載體的構建osigcfa001gl2基因的啟動子區序列及基因編碼區序列如SEQ ID N0:1。其中方
框表示的是蛋白的起始密碼子及終止密碼子。加黑顯示的為基因的編碼區，陰影標示的為基因的5，UTR及3，UTR區。雙下劃線為TATA合(TATAAAT)及CAAT盒(CCAATGCA)。斜體加著重號為及^序列。5’端20個堿基為用于擴增啟動子區的引物對應的位點。SEQ ID NO 1 ACCTCAGCCAAAACCGAAGACAGTACCGCCGAAGGACCTTATTTAAACGGTTTTGTTAAGTTGGGGGACCCATCGTACCCGGTTTTGCGACCGGGGACGAAAATCGGACTAGGTGATAAATAGAGGGACCCAAAGTG AACTTATA CCAATGCA. ATTTCATATCAAACAGTCACGGATGGGCTTTAGGAAAGCAGAACTGGGCCCGGCCCAGTAGATCACATAGCCCAACAAGATCTAAACCGCATGCTCTCGTTTCAACAAATTATCACACCGATTG CA TTTG CATCTGCTGCACAGGCTAAAT CAAA CA C GTAGCCATGAACCATTCACCTCACAAGTCACAAGCATTGCATTTCTATGGTTACCAGTGCAGGACGAAATGCTCAACTAGCCCAAGCAAGAATGGAGCATGACAACCTCAGGCACCAAAAGCTC TATAAAT. ATTTGCATTGCACAAATCAAAAGTTTCC AAGTTTTAATCAGAGAAGTTCAAGATATCAGAAA
GAACAACACATACCAGGkTGlTCTCAGCTCAAGTCTTCTAGCCTG
GCTGCACTGCTGATCTTCCTCCTGGCAGTGTTCACCACTGCAGC
AGCAGCGGCAGGTACAGAATGCCAGAACGATGTCGAGGTGCTG
AAGACAACCTGCTACAAGTTCGTTGAGAAGGACGGGCCGAAGC
TGCAGCCATCACCTGACTGCTGCACCTCCATGAAGGGCGTCAA
CGTGCCCTGCGTCTGCACCTACCTGGGCAGCCCAGGCGTCAGG
GACAACATCAACATGGATAAGGTGTTCTATGTCACCAAGCAGTGTGGCATCGCCATCCCCGGGAACTGCGGAG GTGAGCAGGCTTCACTTGATTGGCCACACTGATCACCTGGGTAAGAACTGACAATAACACGCCGGCTCCTCTGGATTGCGACTTCCAGTGGGGCCCAGGTGTCGGTGTCAGCTGGGTAAGTTGGTGTCATCTGGTATGGGAAACTTTGATGTTTTGTACATGTGGTGGTGCTCTTGTCAACATTATATAGATAAGGAGAGAATAGGACAAACATGACGCTTGAATAGCAGAAGAGAAGTTCTATCCAGCAATATCAAAAGTACAGCTGTCATTTTCAAAAAATGTAAAACAAAAATAAAACGAAAAACCCACTATACTAGTGCCAATAAAAGAAGAAACAAAAGAGAACTACATTATTGTCAATGCCATTTGTTGATGTTATTATTACTTTTGTTTATAAGAATAACAATTGTACTTATAAGGCCTA_0] CGATTTATTACAG GATCC AAGGTCf^A AC A AG A ACTG ATTG ACT
TGGTGAAGTTGGCTGACAAAAGCAAGGCACCTAGCAGTTGCACGG CTGATATAGGTAAATAATGTTGGTCAACTTTTAGAGTACACGGATT GTACGTCAACCTTCAGCATGTTGTGATAACAAAATATGTATCAATG ATG本發明人選擇的轉基因載體為pCambial305. 2，克隆的酶切位點選擇BamHI及 NcoI。pCambial305. 2通過BamHI及NcoI酶切，將載體中原有的35S啟動子切掉，割膠回收得到載體片段。擴增的PCR片段內無BamHI切點，但是有NcoI切點。因此本發明人在設計的反向引物中加入BsaI切點，引物序列如下正向弓丨物ggatccacctcagccaaaaccgaaga(SEQ ID NO :2)；弓L :ggtctc ccatgg cagccaggctagaagacttg(SEQ ID NO 3)；BsaI的識別位點為ggtctc，酶切位點為其后的第1個及第5個堿基，因此，實際切點仍然為NcoI切點ccatgg。這樣PCR產物經過BamHI及BsaI酶切后，可以與經過BamHI 及NcoI酶切的pCambia1305. 2連接，得到啟動子轉基因載體。需要說明的是，啟動子與pCambia1305.2連接后，在⑶S蛋白編碼序列前，本發明人引入了 OSigCfa001gl2基因N端的10氨基酸編碼序列，因此，表達的⑶S蛋白是N端含有OSigCfa001gl2基因10個氨基酸的融合蛋白。融合蛋白不影響osigCfa001gl2啟動子表達組織特異性的鑒定。實施例4、水稻的轉化及轉基因水稻中⑶S基因的表達鑒定本發明人通過農桿菌轉化水稻幼胚的方法進行水稻的轉化。啟動子轉基因載體轉入農桿菌 EHA105 (參見 Hood, Ε. Ε.，Gelvin, S. B.，Melchers, L. S.和 Hoekema, Α.， Transgenic Res.，1993，2，208-218)，然后通過EHA105轉化日本晴(獲自中國水稻所)幼胚得到啟動子的轉基因植株。日本晴的幼胚首先經過次氯酸鈉消毒，置于誘導培養基上誘導愈傷組織的產生。幼胚誘導產生的愈傷與農桿菌26°C、黑暗中共培養3天。然后，轉入含有40mg/l潮霉素及300mg/l頭孢霉素的篩選培養基上培養4個星期。篩選得到的抗性愈傷轉入含有0. 5mg/l萘乙酸(NAA)，4mg/l激動素(kinetin)，6mg/l 6-芐基氨基嘌呤(6-BA)， 40mg/l潮霉素，300mg/l頭孢霉素的再生培養基，培養2-3個星期。之后，得到的再生小苗轉入1/2MS生根培養基中進行生根培養。2-3個星期后，轉基因苗移入人工氣候室培養。通過水稻的轉化，本發明人得到5-10個系(lines)的轉基因植株進行啟動子活性的鑒定。首先，轉基因水稻進行T-DNA插入的鑒定。抽提轉基因水稻苗的基因組DNA，以轉基因水稻苗的基因組DNA為模板，PCR擴增潮霉素序列(轉基因載體中用于抗性篩選的基因)，鑒定轉基因水稻苗中是否含有T-DNA插入，見圖1。PCR擴增陽性表明T-DNA插入為陽性。通常篩選得到的轉基因水稻中基本上都含有T-DNA插入。實施例5、啟動子轉基因陽性植株的⑶S活性鑒定轉基因植株的根、葉片、莖及花等組織浸于⑶S染色液中，37°C，過夜。第二天，70-75%乙醇脫色，將組織中的葉綠素脫掉。然后，在解剖顯微鏡下觀察并記錄GUS染色的結果。水稻⑶S染色液的組分為Na2HP04/NaH2P04(lM, pH7. 0)5ml;X-GlucIOOmg ；Triton X-1000.5ml;甲醇IOml ；滅菌水余量；總體積100ml。報告基因⑶S染色的結果圖2顯示的是啟動子轉基因水稻中各不同組織⑶S報告基因染色的結果。A，水稻幼穗中的⑶S染色。幼穗長約7mm，水稻穎花長約1mm。此時，穎殼是透明的，無染色；僅花藥特異染色陽性。說明啟動子調控基因在花藥中特異表達。B，水稻穎花中的GUS染色。穎花長約3. 78mm，此時，穎殼無染色；花藥特異染色陽性。C，與圖B為同一階段，本發明人將穎花的兩片穎殼(內穎與外穎)剝開來，箭頭所指的為特異染成藍色的花藥組織。D，水稻穎花中的GUS染色，穎花長約6. 53mm。穎殼無染色；雌蕊的柱頭及子房無染色；雄蕊的花藥特異染成藍色。啟動子調控基因在花藥中特異表達。E，開花后的穎花，穎花長約6. 58mm。穎殼無染色，花藥特異染色藍色。F，與圖E為同一階段，將穎花的兩片穎殼剝掉，顯示雄蕊及雌蕊的染色。雌蕊的柱頭無染色，在花柱的起始位置及子房的基部有淡的染色；花藥染色為很強的陽性。G，與圖E為同一階段，放大的花藥部分，顯示花藥為強的陽性。H，與圖E為同一階段，花粉染色為陽性。A-H顯示的是穎花的GUS染色，在穎花發育的不同階段(lmm-7mm)，均為花藥特異表達。I，根的⑶S染色為陰性。J，葉片的⑶S染色為陰性。K，葉鞘、葉舌、葉耳的⑶S染色為陰性。L，莖的⑶S染色。節間的⑶S染色為陰性，節的⑶S染色為很淡的陽性。a，anther， 花藥；s, stigma,柱頭；o, ovary,子房。結論oSigCfa001gl2基因的啟動子連接⑶S報告基因，轉化水稻，通過轉基因植株中⑶S報告基因的組化染色鑒定，證明OSigCfa001gl2的啟動子調控基因在水稻穎花雄蕊的花藥組織中特異高表達，在穎殼，雌蕊中不表達。在根、葉片、葉鞘中均不表達。在莖的節間中不表達，但是在莖的節中僅有很弱的表達?；ㄋ幍那衅ㄋ幥衅Y果見圖3，其中藍色表明GUS染色為陽性。圖A結果表明，⑶S在花藥的絨粘層細胞中特異表達，在穎殼中不表達。A，anther， 花藥；T，Tapetum，絨粘層；L，Lemma，穎殼。圖B，放大的花藥部分，顯示⑶S在絨粘層中特異表達。E，印idermis，表皮；MC，meiotic cell，減數分裂的細胞。在水稻的葉片、葉鞘、莖、穗中的定量的結果也證實，GUS基因特異性地在穗中特異高表達，見圖4。實施例6、啟動子保留功能的變體研究如前所述，本發明的啟動子區序列如SEQ ID NO :1中第1_521位所示，而SEQ ID NO 1中第1-552位所示的序列也具有啟動子的作用。經鑒定，位于SEQID NO 1中第 436-442位的TATA念(TATAAAT)、第146-153位的CAAT盒(CCAATGCA)為啟動子發揮功能的關鍵位點(引發轉錄的必要位點及轉錄起始點)。在osigcfa001gl2基因的啟動子區，除了TATA盒(TATAAAT)及CAAT盒(CCAATGCA) 夕卜，本發明人還找到了 :E-盒，序列為5，-CATTTG-3，(SEQ ID NO 1中第278-283位)。E-盒是脂轉運蛋白(Lipid transfer protein)基因家族的啟動子區的順式調控組件，為轉錄因子結合位點，提示其是調控花藥特異表達的關鍵位點。此外，CAAACAC序列是脂轉運蛋白基因家族的啟動子區的順式調控組件，是影響啟動子強度的關鍵位點。因此，基上述關鍵位點，本發明人進行了啟動子變體研究。Ml 本發明人制備了基于SEQ ID NO 1中第1_552位所示序列的啟動子，其中5，端減少22個堿基(Ml)。基于關鍵位點的分析，TATA盒，CAAT盒，E-盒和CAAACAC序列這些作為保守性的位點保持不變。序列如下(單下劃線為用于擴增的引物序列)
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸(a)位于osigcfa001gl2基因的5，端及其上游；(b)堿基長度為200-2000個；(c)具有引發轉錄的必要位點及轉錄起始點；且(d)具有在植物花藥中特異表達功能。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是(1)SEQID NO 1中第1-521位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(2)SEQ ID NO 1中第1_552位所示的核苷酸序列的多核苷酸；(3)(1)或( 任一限定的多核苷酸，其中第1-22位堿基缺失；(4)由SEQID NO :1中(1_22) (521-552)位所示的核苷酸序列構成的多核苷酸；(5)核苷酸序列在嚴格條件下能夠與(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列雜交且具有指導目的基因在植物花藥中特異表達功能的多核苷酸；(6)核苷酸序列與(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列有80%以上同源性且具有指導目的基因在植物花藥中特異表達功能的多核苷酸；或(7)核苷酸序列與(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列完全互補的多核苷酸。
3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是基于SEQ ID NO 1中第1-521位或SEQ ID NO 1中第1-552位所示核苷酸序列，第 436-442位、第146-153位、第278483、第305-311位和/或第觀7_312位核苷酸序列不變， 其它位點與(1)- )任一限定的多核苷酸序列具有50%以上相同性的，且具有指導目的基因在植物花藥中特異表達功能的多核苷酸。
4.如權利要求2或3所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是基于SEQID NO :1中第1-521位或SEQ ID NO 1中第1-552位所示核苷酸序列，第99-104位、第115-120 位和/或第131-138位核苷酸序列不變，其它位點與(1)-(4)任一限定的多核苷酸序列具有50%以上相同性的，且具有指導目的基因在植物花藥中特異表達功能的多核苷酸。
5.權利要求1-4任一所述的多核苷酸的用途，用于指導目的基因在植物花藥中特異表達。
6.一種載體，其特征在于，所述的載體含有權利要求1-4任一所述的多核苷酸，作為啟動子元件。
7.如權利要求6所述的載體，其特征在于，所述的載體還含有與所述的多核苷酸操作性連接的目的基因。
8.如權利要求6所述的載體，其特征在于，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游， 且與所述多核苷酸的間隔小于lOOObp。
9.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，所述的細胞 含有權利要求5所述的載體；或其基因組中整合有外源的權利要求1-4任一所述的多核苷酸。
10.一種使目的基因在植物花藥中特異表達的方法，其特征在于，所述的方法包括 將構建物轉化植物細胞，所述的構建物含有權利要求1-4任一所述的多核苷酸以及與所述的多核苷酸操作性連接的目的基因；篩選出轉入了所述構建物或染色體中整合有所述構建物的植物細胞；和將所述植物細胞再生成植株。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述表達載體中含有構建物，所述的構建物含有權利要求1-4任一所述的多核苷酸以及與所述的多核苷酸操作性連接的目的基因；(b)將植物細胞、組織或器官與步驟(a)中的農桿菌接觸，從而使所述的構建物轉入植物細胞。
全文摘要
本發明涉及一種花藥特異表達啟動子及其應用。本發明首次分離到一個可在植物花藥中特異性表達的啟動子。所述的啟動子可指導目的基因在植物花藥中特異性高表達，而在植物的其它組織中低表達或不表達。
文檔編號C12N5/10GK102465128SQ20111036012
公開日2012年5月23日 申請日期2011年11月14日 優先權日2010年11月12日
發明者上官穎穎, 嚴怡雯, 劉曉輝, 朱靜潔, 陸婷婷, 陸怡祺, 韓斌 申請人:中國科學院上海生命科學研究院