專利名稱：一種能抑制乙型腦炎病毒復制與感染的shRNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種能抑制JEV復制與感染的shRNA及其應用。
背景技術：
乙型腦炎(Japanese encephalitis, JE)是由乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一種嚴重的人畜共患蟲媒病毒性疾病。該病對人類危害巨大，是人類中樞神經系統最常見的蟲媒病之一，廣泛分布于亞洲，特別是遠東一些國家和地區。近年來其流行分布范圍不斷擴大，流行頻率也不斷增強。乙腦病毒屬于黃病毒科黃病毒屬。病毒粒子呈20面體對稱，在核酸外面包有致密的脂蛋白囊膜。JEV基因組為單股正鏈RNA分子，本身具有傳染性。其基因組編碼產物為3 個結構蛋白(C、prM、E)和 7 個非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NSQ。乙腦屬于自然疫源性疾病，蚊蟲是該病的主要傳播媒介。本病的發生與氣候環境有著密切的關系，呈明顯的季節性。我國一般流行高峰在7、8、9三個月。多種動物均可感染本病，感染后成為傳染源。經檢查發現，在流行病區，畜禽的隱性感染率均很高，特別是豬，其次是馬和牛。病毒在感染動物血液內存留時間很短，主要存在于中樞神經系統及腫脹的睪丸內，但豬感染后病毒血癥期維持時間長，血液中病毒滴度高，對乙腦的傳播起重要作用。同時，豬是乙腦傳播給人類最重要的宿主，一般情況下JEV的感染呈豬-蚊-人鏈狀。 豬感染乙腦時間的早晚和感染率的高低與人乙腦的流行密切相關。感染后，人、猴、馬和驢出現明顯的腦炎臨診癥狀，病死率較高。豬群不發生腦炎癥狀，懷孕母豬可表現高熱、流產、 死胎和木乃伊胎，死產胎兒出現腦缺損癥狀，公豬則出現睪丸炎，給養豬業發展帶來巨大的損失。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指雙鏈RNA介導的序列特異的基因沉默現象。RNA干擾現象最初在植物和低等生物中被發現，隨著研究的深入，近來在高等的真核生物中也被發現，并且證明是一種重要的進化保守現象。已證明短的雙股干擾RNA (siRNA)是由dsRNA特異的核酸內切酶，Dicer酶，剪切而來。RNA誘導沉默復合物(RISC)是由siRNA 和一種多酶復合物結合構成，它位于mRNA特定的部位，并且發揮核酸內切酶和外切酶的活性來作用mRNA。除了在轉錄水平的基因沉默(降解mRNA)，siRNA也被證明通過DNA甲基化沉默啟動子而降低蛋白表達。短發卡RNA(shRNA)通常利用載體導入細胞，并且可被傳遞到子代細胞中去，從而使基因沉默可被遺傳。shRNA的發卡結構可被細胞機制切割成siRNA， 然后按上述機制達到降解mRNA的目的。它最大的優點在于具有高度的有效性和特異性并且具有快速的防御與治療效果。它的作用在基因功能研究領域和各種疾病的治療領域尤其是病毒性疾病的治療領域已顯示出不可估量的價值，例如在抗艾滋病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰質炎病毒(Poliovirus)等病毒的研究中都發現 RNAi對于抑制這類病毒的復制效果極好，可能為這類病毒病的治療創立新的，更有效的途徑。毫無疑問，隨著對RNAi機制的深入了解以及技術的進一步完善，RNAi技術必將為生命科學研究和臨床疾病的防治帶來新的革命。乙型腦炎的流行是世界性的公共衛生問題之一。目前對于乙腦尚無特效治療手段，因此預防乙腦的發生尤為重要。而傳統的疫苗生產不能滿足人類日益發展的需要，因而，科研人員不斷地尋求新的治療方式。RNAi這項新興技術即是其中頗有潛力的新途徑。 目前，國內外運用RNAi治療乙腦還處在科研院所的理論研究中，并未大規模地投入到臨床治療中，但其研究結果顯示出卓越的抑制病毒復制與感染的能力，在臨床治療中有著極大的潛力與良好的前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種能快速、特異和顯著抑制JEV在動物細胞與個體中復制和感染的shRNA及其應用。本發明的另一目的是提供含有該shRNA的真核表達質粒及其應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現一種能抑制乙型腦炎病毒復制與感染的shRNA，以乙型腦炎病毒基因組中高度保守的序列SEQ ID NO. 10作為其靶序列，該shRNA的正義鏈模板序列為SEQ ID NO. 3，反義鏈模板序列為SEQ ID NO. 4。一種含所述的shRNA的shRNA真核表達質粒，該shRNA真核表達質粒是將所述的 shRNA的模板與線性化的載體pGPTO/GFP/Neo連接得到針對乙型腦炎病毒E基因mRNA序列的shRNA真核表達質粒。所述的shRNA真核表達質粒在制備抑制乙型腦炎病毒復制和/或感染的藥物中的應用。本發明的有益效果先向動物細胞中轉染本發明的shRNA真核表達質粒，再用病毒攻擊細胞進行一系列試驗(圖4 圖8)，結果表明本發明的shRNA可有效地抑制JEV在細胞上的復制，對細胞有良好的保護作用。先將本發明的shRNA真核表達質粒注入動物體內，再用不同劑量的病毒攻擊動物機體(圖10A、B)；或者將本發明的shRNA真核表達質粒與不同劑量的病毒同時注入動物體內(圖10C、D)，結果表明本發明的shRNA均能有效地降低動物的發病率和死亡率，動物存活率達50%以上，顯著高于無干擾作用組?？梢姡景l明的shRNA真核表達質粒在動物個體水平上既有良好的預防JEV感染的作用也有治療JEV感染的功效。綜上所述，本發明所提供的shRNA以及shRNA真核表達質粒能夠在制備治療和/ 或預防JEV感染的藥物中應用，為治療和預防JEV感染提供一種新的可選藥物。


圖IJEV基因組結構及本發明中所選取的保守區段示意圖。箭頭處為shRNA所選的靶基因位點。圖 2pGPU6/GFP/Neo 載體結構圖。圖3shRNA真核表達質粒的酶切鑒定。M :lamda/Ecol30I ;A1_5和Bl_5分別為 pGP-El 與 pGP-E2BbsI 酶切結果；A，1-5 和 B，1-5 分別為 pGP-El 與 pGP_E2BamHI 酶切結果； C1-5 和 D1-5 分別為 pGP-NS3 與 pGP_NS4b BbsI 酶切結果；C，1-5 和 D，1-5 分別為 pGP_NS3 與pGP-NS4bBamHI酶切結果。圖4 間接免疫熒光結果。A、B、C、D、E、F分別是pGP_E 1、pGP_E2、pGP_NS3、pGP_NS4b、 pGP-NC和Mock組結果。圖5經shRNA作用后的細胞培養液的TCID5tl的測定結果。圖6 流式細胞術結果。A、B、C、D、E、F 分別是 pGP-El、pGP-E2、pGP-NS3、pGP_NS4b、 pGP-NC和Mock組結果。圖7Real time RT-PCR結果。mRNA的相對表達量是指經過shRNA干擾作用后JEV 的目的基因3’段非編碼區的表達量與陰性對照組目的基因表達量的比值。圖 8Western blotting 結果。泳道 1 6 分別為 pGP-El、pGP_E2、pGP_NS3、 pGP-NS4b、pGP-NC 和 Mock 組結果。圖9 免疫組化結果。A、B、C、D、E、F 分別是 pGP-El、pGP_E2、pGP_NS3、pGP_NS4b、 Virus control 和 Mock 組結果。圖10動物保護性實驗結果。A、B分別為先注射shRNA真核表達質粒后攻毒20LD5(1 和IOOLD5JEv (NJ2008)組；C、D分別為同時注射shRNA真核表達質粒和20LD5JEV (NJ2008) 組，同時注射shRNA真核表達質粒和IOOLD5JEv (NJ2008)組。
具體實施例方式實施例IshRNA的制備(1)寡核苷酸的設計與合成以JEV的E、NS3、NS4b基因mRNA序列為靶序列(圖1)，利用Ambion公司的siRNA 設計軟件，通過同源分析，分別針對JEV基因的1553 1571bp(El)、1679 1697bp(E2)、 6083 610Ibp (NS3)和 7；350 7368bp (NS4b)設計合成 4 對 shRNA 寡核苷酸鏈。其 loop 結構選用了 TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉錄終止序列采用T6結構。正義鏈模板的5’端添加了 CACC，與m^sl酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5’端添加了 GATC，與BamHI酶切后形成的粘端互補；如果shRNA的靶序列第一個堿基不是G，則在其模板鏈的CACC后補加一個G。所設計的四個shRNA的模板鏈序列如下shRNA_El 正義鏈模板SEQID N0. 1，反義鏈模板SEQ ID N0. 2 ； shRNA-E2 正義鏈模板SEQ ID N0. 3，反義鏈模板 SEQID N0. 4 ； shRNA-NS3 正義鏈模板 SEQ ID N0. 5，反義鏈模板 SEQ ID N0. 6 ； shRNA_NS4b 正義鏈模板SEQ ID N0. 7，反義鏈模板SEQ ID N0. 8。上述序列合成委托上海吉瑪制藥技術有限公司進行。(2) shRNA模板的退火將shRNA模板單鏈分別用TE (pH8. 0)溶解，濃度為100 μ Μ。取相應的正義鏈模板和反義鏈模板溶液，按照表1配比配置退火反應體系。表 權利要求
1.一種能抑制乙型腦炎病毒復制與感染的ShRNA，其特征在于以乙型腦炎病毒基因組中高度保守的序列SEQ ID NO. 10作為其靶序列，該shRNA的正義鏈模板序列為SEQ ID NO. 3，反義鏈模板序列為SEQ ID NO. 4。
2.一種含權利要求1所述的shRNA的shRNA真核表達質粒，其特征在于該shRNA真核表達質粒是將權利要求1所述的能抑制乙型腦炎病毒復制與感染的shRNA的模板與線性化的載體pGPTO/GFP/Neo連接得到針對乙型腦炎病毒E基因mRNA序列的shRNA真核表達質粒。
3.權利要求2所述的shRNA真核表達質粒在制備抑制乙型腦炎病毒復制和/或感染的藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域，公開了一種能抑制乙型腦炎病毒復制與感染的shRNA及其應用。該shRNA以乙型腦炎病毒基因組中高度保守的序列作為其靶序列，所述的靶序列為SEQ ID NO.10。該shRNA真核表達質粒是將所述的shRNA的模板與線性化的載體pGPU6/GFP/Neo連接得到分別針對乙型腦炎病毒E基因mRNA序列的shRNA真核表達質粒。本發明所提供的shRNA真核表達質粒能夠在制備治療和/或預防JEV感染的藥物中應用，為治療和預防JEV感染提供一種新的可選藥物。
文檔編號C12N15/113GK102382831SQ20111035981
公開日2012年3月21日 申請日期2010年10月14日 優先權日2010年10月14日
發明者劉珂, 周斌, 曹瑞兵, 沈婷, 陳溥言 申請人:南京農業大學