專利名稱：一種抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修飾的方法及產(chǎn)物和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于食品領域，涉及蛋白的物性修飾，特別涉及一種新型的抑制蛋白聚集的方法，以及這些修飾蛋白在食品領域的應用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)廣泛存在于動植物中，其具有的營養(yǎng)特性和功能特性(乳化性、起泡性、持水性等)使其在食品工業(yè)以及醫(yī)藥保健、飼料行業(yè)均得到了廣泛的應用，其不僅對食品在制造、加工或保藏中的物理化學性質(zhì)起著重要的作用，還可以有效的提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。 但天然植物蛋白具有高疏水性，在某些食品體系中的應用受到限制，因而需要對蛋白進行物性修飾來提高其功能特性，擴大其應用領域。在食品和醫(yī)藥領域，已經(jīng)對蛋白質(zhì)聚集和影響蛋白質(zhì)聚集的因素有了廣泛的研究，如高溫(熱處理)、高鹽或低酸等因素常常誘發(fā)蛋白質(zhì)聚集。這是因為蛋白分子的一些反應基團在水溶液中由于分子內(nèi)作用力以及疏水相互作用被包埋于結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，而熱處理能使其從分子內(nèi)部轉(zhuǎn)移到分子表面，從而因疏水相互作用等誘發(fā)蛋白聚集。但是熱處理又是蛋白制品加工過程中不可避免的單元操作，如熱殺菌、噴霧干燥等。因此目前如何控制蛋白質(zhì)在熱處理過程中或高鹽、低酸性條件下的聚集行為成為蛋白質(zhì)領域的研究難點。近幾年有文獻報道蛋白質(zhì)的聚集和許多有害基因疾病的關系，說明探討蛋白質(zhì)聚集行為的控制不僅在食品領域，在生物醫(yī)藥領域同樣具有非常重要的理論和實際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種新型的抑制蛋白在水溶液中聚集的方法，同時得到一種功能性良好的蛋白物性修飾產(chǎn)物，使其兼具蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和糖的穩(wěn)定作用，以作為食品添加劑應用于食品生產(chǎn)中。本發(fā)明模擬生命科學領域的大分子擁擠體系，將多糖和蛋白質(zhì)處于加入高分子惰性擁擠試劑聚乙二醇的大分子擁擠環(huán)境中，體系中的擁擠試劑為多糖和惰性高聚物聚乙二醇，蛋白能夠處于少聚集的反應狀態(tài)，同時對蛋白進行物性修飾，以改善蛋白功能特性，擴大其應用范圍。該法具有操作方便、性能穩(wěn)定等優(yōu)點，方法具有良好的工業(yè)化、規(guī)模化的應用前景及有利于食品及醫(yī)用放大生產(chǎn)，其對于擴展蛋白的應用空間具有相當重要的實際意義。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修飾的方法，包括以下步驟(1)將蛋白用緩沖液溶解，蛋白的質(zhì)量份數(shù)為1 10份，緩沖溶液是pH6. 0 8. 0 的0. OlM 0. 2M的任意緩沖鹽體系；(2)將大分子擁擠試劑加入步驟(1)的溶液中混勻，在60 95°C的恒溫磁力攪拌器中攪拌4 30h后，冰浴迅速冷卻至室溫；所述大分子擁擠試劑為包括多糖和惰性擁擠試劑聚乙二醇在內(nèi)的大分子物質(zhì)的混合物；
(3)將步驟(2)得到的產(chǎn)物離心，除去不溶物；(4)將步驟C3)得到的產(chǎn)物透析以除去惰性擁擠試劑聚乙二醇及其它小分子物質(zhì)，得到少聚集的蛋白物性修飾產(chǎn)物。優(yōu)選地，步驟( 所述大分子擁擠試劑的總質(zhì)量份數(shù)為10 40份，多糖與聚乙二醇的質(zhì)量比為1 1 1 3。優(yōu)選地，步驟(1)所述蛋白為大豆7S球蛋白、大豆分離蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或牛血清白蛋白BSA。優(yōu)選地，步驟( 所述多糖為葡聚糖、卡拉膠、瓜爾豆膠和可溶性淀粉中的一種或一種以上。優(yōu)選地，步驟⑵所述惰性擁擠試劑聚乙二醇為PEG2000、PEG3000、PEG3350或 PEG4000。優(yōu)選地，步驟(3)所述離心速度為3000 5000rpm，離心時間為20 30min。優(yōu)選地，步驟(4)所述透析溫度為4°C，時間為M 48h。本發(fā)明所述的方法來抑制蛋白質(zhì)的聚集，同時對蛋白質(zhì)進行物性修飾。所述的蛋白產(chǎn)物明顯抑制了蛋白宏觀聚集體的形成，是一種有效的蛋白質(zhì)去聚集方法，且產(chǎn)物水溶性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)有很大的提高。能用于制備改性蛋白、食品添加劑或醫(yī)藥行業(yè)中，尤其是產(chǎn)物經(jīng)純化后作為可溶性的蛋白添加劑應用于酸性運動型飲料中或者作為新型乳化劑應用于肉制品中。本發(fā)明原理如下本發(fā)明采用“大分子擁擠環(huán)境”作為生成蛋白物性修飾產(chǎn)物的反應體系，通過將生命科學領域中擁擠理論對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的科學現(xiàn)象進一步應用于修飾蛋白的制備，當體系中存在有高濃度的生物大分子時，大分子之間的反應遵循分子排斥容積理論，促進反應向溶質(zhì)總體積減小的方向，即朝結(jié)合方向移動；另外，大分子擁擠環(huán)境下蛋白分子構(gòu)型趨于穩(wěn)定，蛋白變性程度以及聚合程度將會減輕。大分子擁擠環(huán)境能夠使蛋白分子在水溶液中處于非聚集或者較少聚集的反應狀態(tài)。本發(fā)明將蛋白、多糖和聚乙二醇置于大分子擁擠環(huán)境中，多糖既充當了大分子擁擠試劑，又能與蛋白發(fā)生糖基化反應，形成共價結(jié)合的大分子復合物，其既保留了蛋白質(zhì)的表面活性又具有多糖的親水性能。同時惰性擁擠試劑聚乙二醇的加入能進一步有效促進反應的進行及抑制蛋白聚集。糖基化對于蛋白質(zhì)聚集的調(diào)節(jié)作用直接與肽鏈的折疊和聚集的動態(tài)區(qū)間有關，通過共價鍵結(jié)合到蛋白質(zhì)肽鏈上的糖鏈能夠影響蛋白質(zhì)的聚集行為，而這可以用來解釋糖基化對于蛋白質(zhì)聚集行為的調(diào)節(jié)作用，一方面，通過糖基化降低蛋白質(zhì)表面疏水性而抑制了蛋白質(zhì)的聚集行為，另一方面，糖鏈共價連接到蛋白質(zhì)分子上減少了蛋白質(zhì)正電荷的數(shù)量導致蛋白質(zhì)電荷發(fā)生變化，從而改變了分子之間的靜電排斥作用，最終影響了蛋白質(zhì)的聚集行為。因此，本發(fā)明想通過糖基化及大分子擁擠環(huán)境共同作用控制蛋白質(zhì)聚集行為。在蛋白質(zhì)聚集過程中，濁度和粒度是常用來表征蛋白聚集程度的重要指標。因此在反應過程中選用濁度和粒度作為檢測指標。濁度反映了溶液中不同懸浮粒子的大小及數(shù)量，蛋白質(zhì)聚集至一定程度，溶液中顆粒直徑變大，溶液濁度升高，也稱為宏觀聚集體。粒徑分布采用馬爾文納米粒度分布儀來研究，利用動態(tài)光散射技術(shù)研究溶液中聚集體粒子的粒徑分布。方法為將糖基化產(chǎn)物溶于緩沖液中，于MOnm處測定濁度，另取上述溶液用粒度分布儀測定粒徑分布。并對蛋白的溶解性、乳化性、起泡性、熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)進行測定，以反映蛋白功能特性的顯著改善。本發(fā)明具有如下的優(yōu)點及有益效果(1)在大分子擁擠環(huán)境下進行蛋白與多糖的共價接枝，不僅有利于共價接枝的進行，而且用大分子擁擠環(huán)境及糖基化兩個方面共同作用來抑制蛋白質(zhì)的聚集行為，為一種全新的抑制蛋白質(zhì)聚集的方法。(2)本發(fā)明有效解決了食品加工過程中熱處理導致的蛋白質(zhì)聚集行為，且能在高鹽、低酸等食品加工過程中常遇到的極端條件下應用，并對蛋白進行有效的物性修飾，從而擴展了蛋白質(zhì)在食品中的應用范圍。(3)本發(fā)明具有工業(yè)化、規(guī)模化的應用前景，亦能有效應用于生物醫(yī)藥領域。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1準確稱取0. 5g大豆7S球蛋白，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩沖溶液，稱取1. 5g葡聚糖和1. 5g聚乙二醇(PEG3000)加入到緩沖液中混勻，于恒溫磁力攪拌器中在95°C反應6h，反應結(jié)束后迅速冰浴冷卻至室溫(25°C )終止反應，產(chǎn)物5000rpm離心 20min，于4°C透析48h以除去惰性擁擠試劑聚乙二醇及其它小分子物質(zhì)。將產(chǎn)物冷凍干燥， 得到蛋白的物性修飾產(chǎn)物。對比實施例1準確稱取0. 5g大豆7S球蛋白，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩沖溶液，稱取1. 5g葡聚糖加入到緩沖液中混勻，于恒溫磁力攪拌器中在95°C反應6h，反應結(jié)束后迅速冰浴冷卻至室溫(25°C )終止反應，產(chǎn)物5000rpm離心20min，于4°C透析48h以除去惰性擁擠試劑聚乙二醇及其它小分子物質(zhì)。將產(chǎn)物冷凍干燥，得到糖基化的蛋白產(chǎn)物。采用濁度表征蛋白的聚集程度，采用乳化性來標準蛋白的功能特性。實施例1和對比實施例1蛋白的聚集情況及乳化性對比結(jié)果如表1所示表 1
實施例1對比實施例1蛋白物性修飾產(chǎn)物糖基化蛋白濁度(nm)0. 0210. 048乳化性(m2/g)6542 從表1可以看出，本發(fā)明實施例1中以聚乙二醇作為惰性大分子擁擠試劑所得蛋白物性修飾產(chǎn)物濁度較低，且蛋白的乳化性更好。說明在惰性擁擠試劑聚乙二醇存在的大分子擁擠環(huán)境下對蛋白進行改性，能有效的抑制蛋白在水溶液中的聚集，并顯著改善蛋白的乳化性能。
實施例2準確稱取0. Ig大豆7S球蛋白，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6的磷酸鈉緩沖溶液， 稱取0. 5g葡聚糖和1.5g聚乙二醇(PEG2000)加入到緩沖液中混勻，于恒溫磁力攪拌器中在80°C反應10h，反應結(jié)束后迅速冰浴冷卻至室溫(25°C )終止反應，產(chǎn)物4000rpm離心 30min，于4°C透析24h以除去惰性擁擠試劑聚乙二醇及其它小分子物質(zhì)。將產(chǎn)物冷凍干燥， 得到蛋白的物性修飾產(chǎn)物。對比實施例2準確稱取0. Ig大豆7S球蛋白，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6的磷酸鈉緩沖溶液， 稱取0. 5g葡聚糖加入到緩沖液中混勻，于恒溫磁力攪拌器中在80°C反應10h，反應結(jié)束后迅速冰浴冷卻至室溫(25°C )終止反應，產(chǎn)物4000rpm離心30min，于4°C透析Mh以除去惰性擁擠試劑聚乙二醇及其它小分子物質(zhì)。將產(chǎn)物冷凍干燥，得到糖基化的蛋白產(chǎn)物。表權(quán)利要求
1.一種抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修飾的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將蛋白用緩沖液溶解，蛋白的質(zhì)量份數(shù)為1 10份，緩沖溶液是PH6.0 8.0的 0. OlM- 0. 2M的任意緩沖鹽體系；(2)將大分子擁擠試劑加入步驟(1)的溶液中混勻，在60 95°C的恒溫磁力攪拌器中攪拌4 30h后，冰浴迅速冷卻至室溫；所述大分子擁擠試劑為包括多糖和惰性擁擠試劑聚乙二醇在內(nèi)的大分子物質(zhì)的混合物；(3)將步驟(2)得到的產(chǎn)物離心，除去不溶物；(4)將步驟C3)得到的產(chǎn)物透析后，得到少聚集的蛋白物性修飾產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟( 所述大分子擁擠試劑的總質(zhì)量份數(shù)為10 40份，多糖與聚乙二醇的質(zhì)量比為1 1 1 3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述蛋白為大豆7S球蛋白、 大豆分離蛋白、乳清蛋白、β -乳球蛋白或牛血清白蛋白BSA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟( 所述多糖為葡聚糖、卡拉膠、瓜爾豆膠和可溶性淀粉中的一種或一種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟( 所述惰性擁擠試劑聚乙二醇為 PEG2000、PEG3000、PEG3350 或 PEG4000。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述離心速度為3000 5000rpm，離心時間為20 30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述透析溫度為4°C，時間為 24 她。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1 7任一項所述的方法制備的少聚集的蛋白物性修飾產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述蛋白物性修飾產(chǎn)物的應用，其特征在于，所述產(chǎn)物經(jīng)純化后作為可溶性的蛋白添加劑應用于酸性運動型飲料中或者作為新型乳化劑應用于肉制品中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修飾的方法及產(chǎn)物和應用，包括以下步驟(1)將蛋白用緩沖液溶解，蛋白的質(zhì)量份數(shù)為1～10份，緩沖溶液是pH 6.0～8.0的0.01M～0.2M的任意緩沖鹽體系；(2)將大分子擁擠試劑加入步驟(1)的溶液中混勻，在60～95℃的恒溫磁力攪拌器中攪拌4～30h后，冰浴迅速冷卻至室溫；(3)將產(chǎn)物離心，除去不溶物；(4)將步驟(3)得到的產(chǎn)物透析后，得到少聚集的蛋白物性修飾產(chǎn)物。本發(fā)明方法簡單且易于操作，產(chǎn)物在抑制蛋白聚集的同時，蛋白水溶性、乳化性、起泡性、熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)有很大的提高，能用于制備改性蛋白、食品添加劑或醫(yī)藥行業(yè)中。
文檔編號A23J3/00GK102499320SQ20111036107
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者張曦, 楊曉泉, 齊軍茹 申請人:華南理工大學