專利名稱：新型脂肪酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型脂肪酶。本脂肪酶由Tetrasphaera屬的新株的菌體產(chǎn)生。本脂肪酶可將中鏈脂肪酸及/或長鏈脂肪酸作為底物識別。本脂肪酶可通過陰離子交換樹脂、 疏水性樹脂吸附固定，可作為固定化酶使用。本脂肪酶在消化藥、芳香劑制造、臨床檢驗試劑、洗滌劑用酶、油脂制造、農(nóng)藥·醫(yī)藥品的光學(xué)活性中間體制造等領(lǐng)域中有利用價值。
背景技術(shù)：
已證明脂肪酶是在各種酯的合成和分解、酯交換、外消旋體的光學(xué)拆分時優(yōu)異的生物催化劑，實際上已在消化藥、芳香劑制造、臨床檢驗試劑、洗滌劑用酶、油脂制造、農(nóng)藥·醫(yī)藥品的光學(xué)活性中間體制造上使用。脂肪酶中眾所周知的是動物的胰脂肪酶，而工業(yè)上經(jīng)常使用的是主要來自微生物的脂肪酶。這些脂肪酶的大多數(shù)的基因已被克隆，氨基酸序列也已知(Candida rugosa 非專利文獻(xiàn)1。Rhizopus delemar 非專利文獻(xiàn)2。Bacillus subtilis 非專利文獻(xiàn)3。 Staphylococcus aureus 專禾文■ 4。 Pseudomonas aeruginosa 專禾文■ 5)。絲狀菌、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Mapylococcus)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)等產(chǎn)生的脂肪酶已在工業(yè)上使用。這些脂肪酶基本上以高級脂肪酸(碳數(shù)為16以上的脂肪酸)作為底物，以短鏈脂肪酸(碳數(shù)6以下)作為底物的是酯酶。可充分識別中鏈脂肪酸，不僅顯示水解活性，還顯示酯化活性的脂肪酶還不為人所知。中鏈脂肪酸結(jié)合的甘油三酯不僅被胰脂肪酶水解，還被胃脂肪酶水解，在甘油三酯的消化·吸收上也顯示優(yōu)勢(非專利文獻(xiàn)6)。且中鏈脂肪酸被吸收后，在小腸的腸道細(xì)胞中很少再合成甘油三酯，而是從門靜脈運送到肝臟，作為能量燃燒。另一方面，高級脂肪酸在腸道細(xì)胞中再合成，由淋巴吸收運送到肝臟，有時作為脂肪積累。即，高級脂肪酸有體內(nèi)積累性，中鏈脂肪酸無積累性。這樣，通過中鏈脂肪酸甘油三酯和通常的食用油脂之間的酯交換來制造有益于健康的油旨。非專利文獻(xiàn)1 Kawaguchi et al.，Nature，341，164-166 (1989)非專利文獻(xiàn)2 Haas et al.，Gene，109，107-113 (1991)非專利文獻(xiàn)3 Dartois et al.，B. B. A.，1131，253-260 (1992)非專利文獻(xiàn)4 Lee et al.，J. Bacteriol.，164，288-293 (1985)非專利文獻(xiàn)5 Wohlfarth et al. , J. General Microbiology, 138,1325-1335, (1992)非專利文獻(xiàn)6 I. Ikeda, Y. Tomari,M. Sugano, S. ffatanabe, and J. Nagata :Lipids, 26,369-373(1991)

發(fā)明內(nèi)容
但是，至今為止在工業(yè)上用脂肪酶還未制造出非甘油三酯的中鏈脂肪酸酯。因中鏈脂肪酸無脂肪積累性，所以，用中鏈脂肪酸酯化的食品材料成為不易產(chǎn)生肥胖等問題的材料。本發(fā)明者對脂肪酶進(jìn)行了銳意研究，且從Tetrasphaera屬新株的菌體培養(yǎng)上清中分離·精制出分子量約為32kDa及約為40kDa的新型脂肪酶，且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這些脂肪酶是以中鏈脂肪酸作為底物充分識別的新型物質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。I.新型脂肪酶本發(fā)明提供如下多核苷酸，其是編碼屬于Tetrasphaera屬(優(yōu)選與"Tetrasphaera屬NITE P-IM菌株屬于同種，更優(yōu)選為Tetrasphaera屬NITEP-IM菌株)的菌產(chǎn)生的、分子量約為32kDa的脂肪酶的多核苷酸或其同源物，即含有下述(A1)、(B1)、(C1)、(D1)、(E1)、(F1)或(G1)的多核苷酸(A1)多核苷酸，其由序列號10中記載的堿基序列的全部或至少包含25 801位的堿基序列的部分組成；(B1)多核苷酸，其與(A1)中記載的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(C1)多核苷酸，其由(A1)中記載的多核苷酸的堿基序列中1個或多個堿基發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的堿基序列組成，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(D1)多核苷酸，其與(A1)中記載的多核苷酸的堿基序列有至少80%以上的同一性，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(E1)多核苷酸，其編碼由序列號11中記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(F1)多核苷酸，其編碼由序列號11中記載的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(G1)多核苷酸，其編碼由與序列號11中記載的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)。序列號10表示編碼iTetrasphaera屬NITE P-154菌株產(chǎn)生的分子量約為32kDa的脂肪酶的多核苷酸的堿基序列，序列號11表示同一脂肪酶的氨基酸序列。且序列號15表示含有編碼同一脂肪酶的多核苷酸的基因組DNA的堿基序列，序列號16表示包含序列號11的上游序列的氨基酸序列。本說明書中，序列號10中“25 801位的堿基序列”，除特殊情況外，可與序列號15中“388 1164位的堿基序列”互換，本說明書中，“序列號11的氨基酸序列”，除特殊情況夕卜，可與“序列號16的48 306位的氨基酸序列”互換。本發(fā)明中，由序列號10中記載的至少包含25 801位的堿基序列的部分組成的多核苷酸，可用由序列號15的堿基序列中至少包含388 1164位的堿基序列的部分組成的多核苷酸(例如，由序列號15的堿基序列的247 1167位的堿基序列組成的部分組成的多核苷酸)代替；且由序列號11中記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(或編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸)，可用序列號16的氨基酸序列的全部或一部分組成的蛋白質(zhì)(優(yōu)選32 306位的氨基酸序列，更優(yōu)選48 306位的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì))所組成的蛋白質(zhì)(或編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸)代替。此種情況也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。序列號16的第1 47位的氨基酸序列可認(rèn)為是前原序列。推測第1 31位作為分泌信號即前序列起作用，第32 47位是在分泌后，大概是通過其它蛋白質(zhì)的作用被切斷的原序列。因此，為作為脂肪酶起作用，必須的成熟蛋白質(zhì)應(yīng)是第48位以后的序列，在大腸桿菌等異種表達(dá)系統(tǒng)中使同一脂肪酶表達(dá)時，除去前原序列使其表達(dá)更為適合。編碼本發(fā)明的分子量約為32kDa的脂肪酶的多核苷酸或其同源物的優(yōu)選例如下·多核苷酸，其是下述(A/ )、(B/ )、(C/ )、(D1，)、(E1，)、(F/ )或(G1，)，(A/ )多核苷酸，其是序列號10中記載的堿基序列的全部或25 801位的堿基序列組成的部分；(B/ )多核苷酸，其與(A/ )中記載的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(C/ )多核苷酸，其由(A/ )中記載的多核苷酸的堿基序列中1個或多個堿基發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的堿基序列組成，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(D/ )多核苷酸，其與(A/ )中記載的多核苷酸的堿基序列有至少80%以上的同一性，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(E/ )多核苷酸，其編碼由序列號11中記載的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(F/)多核苷酸，其編碼由序列號11中記載的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(G/ )多核苷酸，其編碼由與序列號11中記載的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)。·多核苷酸，其含有下述(A2)、(B2)、(C2)、(D2)、(E2)、(F2)或(G2)(A2)多核苷酸，其由序列號15中記載的堿基序列的全部或至少包含247 1167位的堿基序列或388 1164位的堿基序列的部分組成；(B2)多核苷酸，其與(A2)中記載的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(C2)多核苷酸，其由(A2)中記載的多核苷酸的堿基序列中1個或多個堿基發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的堿基序列組成，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(D2)多核苷酸，其與(A2)中記載的多核苷酸的堿基序列有至少80%以上的同一性，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(E2)多核苷酸，其編碼由序列號16中記載的氨基酸序列的全部或至少包含48 306位的氨基酸序列的部分組成的蛋白質(zhì)；(F2)多核苷酸，其編碼由(E2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(G2)多核苷酸，其編碼由與(E2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)。·多核苷酸，其是下述(A/ )、(B2' )、(C2，)、(D2，)、(E2' )、(F2，)或(G2')(A2')多核苷酸，其是序列號15中記載的堿基序列的全部或247 1167位的堿基序列或388 1164位的堿基序列組成的部分。(B2')多核苷酸，其與(A2’ )中記載的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；
(C2')多核苷酸，其由(A2’ )中記載的多核苷酸的堿基序列中1個或多個堿基發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的堿基序列組成，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(D2’ )多核苷酸，其與(A2，)中記載的多核苷酸的堿基序列有至少80%以上的同一性，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(E2’ )多核苷酸，其編碼序列號16中記載的氨基酸序列的全部或至少包含48 306位的氨基酸序列的部分組成的蛋白質(zhì)；(F2')多核苷酸，其編碼由(E2’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(G2')多核苷酸，其編碼由與(E2’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供如下多核苷酸，其是編碼屬于Tetrasphaera屬(優(yōu)選與Tetrasphaera屬NITE P-154菌株屬于同種,更優(yōu)選Tetrasphaera屬NITEP-154菌株)的菌產(chǎn)生的、分子量約為40kDa的脂肪酶的基因或其同源物，即含有下述(H2)、(I2)、(J2)、(K2)、(L2)、(M2)或(N2)的多核苷酸(H2)多核苷酸，其由序列號28中記載的堿基序列的全部或至少包含414 1688位的堿基序列或498 1685位的堿基序列的部分組成；(I2)多核苷酸，其與(H2)中記載的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(J2)多核苷酸，其由(H2)中記載的多核苷酸的堿基序列中1個或多個堿基發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的堿基序列組成，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(K2)多核苷酸，其與(H2)中記載的多核苷酸的堿基序列有至少80%以上的同一性，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(L2)多核苷酸，其編碼由序列號29中記載的氨基酸序列的全部或至少包含四 4M位的氨基酸序列的部分組成的蛋白質(zhì)；(M2)多核苷酸，其編碼由(L2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(N2)多核苷酸，其編碼由與(L2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)。序列號J8表示編碼iTetrasphaera屬NITE P-154菌株產(chǎn)生的分子量約為40kDa的脂肪酶的基因的堿基序列，序列號 表示同一脂肪酶的氨基酸序列。編碼本發(fā)明的分子量約為40kDa的脂肪酶的多核苷酸或其同源物的優(yōu)選例如下·多核苷酸，其是下述(H2，)、(I/ )、(J2，)、OV )、(V )、(M2，)或(N2，)(H2')多核苷酸，其是由序列號28中記載的堿基序列的全部或414 1688位的堿基序列或498 1685位的堿基序列組成的部分；(I2')多核苷酸，其與(H/ )中記載的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(J2')多核苷酸，其由(H/ )中記載的多核苷酸的堿基序列中1個或多個堿基發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的堿基序列組成，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(K2')多核苷酸，其與(H/ )中記載的多核苷酸的堿基序列有至少80%以上的同一性，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(L2')多核苷酸，其編碼的是序列號29中記載的氨基酸序列的全部或四 4 位的氨基酸序列組成的部分的蛋白質(zhì)；(M2')多核苷酸，其編碼由(L2’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(N2')多核苷酸，其編碼由與(L2’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)。本說明書所述的“脂肪酶”，除特殊情況外，指水解甘油酯，使脂肪酸游離的酶。本說明書中，稱某種蛋白質(zhì)“具有脂肪酶活性”時(或稱為“脂肪酶”時)，除特殊情況外，該蛋白質(zhì)(或脂肪酶)至少具有水解甘油和脂肪酸形成的酯的活性，優(yōu)選具有水解與中鏈脂肪酸形成的酯及/或與長鏈脂肪酸形成的酯的活性，更優(yōu)選具有與中鏈脂肪酸形成的酯及與長鏈脂肪酸形成的酯的活性。具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)(或脂肪酶)優(yōu)選具有催化脂肪酸的轉(zhuǎn)移反應(yīng)(酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng))的活性，優(yōu)選具有催化中鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的活性。某種蛋白質(zhì)是否具有水解甘油與中鏈脂肪酸或長鏈脂肪酸形成的酯的活性，例如，可通過供給測定如本說明書實施例中所述的4-甲基傘形酮辛酯(MU-C8)或4-甲基傘形酮基油酸酯(MU-C18)的分解活性的試驗來進(jìn)行評價。且某種蛋白質(zhì)是否具有催化中鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的活性，例如，可通過供給如本說明書實施例中所述的3-苯基-1-丙醇或1-苯基-2-丙醇與三辛酸甘油酯(MCT)的酯化反應(yīng)實驗來進(jìn)行評價。本說明書中，除特殊情況外，某種蛋白質(zhì)(或脂肪酶)具有水解某種脂肪酸的酯的活性時或具有催化某種脂肪酸的轉(zhuǎn)移反應(yīng)的活性時，也將其脂肪酸稱為“可作為底物識別”。證實了本發(fā)明的屬于iTetrasphaera屬(優(yōu)選與iTetrasphaera屬NITEP-1M菌株屬于同種，更優(yōu)選ktrasphaera屬NITE P-IM菌株)的菌產(chǎn)生的、分子量約為32kDa的蛋白質(zhì)及分子量約為40kDa的蛋白質(zhì)，至少具有4-甲基傘形酮辛酯(MU-C8)的分解活性，后者進(jìn)一步具有4-甲基傘形酮基油酸酯(MU-C18)的分解活性，且可由三辛酸甘油酯及3-苯基-1-丙醇或1-苯基-2-丙醇分別生成正辛酸酯(參照實施例1)。因此，兩者均可具有脂肪酶活性，更加詳細(xì)地說，可以說前者具有水解與中鏈脂肪酸形成的酯的活性(可將中鏈脂肪酸作為底物識別)，后者具有水解與中鏈脂肪酸及長鏈脂肪酸形成的酯的活性(可將中鏈脂肪酸及長鏈脂肪酸作為底物識別)，且具有催化中鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)移反應(yīng)(特別是酯化反應(yīng))的活性。本說明書中的“中鏈脂肪酸”，除特殊情況外，指碳數(shù)為7 15的飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。中鏈脂肪酸中包含正辛酸、癸酸及十二烷酸。本說明書中的“長鏈脂肪酸”，除特殊情況外，指碳數(shù)為16以上的飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸。長鏈脂肪酸中包含棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚烯酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸及Y-亞麻酸。本說明書中涉及甘油和脂肪酸，為“酯”時，除特殊情況外，不只是三酰甘油，還可以是二酰甘油或單酰甘油(有時也將后二者合起來稱為部分酰基甘油。本發(fā)明中所述的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”，除特殊情況外，指6Μ尿素、0.4%SDS、0.5XSSC的條件或與其同等的雜交條件，且根據(jù)需要，本發(fā)明中也可適用嚴(yán)謹(jǐn)性更高的條件，例如6M尿素、0.4% SDS,0. IXSSC或與其同等的雜交條件。在各種條件中，溫度可約為40°C以上，如需要嚴(yán)謹(jǐn)性更高的條件時，例如可約為50°C，進(jìn)一步可約為65°C。且本發(fā)明中，進(jìn)行“1個或多個堿基發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的堿基序列”時的取代等的核苷酸的個數(shù)，只要其堿基序列組成的多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)具有所需功能，無特別限定，可以是1 9個或1 4個的程度，如是編碼同一或性質(zhì)相似的氨基酸序列的取代等，也可有更多個數(shù)的取代等。且本發(fā)明中，進(jìn)行“1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列”時被取代等的氨基酸的個數(shù)，只要具有該氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有所需功能，無特別限定，可為1 9個或1 4個的程度，如是對性質(zhì)相似的氨基酸取代等，也可有更多個數(shù)的取代等。用于制備與此種堿基序列或氨基酸序列有關(guān)的多核苷酸的方法，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。對于堿基序列，高的同一性是指至少50%以上、優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上的序列同一性。對于氨基酸序列，高的同一性是指至少50%以上、優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上的序列同一性。序列號11中記載的氨基酸序列與公知脂肪酶的氨基酸序列之間的同一性，如實施例的表4所示。此外，序列號28中記載的氨基酸序列與公知序列之間的同一性，如實施例8所述。對于多核苷酸序列或氨基酸序列同一性的檢索·分析，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的算法或程序(例如，BLASTN、BLASTP, BLASTX, Clustalff)進(jìn)行。使用程序時的參數(shù)，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員均可適當(dāng)設(shè)定，也可使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。這些分析方法的具體方法，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。本說明書中表示蛋白質(zhì)或脂肪酶的分子量時，除特殊情況外，為使用SDS-PAGE確定的值(參照實施例1、圖2)。本發(fā)明的多核苷酸，可從天然物中使用雜交技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)等獲得。具體地說，從屬于iTetrasphaera屬(優(yōu)選與iTetrasphaera屬NITE P-154菌株屬于同種，更優(yōu)選iTetrasphaera屬NITE P-1M菌株)的菌中，通過常法[例如，DNeasy TissueKit(QIAGEN)]制備基因組DNA(gDNA)，或從同一菌體中通過常法[例如，RNeasy Plantisolation Kit(QIAGEN)]制備全RNA，且以全RNA為模板，通過常法[例如，SuperScriptII Reverse Transcriptase (Invitrogen)]進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(1st strand cDNA合成)來制備。為獲得目的多核苷酸，以32kDa脂肪酶蛋白質(zhì)的N-末端序列為基礎(chǔ)，設(shè)計5’端的引物。進(jìn)一步以與上述N末端氨基酸殘基顯示同一性的來自比較近緣的鏈霉菌屬(Streptomyces)菌等的推測蛋白質(zhì)的保守序列為基礎(chǔ)，設(shè)計3’端的引物。將lip32基因片段以#375株cDNA為模板，通過使用上述引物組(Primer Set)的簡并PCR進(jìn)行擴(kuò)增，確定部分堿基序列。進(jìn)一步用適合的限制酶酶切后，以環(huán)化#375株gDNA為模板，通過使用了在同序列上外向設(shè)計的引物的反向PCR，獲得旁側(cè)區(qū)域的堿基序列信息。這樣，確定了共計約900bp的lip32區(qū)域gDNA的堿基序列。本發(fā)明的多核苷酸中包含DNA，DNA中包含基因組DNA、cDNA及化學(xué)合成DNA。DNA可以是單鏈DNA及雙鏈DNA。本發(fā)明的多核苷酸的優(yōu)選例為來自Tetrasphaera屬的多核苷酸。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的多核苷酸的重組載體、通過其重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體(例如轉(zhuǎn)化大腸桿菌、轉(zhuǎn)化酵母、轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞)。本發(fā)明還進(jìn)一步提供包括使用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主(例如大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞)的工序(例如，通過本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化的工序)的轉(zhuǎn)化方法。插入本發(fā)明的多核苷酸的載體，只要可使在宿主內(nèi)的插入物表達(dá)無特別限制，載體通常具有啟動子序列、終止子序列、用于通過外界刺激誘導(dǎo)性地使插入物表達(dá)的序列、通過用于插入靶基因的限制酶識別的序列、及編碼用于選擇轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記的序列。重組載體的制備、通過重組載體的轉(zhuǎn)化方法，可適用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法。本發(fā)明還提供如下蛋白質(zhì)，其為屬于Tetrasphaera屬(優(yōu)選與"Tetrasphaera屬NITE P-IM菌株屬于同種，更優(yōu)選Tetrasphaera屬NITEP-IM菌株)的菌產(chǎn)生的分子量約為32kDa的脂肪酶或其同源物，即含有下述(θι)、(f\)或(gl)的蛋白質(zhì)(θι)蛋白質(zhì)，其由序列號11中記載的氨基酸序列組成；(f,)蛋白質(zhì)，其由序列號11中記載的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性；(gl)蛋白質(zhì)，其由與序列號11中記載的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性。本發(fā)明的分子量約為32kDa的脂肪酶或其同源物的優(yōu)選例為下述蛋白質(zhì)·蛋白質(zhì)，其是下述(e/ )、(f/ )或(g/ )(e/ )蛋白質(zhì)，其由序列號11中記載的氨基酸序列組成；(f/ )蛋白質(zhì)，其由序列號11中記載的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性；(g/ )蛋白質(zhì)，其由與序列號11中記載的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性。·蛋白質(zhì)，其含有下述(e2)、(f2)或(g2)(e2)蛋白質(zhì)，其由序列號16中記載的氨基酸序列的全部或至少包含48 306位的氨基酸序列的部分組成；(f2)蛋白質(zhì)，其由(e2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性；(g2)蛋白質(zhì)，其由與(e2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性。·蛋白質(zhì)，其為下述( ，)、(f2，)或(g2')(e2')蛋白質(zhì)，其為序列號16中記載的氨基酸序列的全部或48 306位的氨基酸序列組成的部分；(f2’ )蛋白質(zhì)，其由(e2’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性；(g2’ )蛋白質(zhì)，其由與(e2’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性。
此分子量約為32kDa的脂肪酶可將中鏈脂肪酸作為底物識別，如實施例11中所示的條件中，最適溫度約為40°C，最適pH值為7. 0左右。本發(fā)明還提供如下蛋白質(zhì)，其為屬于Tetrasphaera屬(優(yōu)選與"Tetrasphaera屬NITE P-IM菌株屬于同種，更優(yōu)選Tetrasphaera屬NITEP-IM菌株)的菌產(chǎn)生的分子量約為40kDa的脂肪酶或其同源物，即含有下述(I1)、(Hi1)或(Ii1)的蛋白質(zhì)。(I1)蛋白質(zhì)，其由序列號35中記載的氨基酸序列組成；(Hi1)蛋白質(zhì)，其由序列號35中記載的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性；(H1)蛋白質(zhì)，其由與序列號35中記載的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性。序列號35及圖16中，表示Tetrasphaera屬NITE菌株產(chǎn)生的分子量約為40kDa的脂肪酶的、成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列。本發(fā)明的分子量約為40kDa的脂肪酶或其同源物的優(yōu)選例，如下述蛋白質(zhì)·蛋白質(zhì)，其是上述(I1)、(Hi1)或(Ii1)。·蛋白質(zhì)，其含有下述(I2)、(m2)或(n2)(I2)蛋白質(zhì)，其由序列號29中記載的氨基酸序列的全部或至少包含四 4 位的氨基酸序列的部分組成；(m2)蛋白質(zhì)，其由(I2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性；(n2)蛋白質(zhì)，其由與(I2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性。·蛋白質(zhì)，其是下述(12，)、(m2，)或(n2’)，(I2')蛋白質(zhì)，其由序列號29中記載的氨基酸序列的全部或四 4 位的氨基酸序列組成的部分組成；(m2’ )蛋白質(zhì)，其由(12’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性；(n2’ )蛋白質(zhì)，其由與(12’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少80%以上同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性。此分子量約為40kDa的脂肪酶可將中鏈脂肪酸及長鏈脂肪酸作為底物識別，實施例11所示條件中，最適溫度約為45 50°C，最適PH值為7. 0左右。上述蛋白質(zhì)或脂肪酶，可從將屬于Tetrasphaera屬(優(yōu)選與Tetrasphaera屬NITE P-154菌株屬于同種，更優(yōu)選Tetrasphaera屬NITE P-154菌株)的菌用市售培養(yǎng)基[例如，使用Marine broth 2216 (Difco公司制)。Marine broth是液體培養(yǎng)基，其特征在于約含有2%食鹽]培養(yǎng)后獲得的培養(yǎng)上清中分離·精制。具體如下所示。首先接種菌液，使菌液相對于培養(yǎng)基為0. 1 5%，10 40°C下培養(yǎng)2日 10日。使用經(jīng)含有氯化鈣及氯化鎂的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液平衡后的疏水性凝膠(例如(t-S^)harose)0. 01 1份，將培養(yǎng)上清用于柱色譜法。用上述緩沖液液洗滌后，通過用含有非離子表面活性劑[例如，曲拉通X-100 (TritonX-IOO)]的上述緩沖液液洗脫，可獲得具有脂肪酶活性的組分。將本脂肪酶組分用10份上述緩沖液液稀釋后，吸附于0. 001 1份陰離子交換凝膠(例如，Q-Sepharose)上，用含有0. 1%的兩性表面活性劑(例如，3-[(3_膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)；3-[ (3-Cholamidop ropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS))的上述緩沖液洗滌后，用氯化鈉水溶液的濃度梯度洗脫，獲得脂肪酶活性組分。將本脂肪酶組分使用陰離子交換柱(例如HiTrapQ)進(jìn)行高效液相色譜法(HPLC)，通過氯化鈉水溶液進(jìn)行濃度梯度洗脫，獲得可確認(rèn)出具有脂肪酶活性且分子量約為32kDa或約為40kDa的蛋白質(zhì)的存在的組分。更具體的方法，可參照本說明書的實施例1。上述的蛋白質(zhì)或脂肪酶，可通過用插入了本發(fā)明的多核苷酸的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體(例如，轉(zhuǎn)化大腸桿菌)，獲得重組蛋白質(zhì)。具體如下所示。首先，用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的基因的堿基序列，通過使用適合的引物組(Primer kt)的PCR進(jìn)行擴(kuò)增，克隆后，通過測序確認(rèn)堿基序列。克隆后的DNA片段，通過適合的限制酶酶切提取后，整合進(jìn)蛋白質(zhì)的大腸桿菌表達(dá)用載體中，使用此載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，使蛋白質(zhì)表達(dá)。破碎表達(dá)靶基因的大腸桿菌，將上清用色譜柱精制，獲得約32kDa或約40kDa的目標(biāo)蛋白質(zhì)。更具體的方法可參照本說明書的實施例3或8。本發(fā)明還可提供如下脂肪酶，其為屬于Tetrasphaera屬(優(yōu)選與"Tetrasphaera屬NITE P-IM菌株屬于同種，更優(yōu)選Tetrasphaera屬NITE P-IM菌株)的菌產(chǎn)生的、可將中鏈脂肪酸及長鏈脂肪酸作為底物識別的、分子量約為40kDa的脂肪酶、或可通過包含下述工序的制造方法分離的分子量約為40kDa的脂肪酶。將屬于Tetrasphaera屬的菌的培養(yǎng)上清液加入到疏水性樹脂色譜柱，將疏水性樹脂吸附物用含有非離子表面活性劑的緩沖液洗脫；將洗脫物加入到陰離子交換樹脂中，將陰離子交換樹脂吸附物用0. 5M NaCl溶液洗脫；將洗脫物透析后加入到陰離子交換柱，用NaCl梯度溶劑洗脫。該制造方法更詳細(xì)地說包括下述1) 幻的工序1)將屬于 Tetrasphaera 屬(優(yōu)選與 Tetrasphaera 屬 NITE P-154 菌株屬于同種，更優(yōu)選Tetrasphaera屬NITE P-IM菌株)的菌的培養(yǎng)上清液加入到疏水性樹脂色譜柱，根據(jù)需要，將疏水性樹脂吸附物用含有0.5%非離子表面活性劑[例如，曲拉通X-IOO(TritonX-IOO)]的緩沖液等洗滌后，用含有1 %曲拉通X-100 (TritonX-IOO)的緩沖液洗脫，2)將洗脫物加入到陰離子交換樹脂中，根據(jù)需要，將陰離子交換樹脂吸附物用含有0. 兩性表面活性劑(例如，3-[(3_膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)；3- [ (3-Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS))的緩沖液等洗滌后，用0. 5M NaCl溶液洗脫，3)將洗脫物透析后加入到陰離子交換柱，用NaCl梯度溶劑洗脫。例如，將洗脫物透析后加入到Iml容量的陰離子交換柱，用0 0. 75M NaCl梯度溶劑洗脫，每0. 5ml收集一次洗脫物。上述40kDa的脂肪酶，按照與已敘述的32kDa的脂肪酶相同的方法，可從將屬于iTetrasphaera屬(優(yōu)選與iTetrasphaera屬N ITE P-1M菌株屬于同種，更優(yōu)選Tetrasphaera屬NITE P-1M菌株)的菌用市售培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得的培養(yǎng)上清中分離 精制(參照實施例1)。上述40kDa的脂肪酶的優(yōu)選例，其氨基酸序列為序列號3及/或序列號14中記載的氨基酸序列，更特定地說，為具有序列號3及序列號14中記載的氨基酸序列的氨基酸序列。通過使用本發(fā)明及由本說明書提供的信息，例如，通過使用上述40kDa的脂肪酶的全部或一部分、序列號3或序列號14中記載的氨基酸序列、或?qū)儆赥etrasphaera屬的(優(yōu)選與1Tetrasphaera 屬 NITE P-1M 菌株屬于同種，更優(yōu)選 iTetrasphaera 屬 NITE P-154菌株)菌、從該菌中獲得的基因組DNA，另外適當(dāng)?shù)脑掃€可通過適用本說明書中公開的針對32kDa脂肪酶的各種方法，獲得編碼40kDa脂肪酶的多核苷酸的序列信息及編碼40kDa脂肪酶的多核苷酸。更具體地說，將從屬于iTetrasphaera屬(優(yōu)選與Tetrasphaera屬N ITEP-IM菌株屬于同種，更優(yōu)選Tetrasphaera屬NITE P-IM菌株)的菌中獲得的基因組DNA用適合的限制酶完全酶切，與對應(yīng)限制酶的接頭(Cassette)連接，制備模板DNA。另一方面，利用由40kDa的脂肪酶的一部分獲得的氨基酸序列信息(例如，為N末端氨基酸序列的序列號3，為內(nèi)部氨基酸序列的序列號14)，設(shè)計適合的引物。使用此引物和接頭引物(Cassette Primer)進(jìn)行PCR，獲得40kD脂肪酶基因的周邊基因組DNA序列。從所得到的堿基序列等中可推測出編碼40kDa脂肪酶的基因的0RF。在推測ORF的擴(kuò)增、克隆、堿基序列的確認(rèn)、經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)功能的確認(rèn)中，可適用本說明書中記載的、與32kDa的脂肪酶以相同目的使用的方法。即本發(fā)明還以使用序列號3或序列號14中記載的氨基酸序列、上述40kDa的脂肪酶的全部或一部分(即脂肪酶自身或其片段)、或?qū)儆赥etrasphaera屬(優(yōu)選與iTetrasphaera 屬 NITE P-154 菌株屬于同種，更優(yōu)選 iTetrasphaera 屬 NITE P-154 菌株)的菌為特征，提供編碼該脂肪酶的多核苷酸堿基序列信息的生產(chǎn)方法。II. Tetrasphaera M N ITE P-154 菌株本發(fā)明還提供可產(chǎn)生本發(fā)明的脂肪酶的"Tetrasphaera屬NITE P-154菌株。Tetrasphaera屬NITE P-154菌株，從株式會社海洋生物技術(shù)研究所擁有的新型海洋性微生物文庫中，使用含有中鏈脂肪酸油脂(MCT)的瓊脂板，通過是否形成抑菌圈來蹄選。[iTetrasphaera 屬 NITE P-1M 菌株的菌學(xué)性質(zhì)]Tetrasphaera sp. NITE P-1M株(本說明書中有時表示為“#375”。)在形態(tài)上為球菌(0. 86X0.86 μ m)，無運動性。生理學(xué)上為革蘭氏陽性，生育溫度范圍為15 45°C，作為碳源可使用D-果糖、D-葡萄糖、D-甘露糖醇、棉子糖及蔗糖，不能使用L-阿拉伯糖、肌醇、L-鼠李糖及D-木糖。化學(xué)分類上異戊二烯醌是MK-8 (H4)，DNA的堿基組成為70. 5%。表 1a.形態(tài)特性1)細(xì)胞的形狀及大小2)有無運動性b.培養(yǎng)特性1) ISP培養(yǎng)基No. 2平板培養(yǎng)2) ISP培養(yǎng)基No. 4平板培養(yǎng)球菌、0. 86X0. 86 μ m無形成圓形、半球狀、全緣、有光澤的白色菌落形成圓形、半球狀、全緣、有光澤的白色菌落
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3) ISP培養(yǎng)基No. 5平板培養(yǎng)生育不良，但形成白色菌落4) ISP培養(yǎng)基No. 6平板培養(yǎng)形成圓形、半球狀、全緣、有光澤帶有黃色的白色菌落5) ISP培養(yǎng)基No. 7平板培養(yǎng)生育不良，但形成白色菌落6)Marine Agar瓊脂平板培養(yǎng)形成圓形、半球狀、全緣、有光澤的白色菌落c.生理學(xué)特性1)革蘭氏染色陽性2)生育溫度范圍15-45度3)堿性磷酸酶活性陰性4)酯酶(C4)活件陽性5)酯酶脂肪酶(C8)活性陽性6)脂肪酶(C4)活性陽性7)亮氨酸芳香基酰胺酶活性陽性8)纈氨酸芳香基酰胺酶活性陽性9)胱氨酸芳香基酰胺酶活性陰性10)胰蛋白酶活性陰性11)糜蛋白酶活性陰性12)酸性磷酸酶活性陽性13)萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性陽性14) α-半乳糖苷酶活性陰性15) β -半乳糖苷酶活性陽性16) β -葡糖醛酸苷酶活性 陰性17) α -葡萄糖苷酶活性陽性18) β -葡萄糖苷酶活性陽性19) N-乙酰-β-葡萄糖胺酶活性陰性20) α -甘露糖苷酶活性陰性21) α-巖藻糖苷酶活性陰性22)碳源的利用性L-阿拉伯糖-D-果糖+D-葡萄糖+肌醇-D-甘露醇+L-鼠李糖-棉子糖+蔗糖+D-木塘-使用BiOLOG SFP2 酶標(biāo)板。d.化學(xué)分類學(xué)特性
1)異戊二烯醌MK_8(H4)2) DNA 的堿基組成70. 5%用marine broth 2216 (Difco 公司制)培養(yǎng) iTetrasphaera 屬 NITE P-154 菌株時，將本發(fā)明的脂肪酶分泌到菌體外。本發(fā)明還提供如下菌株或其突變體，其為與Tetrasphaera屬NITE P-1M菌株具有同樣菌學(xué)性質(zhì)的菌株或其突變體、及具有由與Tetrasphaera屬NITE P-154菌株的16SrRNA基因(序列號1)有高度同一性(例如，具有高于98%的同一性、優(yōu)選98. 5%同一，進(jìn)一步優(yōu)選99%同一，進(jìn)一步優(yōu)選99. 5%同一)的堿基序列組成的16S rRNA基因的菌株或其突變體。且根據(jù)本發(fā)明者的研究，與公知的菌最接近的是98%。本發(fā)明的菌株及其突變體的菌株，可用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)及脂肪酶的制造。本發(fā)明還提供由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。


圖 1 表示 iTetrasphaera sp. NITE P_154(#375)的 16S rRNA 基因的堿基序列。圖2表示HPLC分離后各組分的SDS-PAGE的照片。棚表示分子量標(biāo)記，21 35表示組分#21 35泳動的泳道。圖3表示鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)菌推測分泌蛋白質(zhì)與來自龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)的⑶SL-脂肪酶的比對結(jié)果。#375株產(chǎn)生的32kDa蛋白質(zhì)的N-末端15個氨基酸殘基與比較近緣的鏈霉菌屬(Sti^ptomyces)菌的推測分泌蛋白質(zhì)顯示出高度同一性，此鏈霉菌屬(Streptomyces)菌推測分泌蛋白質(zhì)，與包括來自龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)的⑶SL-脂肪酶在內(nèi)的一些脂肪酶等的氨基酸序列有同一性。圖4表示與推測的編碼32kDa蛋白質(zhì)的基因(lip32基因)堿基序列對應(yīng)的氨基酸序列。lip32基因至少由777bp構(gòu)成，編碼由259個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。圖5表示LIP32蛋白質(zhì)表達(dá)載體(pET22b::lip32Nc)的構(gòu)成。圖6表示色譜柱精制后LIP32蛋白質(zhì)的SDS-PAGE照片。M表示標(biāo)記，2表示組分#2、3表示組分#3泳動的泳道。圖7表示色譜柱精制后LIP32蛋白質(zhì)通過Bradford法得到的結(jié)果。圖8表示包含編碼LIP32的基因的基因組DNA的堿基序列和LIP32的氨基酸序列。網(wǎng)線部表示與精制LIP32的N末端氨基酸序列一致的序列。圖 9 表示 LIP32 的推測前序列及原序列、和 pETLIP32-F、pETLIP32_M、pETLIP32_S載體。圖10表示包含編碼LIP40的基因的基因組DNA的堿基序列和LIP40的氨基酸序列。下線部表示分泌信號序列，網(wǎng)線部表示與精制LIP40的部分氨基酸序列一致的序列。雙重下線部為脂肪酶的保守區(qū)域。圖11表示LIP40蛋白質(zhì)表達(dá)載體(pETLIP40HP)的構(gòu)成。圖12表示LIP32PH及LIP40HP的最適溫度。圖13 表示 LIP32PH 及 LIP40HP 的最適 pH 值。圖14表示使用固定化的LIP40HP或?qū)φ?pET22b)進(jìn)行向蝦青素的脂肪酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)時反應(yīng)液的HPLC分析圖。
圖15表示使用LIP40HP或?qū)φ?pET22b)進(jìn)行向兒茶素的脂肪酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)時反應(yīng)液的HPLC分析圖。圖16表示LIP40成熟蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
具體實施例方式本發(fā)明的32kDa或40kDa的脂肪酶，可固定在適合的載體上，作為固定化酶使用。載體中，以同樣目的使用的以往的樹脂，可將例如堿性樹脂[例如，MARATHON WBA陶氏化學(xué)公司(Dow Chemical Company)、三菱化學(xué)的SA系列、WA系列或FP系列的樹脂及ORGANO公司Amber Light的IRA系列]、疏水性樹脂[例如，F(xiàn)PHA(Diaion、三菱化學(xué)公司制)、三菱化學(xué)的HP系列、ORGANO公司的Amber Light XAD7等作為載體使用。向載體的固定化方法也可適用以同樣目的使用的以往技術(shù)。例如，相對于1份上述的樹脂載體，加入10份#375的培養(yǎng)上清，可直接進(jìn)行減壓干燥，也可使其吸附后，除去上清后干燥。經(jīng)固定的脂肪酶在工業(yè)上很有利用價值。即將固定化酶充填入色譜柱，在其色譜柱中可進(jìn)行原料流通的連續(xù)反應(yīng)。此外也可容易地從反應(yīng)液中除去固定化酶，還可進(jìn)行再利用。本發(fā)明的脂肪酶或固定化脂肪酶，可在中鏈脂肪酸及/或長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)移反應(yīng)中、及中鏈脂肪酸酯及/或長鏈脂肪酸酯的制造中使用。酯中包含蝦青素等的類胡蘿卜素(由胡蘿卜素類和葉黃素類組成。)與脂肪酸形成的酯、及兒茶素等的多酚與脂肪酸形成的酯。本說明書中的“轉(zhuǎn)移反應(yīng)”，除特殊情況外，為酯化反應(yīng)或酯交換反應(yīng)。轉(zhuǎn)移反應(yīng)用于制造各種脂肪酸酯。例如在甘油三酯間的酯交換、固醇酯的制造、脂肪酸甲酯制造等的工業(yè)化實施中，如使用以往的脂肪酶一樣，此種情況下也可使用本發(fā)明的脂肪酶。可通過本發(fā)明的脂肪酶制造的酯中，作為特別有用的例子，可列舉固醇酯(例如，β -谷留醇辛酸酯)、蝦青素辛酸酯、兒茶素辛酸酯等。本發(fā)明還提供由本發(fā)明首次提供的與序列號1、序列號3、序列號14、序列號10、序列號11、序列號15、序列號16、序列號28及序列號 有關(guān)的序列信息及其一部分、以及其利用方法。實施例以下通過實施例，進(jìn)一步具體說明本發(fā)明。但本發(fā)明不限于下述實施例。[實施例1]從#375株培養(yǎng)上清中的脂肪酶蛋白質(zhì)的分離 精制和N末端15個殘基的序列確定在Marine broth 2216(Difco公司制)液體培養(yǎng)基中接種1% #375株，25°C下振蕩培養(yǎng)4日。對于培養(yǎng)上清液200ml，吸附于用緩沖液A:50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(pH8. O)/^· CaCl2/2mM MgCl2 平衡的疏水樹脂Phenyl Sepharose CL4B (AmershamBiosciences公司制)2ml上，用于柱色譜法。用緩沖液A洗滌后，用IOml含有0. 5%曲拉通X-100 (TritonX-100)的緩沖液A洗滌除去脂肪酶蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。其次，通過用IOml含有曲拉通X-100 (TritonX-100)的緩沖液A洗脫，獲得脂肪酶活性組分。在本脂肪酶組分(IOml)中添加10倍量的緩沖液A稀釋后，吸附于陰離子交換樹月旨Q-kpharose (Amersham Biosciences 公司制)0. 4ml 上，用含有 0. CHAPS 的緩沖液 A充分洗滌，從表面活性劑曲拉通X-100 (TritonX-IOO)置換為CHAPS后，用0. 5M進(jìn)一步用IMNaCl進(jìn)行分步洗脫。將證實了脂肪酶活性的0. 5M NaCl洗脫組分(^il)用含有0. 1 % CHAPS的緩沖液A充分透析后，使用陰離子交換柱=Hi1TrapQ (Amersham Biosciences公司制)1ml，通過HPLC進(jìn)行0 — 0. 75MNaCl梯度洗脫。每0. 5ml收集一次組分，分別進(jìn)行脂肪酶活性、及通過SDS-PAGE的條帶的檢測。表2表示脂肪酶活性及轉(zhuǎn)移活性，圖2表示SDS-PAGE結(jié)果。脂肪酶活性，按照實施例3中詳細(xì)敘述的使用MU-C8的方法，使用底物MU-C8或MU-C18測定。單位用Unit[l Unit(IMU)是IL樣品在Imin內(nèi)水解Iymol的MU而游離的活性]表示。轉(zhuǎn)移活性如下測定。在3-苯基-1-丙醇(10 μ 1)或1-苯基-2-丙醇(10 μ 1)和三辛酸甘油酯(150 μ 1)的混合液中添加酶溶液( οομ 1)，45°C下劇烈攪拌3日使其反應(yīng)。離心分離反應(yīng)液，回收上層50 μ 1，加入乙腈50 μ 1，取10 μ 1用HPLC分析。分析條件為色譜柱使用 Develosil C30-UG-5 (4. 6x150mm) (Nomura chemical，Aichi，Japan)，移動層使用90%乙腈0. 08% TFA，流速為Iml/分，溫度為室溫。用各種辛酸酯的生成率表示。表2表2.脂肪酶活件
權(quán)利要求
1.多核苷酸，其由下述(H2)、(I2)、(J2)、(K2)、(L2)、(M2)或(N2)組成(H2)多核苷酸，其由序列號28中記載的堿基序列的全部或至少包含414 1688位的堿基序列或498 1685位的堿基序列的部分組成；(I2)多核苷酸，其與由Ol2)中記載的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)，此時嚴(yán)謹(jǐn)條件為6M尿素、0.4% SDS,0. 1XSSC、以及 650C ；(J2)多核苷酸，其由(H2)中記載的多核苷酸的堿基序列中1 9個堿基發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的堿基序列組成，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(K2)多核苷酸，其與(H2)中記載的多核苷酸的堿基序列有至少95%的同一性，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(L2)多核苷酸，其編碼由序列號29中記載的氨基酸序列的全部或至少包含四 4M 位的氨基酸序列的部分組成的蛋白質(zhì)；(M2)多核苷酸，其編碼由(L2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1 9個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(N2)多核苷酸，其編碼由與(L2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1中所述的多核苷酸，其是下述(H2')、(V )、α，)、(K2' )、(L2' )、(M2，) 或汎，)(H/ )多核苷酸，其是序列號28中記載的堿基序列的全部或414 1688位的堿基序列或498 1685位的堿基序列組成的部分；(12’)多核苷酸，其與由(H/)中記載的多核苷酸堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)，此時嚴(yán)謹(jǐn)條件為6Μ尿素、0.4% SDS,0. 1XSSC、以及 650C ；(J2')多核苷酸，其由(H2’ )中記載的多核苷酸的堿基序列中1 9個堿基發(fā)生取代、 缺失、插入及/或附加的堿基序列組成，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(K2')多核苷酸，其與(H2’)中記載的多核苷酸的堿基序列有至少95%的同一性，且編碼具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(L2')多核苷酸，其編碼的是序列號29中記載的氨基酸序列的全部或四 4Μ位的氨基酸序列組成的部分的蛋白質(zhì)；(M2')多核苷酸，其編碼由(L2’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1 9個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)；(N2')多核苷酸，其編碼由與(L2’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2中所述的多核苷酸，其來自Tetrasphaera屬。
4.載體，其包含權(quán)利要求1或2中所述的多核苷酸。
5.轉(zhuǎn)化體，其通過權(quán)利要求4中所述的載體轉(zhuǎn)化。
6.蛋白質(zhì)，其由下述(I2)、(m2)或(n2)組成(I2)蛋白質(zhì)，其由序列號29中記載的氨基酸序列的全部或至少包含四 4 位的氨基酸序列的部分組成；(Hi2)蛋白質(zhì)，其由(I2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1 9個氨基酸發(fā)生取代、缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性；(n2)蛋白質(zhì)，其由與(I2)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性。
7.權(quán)利要求6中所述的蛋白質(zhì)，其是下述(12，)、(m2，)或(n2’)(12’ )蛋白質(zhì)，其是序列號29中記載的氨基酸序列的全部或四 似4位的氨基酸序列組成的部分；(m2’)蛋白質(zhì)，其由(12’)中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中1 9個氨基酸發(fā)生取代、 缺失、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性；(n2’ )蛋白質(zhì)，其由與(12’ )中記載的蛋白質(zhì)的氨基酸序列有至少95%同一性的氨基酸序列組成，且具有脂肪酶活性。
8.權(quán)利要求6或7所述的蛋白質(zhì)，其被固定于樹脂上。
9.中鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)移方法，其特征在于，使用權(quán)利要求6或7所述的蛋白質(zhì)。
10.中鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)移方法，其特征在于，使用權(quán)利要求8中所述的蛋白質(zhì)。
11.中鏈脂肪酸酯的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求6或7所述的蛋白質(zhì)。
12.中鏈脂肪酸酯的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求8中所述的蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求11中所述的制造方法，其是多酚與中鏈脂肪酸形成的酯、或類胡蘿卜素與中鏈脂肪酸形成的酯的制造方法。
14.權(quán)利要求12中所述的制造方法，其是多酚與中鏈脂肪酸形成的酯、或類胡蘿卜素與中鏈脂肪酸形成的酯的制造方法。
全文摘要
本發(fā)明提供Tetrasphaera屬菌產(chǎn)生的、分子量約為32kDa的新型脂肪酶、編碼該酶的基因。此脂肪酶可將中鏈脂肪酸作為底物識別。本發(fā)明還提供編碼屬于Tetrasphaera屬的菌產(chǎn)生的、可將中鏈脂肪酸及長鏈脂肪酸作為底物識別、分子量約為40kDa的新型脂肪酶、編碼該酶的多核苷酸。本發(fā)明還進(jìn)一步提供Tetrasphaera屬NITE P-154菌株。本發(fā)明的脂肪酶可作為固定化酶使用，在消化藥、芳香劑制造、臨床檢驗試劑、洗滌劑用酶、油脂制造、農(nóng)藥·醫(yī)藥品的光學(xué)活性中間體制造等領(lǐng)域中有利用價值。
文檔編號C12N15/63GK102382848SQ201110362579
公開日2012年3月21日 申請日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者中尾正宏, 深見治一, 笠井宏朗, 落合美佐, 金森正樹 申請人:三得利控股株式會社