專利名稱：一種野油菜黃單胞菌必需基因及其編碼的蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種野油菜黃單胞菌必需基因及其編碼的蛋白及應用。
背景技術：
細菌的必需基因(essential gene)是指維持細菌細胞正常生長和繁殖所必需存在的基因。必需基因一般編碼細胞代謝活動和生化過程里的關鍵分子，如核酸、氨基酸、脂肪和細胞壁合成代謝、細胞分裂、物質轉運、基因表達調控中的關鍵蛋白。其突變或失活將直接導致細菌細胞生長停滯或死亡。因此，必需基因也是發展新型抗生素或抑菌化合物的理想藥物作用靶標，可利用其編碼產物的生物學活性或穩定性，對可能的抗菌化合物進行篩選。細菌的雙組分信號轉導系統(two-component signal transduction system)則由組氨酸激酶(histidine kinase)和反應調節蛋白(response regulator)組成，是細菌感應外界環境刺激和調控相應基因表達的主要分子機制。當細菌感受到特定環境刺激時，組氨酸激酶會自磷酸化(autophosphorylation)，隨后將磷酸基團轉移給下游的反應調節蛋白。被磷酸化后的反應調節蛋白發生變構作用，激活其C末端的信號輸出區(往往具有轉錄因子活性)并調控下游基因的表達。必需雙組分信號轉導系統基因曾在多種病原細菌中被發現并應用于抗生素的篩選，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的 yycF-yycG (Fabret C and Hoch JA. 1998. A two-component signal transduction system essential for growth of Bacillus subtilis amplication for anti-infective therapy. Journal of Bacteriology. 180 6375-6383)，以及結核分枝桿菌的mtrA基因(Zahrt T and Deretic V. 2000. An essential two-component signal transduction system in Mycobacterium tuberculosis. Journal of Bacteriology. 182 :3832-3838)。十字花科植物(如甘藍、白菜、芥菜、蘿卜、擬南芥等)黑腐病病原-野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)的核酸序列已由基因組測序項目報道 (Qian W,Jia YT, He YQ et al. 2005. Comparative and functional genomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestris pv. campestris. Genome Research, 15 :757-767.)，盡管該項目對野油菜黃單胞菌中的基因進行了分析，但其具體基因的生物學功能和應用并未由實驗加以證明。

發明內容
本發明是在上述野油菜黃單胞菌基因組測序項目基礎上，利用實驗分析對可能的基因功能基因進行證明獲得的成果，涉及野油菜黃單胞菌必需反應調節基因及其編碼的蛋白，該基因和它編碼的蛋白是野油菜黃單胞菌生長所必需的，因此可以作為篩選預防十字花科植物黑腐病農藥的靶標。本發明的技術方案為一種野油菜黃單胞菌必需基因，具有序列表中SEQ ID No. 1 的DNA序列或者是編碼序列表SEQ ID No. 2的氨基酸序列的多核苷酸。該基因被命名為phoP基因。所述必需基因的檢測方法為1)利用序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4的多核苷酸作為引物，經PCR方法擴增序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列全長片段；2)將擴增出的核苷酸序列克隆到載體上，獲得在嚴謹性啟動子控制下的重組載體；3)將重組載體轉入野油菜黃單胞菌菌株中獲得重組菌株；4)利用重組自殺載體對重組菌株染色體上的必需基因核苷酸序列進行讀框內刪除獲得突變體；4)將該突變體置于培養基中，利用添加的嚴謹性物質作為誘導物，控制突變體中重組必需基因的轉錄水平，檢測該必需基因對野油菜黃單胞菌生長的影響；5)確定該基因是否為必需基因。所述基因的轉錄被控制后，野油菜黃單胞菌的生長受到抑制，說明該基因為野油菜黃單胞菌生長特異性的必需基因。所述重組自殺質粒的制備方法為1)分別用PCR擴增必需基因的上游基因和下游基因，獲得上游基因片段和下游基因片段；2)將上游基因片段和下游基因片段分別克隆到自殺載體中獲得重組自殺載體。本發明還提供一種上述必需基因編碼的蛋白，具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸序列。所述蛋白為野油菜黃單胞菌生長所必需的反應調節蛋白。所述反應調節蛋白的檢測方法為1)將32P標記的醋酸磷酸與野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白混合；2)提取混合物樣品，利用電泳方法分離并進行同位素信號檢測所述蛋白是否被磷酸化。所述反應調節蛋白的另一種檢測方法為1)將α -32P標記的組氨酸激酶與野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白混合；2)提取混合物樣品，利用電泳方法分離并進行同位素信號檢測所述蛋白是否被磷酸化。一種制備上述必需蛋白的方法1)利用序列表中SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10的多核苷酸作為引物，經PCR方法擴增序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列全長片段；2)將擴增出的核苷酸序列連接到載體上，轉化到大腸桿菌菌株上；3)獲得的大腸桿菌菌株進行培養后離心收集裂解后進行親和層析獲得重組蛋白。所述獲得重組蛋白后還可以經電泳分析對蛋白進行純化。本發明還提供一種篩選抗野油菜黃單胞菌物質的方法，以野油菜黃單胞菌中的蛋白或編碼該蛋白的基因作為篩選靶標，所述蛋白具有序列表中的SEQ ID No. 2的氨基酸序列；所述編碼該蛋白的基因具有序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列。該序列的轉錄受到抑制后，會使細菌生長停止和死亡。本發明還提供一種控制野油菜黃單胞菌的方法，以野油菜黃單胞菌中的蛋白或編碼該蛋白的基因作為靶標篩選能控制野油菜黃單胞菌的物質，所述蛋白具有序列表中的 SEQ ID No. 2的氨基酸序列；所述編碼該蛋白的基因具有序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列。所述方法是以控制野油菜黃單胞菌所述基因的轉錄來控制野油菜黃單胞菌的生長。編碼本發明的必需反應調節蛋白的基因phoP不能被普通的、基于同源重組的遺傳學方法所突變。而其近緣細菌水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)中， phoP的直向同源基因已被證明可被遺傳突變(Lee Sff, Jeong KS，Han Sff et a. 2008. The Xanthomonas oryzae pv. oryzae PhoPQ two-component system is required for AvrXA21 activity,hrpG expression,and virulence. Journal of Bacteriology. 190(6) 2183-2197)，已經表明水稻黃單胞菌的phoP不是必需基因，而野油菜黃單胞菌的phoP則是一個經快速進化而產生的細菌物種特異性的必需基因，可以作為該菌理想的、特異性的農藥作用靶標。由于該菌導致的十字花科植物黑腐病是世界上大宗蔬菜生產的重大病害，對該蛋白的研究、開發和應用將會對控制黑腐病發揮獨特的作用。下述的實驗證明了 phoP基因或phoP蛋白是野油菜黃單胞菌物種特異性的生長必需基因。由于只有將該基因克隆到PHM2表達載體并置于阿拉伯糖啟動子控制下，反式提供到野油菜黃單胞菌細胞內后，才能用同源重組的方法對細菌染色體上的PhoP拷貝進行突變和讀框內刪除。并且，利用外源添加阿拉伯糖的方法對phoP進行誘導生長發現，只有當培養基內含有0. 05%的阿拉伯糖誘導其轉錄時，phoP突變體才能正常生長，否則其生長受到很大的抑制。小分子磷酸化實驗和WioQ磷酸轉移酶實驗都證明W10P蛋白確實具有反應調節蛋白活性。因此，野油菜黃單胞菌的PhoP是一個必需的反應調節蛋白基因(essential response regulator gene)，其編碼產物WioP蛋白是一個非常理想的農藥作用靶標。


圖1是重組載體pHM2-pBAD-phoP結構示意圖；圖2是phoP突變體的驗證圖；圖3是醋酸磷酸對WioP蛋白的磷酸化水平示意圖；圖4是組氨酸激酶WioQ對反應調節蛋白WioP的磷酸化示意圖；圖5是阿拉伯糖誘導轉錄對phoP突變體的影響曲線圖。
具體實施例方式實施例1、phoP是細菌必需基因1. phoP嚴謹型表達重組載體的構建由于必需基因的突變會導致細菌細胞死亡，因此，不能簡單地利用基于同源重組的遺傳學方法直接對PhoP基因進行突變和敲除。對其進行突變必須先在細菌細胞中額外提供一個phoP基因的拷貝，并能夠利用嚴謹型調節的啟動子控制該拷貝的轉錄，在此基礎上才能對染色體上的PhoP拷貝進行遺傳學操作。為此，利用引物1 (5 ‘ -GTCGACATGCGTATCCTTTTGGTCGA-3 ‘)和引物 2 (5 ‘ -GGTAC CTCAGCCTTCCGTACGCGGGA-3 ‘)，即序列表中的 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4，通過 PCR 方法擴增野油菜黃單胞菌8004菌株(以下簡稱kc 8004)的phoP基因全長序列(684bp)。擴增條件為 94°C 2min ；94°C 30sec,60°C 60sec,72°C 60sec，沘個循環；72°C 5min。PCR 產物在的瓊脂糖凝膠電泳中分離回收后，克隆到PGEM-T easy載體上(購自Promega公司，美國)并轉化大腸桿菌DH 5α。該重組載體經測序正確后，利用限制性內切酶MlI和 KpnI進行雙酶切，回收插入片段。該插入片段克隆到經MlI和KpnI雙酶切處理的ρΗΜ2載體上，并置于大腸桿菌阿拉伯糖啟動子(pBAD-araC)的控制之下。轉化大腸桿菌DH 5α，在含有150μ g/ml壯觀霉素的LB培養基平板上培養M小時獲得轉化子，其中含有重組載體 pHM2-pBAD-phoP(圖1)。該重組載體可用常規提取質粒的方法進行分離和純化。2.基因敲除重組菌株的構建利用電擊轉化的方法，將重組載體pHM2-pBAD-phoP轉入he 8004野生型菌株感受態細胞，并在含有150 μ g/ml壯觀霉素的NYG培養基平板上，生長2_3天篩選正確的轉化菌株kc 8004-phoP(由于重組載體的轉入，使得該菌株獲得壯觀霉素和鏈霉素的抗性)。該重組菌株(Xcc 8004-phoP)含有2個拷貝的phoP全長基因(分別位于細菌染色體上和重組載體pHM2-pBAD-phoP上)，可作為工程菌，用于下一步敲除染色體上的必需基因 phoP。3. phoP基因的讀框內敲除和驗證由于利用pHM2-pBAD-phoP重組載體額外提供了 1個phoP基因的拷貝，使得利用同源重組雙交換方法對細菌染色體上的PhoP拷貝進行刪除成為可能。為此，利用引物 3(5，-TCTAGATGTTCCGTTTGGCGATAGC-3，)和弓丨物 4(5，-GAATTCTTCTTCGCCGTCCTGTGC-3 ，)，即序列表中的SEQ ID No.，5和SEQ ID No. 6，通過PCR方法擴增phoP基因上游序列 phoP-upstream ；利用引物 5 (5，-GAATTCGTGCTGGAAGTGTTCATCGG_3，)和引物 6 (5，_CTGCAGCG TCAGGTCGCACCACTTC-3，)，即序列表中的 SEQ ID No. 7和 SEQ ID No. 8，擴增phoP基因下游序列 phoP-downstream(擴增條件均為 94°C 2min ；94°C 30sec,60°C 60sec，72°C 60sec,28 個循環；72°C 5min)。將phoP-upstream和phoP-downstream PCR產物片段分別克隆到pGEM T easy載體上，測序正確后，分別用內切酶)(bal，EcoRI和EcoRI，PstI處理，回收插入片段。 并將這兩個插入片段克隆進入經I3StI酶和^CbaI酶處理過的自殺載體pK18mobsacB中，獲得重組自殺載體pK18mobsacB-phoP。利用電擊轉化的方法，將載體pK18mobsacB-phoP轉化進入上述kc 8004-phoP重組菌株。如果發生同源重組，該自殺質粒將在phoP基因區域內整合進入細菌染色體，并使重組細菌獲得抗卡那霉素的能力。利用含有50 μ g/ml卡那霉素的NYG培養基平板篩選發生第一次同源單交換的突變菌株，經Southern blot和PCR驗證正確后，培養并在含有10%蔗糖的NYG培養基上進一步篩選發生第二次同源交換的菌株。 在培養基里含有蔗糖的情況下，由于sacB基因表達的產物會對細菌細胞產生毒害作用。如果發生同源雙交換，則雙交換菌株有可能丟失質粒序列和待刪除序列，能夠恢復對卡那霉素的敏感性且能夠在含蔗糖的NYG培養基生長。經此方法篩選得到的候選菌株用PCR和 Southern blot進行驗證(圖幻，獲得正確的phoP的讀框內刪除突變體IFD-phoP。在該突變體中，PhoP基因的第106-564個堿基，對應第36-188個氨基酸編碼序列被正確刪除。同時，該實驗也證明如果不通過反式提供一個額外拷貝的PhoP，無法獲得任何染色體上phoP 基因的突變體(即突變后致死)。因此證明，PhoP是一個野油菜黃單胞菌的必需基因。圖 2(a)是對突變體的PCR驗證，圖中phoP讀框內刪除突變體為IFD-phoP。由于序列被刪除，其PCR產物小于)(cc 8004-pHM正對照菌株。圖2 (b)突變體的Southern雜交驗證。圖中 pHM2 :phoP為重組質粒。Single-crossover為單交換菌株。IFD-phoP(T)為正確的phoP 讀框內刪除突變體，IFD-phoP(F)為假陽性。( 二)實施例2、PhoP是一個反應調節蛋白1. PhoP-His6重組蛋白的表達與純化經生物信息學預測，PhoP含有Receiver結構域和轉錄因子結構域，是一個可能的細菌反應調節蛋白。但該推測尚無任何實驗證據。由于反應調節蛋白會被醋酸磷酸等化學小分子磷酸化，并且可以被對應的組氨酸激酶磷酸化。為此，本發明表達并純化了 WioP蛋白并對其磷酸化特性進行了分析。利用引物7 (5 ‘ -CATATGCGTATCCTTTTGGTCGA-3 ‘)和引物8(5' -CTCGAGGCCTTCCGTACGCGGGA-3‘)，即序列表中的SEQ ID No.，9和SEQ ID No. 10， 經PCR方法擴增phoP全長片段。擴增條件為退火94°C 2min ；94°C 30sec，60°C 60sec, 72°C 循環；72°C 5min。PCR產物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳中分離后，克隆到 PGEM-T easy載體上(購自Promega公司，美國)并轉化大腸桿菌。經測序正確后，利用 NdeI酶和^CbaI酶雙酶切回收插入片段。該片段連接到經NdeI酶和HindIII酶雙酶切處理的pET30a載體(購自Novagen公司，美國)上，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。正確的重組菌株在LB培養基中生長至0D_ = 0.6，加入ImM IPTG，16°C誘導18小時。誘導后的細菌細胞經離心收集、裂解后，利用Ni-NTA瓊脂糖(購自Novagen公司，美國)進行親和層析， 250mM咪唑緩沖液洗脫獲得純化的WioP重組蛋白。該蛋白的純度利用12% SDS-PAGE膠進行電泳分析，純度達90 %以上。2.小分子對WioP的磷酸化小分子化合物，如醋酸磷酸，能夠對反應調節蛋白進行磷酸化。為此，在14. Oul AKP 緩沖液(25mM Tris_HCl，pH 7. 4 ；60mM KOAc ；IOmM MgCl2)中加入 1. OU 的 E. coli 醋酸激酶(購自Sigma公司，美國)和20uCi y-[32P]-ATPQu1)。25°C溫育30min。獲得同位素 32P標記的醋酸磷酸小分子。將IOuM WioP-Hk6重組蛋白，即WioP重組蛋白與32P標記的醋酸磷酸混合，在一定的時間內收集樣品，利用5XSDS點樣緩沖液中止反應后，樣品用12% SDS-PAGE膠進行電泳分離并檢測同位素信號(圖3)。該實驗證明，同位素32P標記的醋酸磷酸小分子能夠對WioP重組蛋白進行磷酸化，在W10P蛋白位置處出現明顯的同位素信號， 表明該蛋白內存在磷酸化位點。3.組氨酸激酶WioQ對WioP的磷酸化在同一雙組分信號轉導系統中，對于反應調節蛋白而言，其對應的組氨酸激酶能夠在極短的時間內對其進行磷酸化。為此，在IOul磷酸化反應緩沖液(Tris-HCl，50mM， DTT, 2mM, NaCl 25mM，KCl，25mM，MgCl2 5mM)中加入IOuM的野油菜黃單胞菌組氨酸激酶 PhoQ-His6重組蛋白，并加入20uCi y-[32PJ-ATP,混合物在30°C溫育30min，獲得保守組氨酸位點自磷酸化的WioQ-His6重組蛋白。隨后在該混合物中加入20uM的野油菜黃單胞菌反應調節蛋白WioP-His6，在一定的時間內收集樣品，利用5XSDS點樣緩沖液中止反應后，樣品用12% SDS-PAGE膠進行分離并檢測同位素信號(圖4)。該實驗證明，磷酸化的WioQ-His6 能夠在15sec內磷酸化WioP-Hk6重組蛋白，在W10P蛋白位置處出現明顯的同位素信號， 具有較高的酶動力學性質，表明WioQ和W10P構成一對細菌雙組分信號轉導系統。實驗同時表明，PhoQ是一個組氨酸激酶，具有自磷酸激酶活性和磷酸轉移酶活性；WioP是其對應的反應調節蛋白，能夠被WioQ磷酸化。(三)實施例3、缺乏阿拉伯糖培養下調phoP基因轉錄能夠顯著抑制細菌生長必需基因phoP敲除突變體的成功獲得，使得人工操縱該基因表達量，并觀察其對細菌生長的影響成為可能。由于在該突變體中，PhoP被置于嚴謹型的阿拉伯糖啟動子 (pBAD-araC)控制之下。如果在培養基中添加一定量的阿拉伯糖，該啟動子被誘導后能夠驅動PhoP的轉錄。如果培養基中不含阿拉伯糖，由于位于重組載體pHM2-pBAD-phoP上的 PhoP拷貝停止轉錄，而染色體上的phoP拷貝已經發生了讀框內刪除，不能調控細菌的正長生長，會導致細菌生長停滯甚至死亡。如圖5所示，當把黃單胞菌菌株在NYG富營養培養基 (含阿拉伯糖)中生長至0D_ = 0.6后，利用不含碳源的MMX基本培養基洗滌菌體2-3次以便除去阿位伯糖。將細菌調整到OD6tltl = 0. 1，隨后分別用不含阿拉伯糖的MMX培養基和含有0. 05%阿拉伯糖的MMX培養基重懸，并繼續在下搖菌培養。在有或無阿拉伯糖的 MMX培養基中，作為陽性對照的)(cc 8004菌株生長無明顯的區別。但對于IFD-phoP突變菌株而言，當生長于含有阿拉伯糖的MMX培養基中時，由于重組載體上的PhoP基因仍然得以轉錄，該突變體的生長并未受到影響，與野生菌株相比無明顯差異。但當IFD-phoP突變菌生長于不含阿拉伯糖的MMX培養基中時，由于重組載體上的PhoP停止轉錄，而細菌染色體上的PhoP基因已經被讀框內刪除，從而影響到了菌株的正常生長，其生長速度極顯著地慢于其余對照菌株。請見圖5的曲線圖，圖5(a)中細菌菌株生長于添加0.05%阿拉伯糖的MMX培養基中，顯示IFD-phoP突變體生長比野生型細菌略快。圖5(b)細菌菌株生長于無阿拉伯糖的MMX培養基中，顯示IFD-phoP突變體生長受到顯著抑制。因此，該實驗進一步證明phoP是一個野油菜黃單胞菌的必需反應調節蛋白基因。當使用人工方法抑制該基因的轉錄后，會導致細菌生長受到強烈的抑制。序列表<110>中國科學院微生物研究所<120> 一種野油菜黃單胞菌必需基因及其編碼的蛋白及應用<130>2011<160>10<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>684<212>DNA<213> 里予油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)<400>1atgcgtatccttttggtcgaagacgaagctCCgCtgCgCgagacccttgcCgCgCgCCtg60
aagcgcgaaggctttgctgttgacgctgcacaggacggcgaagaaggtctctacatgggc120
cgtgaagtgccgttcgatgtcggcatcatcgacctgggcctgcccaagatgtcgggcatg180
gaactgatcaaggcgctgcgcgacgagggcaagaaattccccgtgctgatcctgactgcg240
cgttcgagctggcaggacaaggtcgaaggcctcaagcagggtgccgacgattacctggtc300
aagccgttccacgtcgaagagttgctggcgcgcgtcaatgCgCtgCtgCgtcgtgcggct360
ggctggagcaagccgaccctggaatgcggcCCggtggCCCtggatcttgctgcgcagacg4200074]gtgagcgtca acggcgccaa tgtggatctgaccagctacg agtacaaggtgctggaatac4800075]ctgatgatgc atgccggcga actggtctccaaggccgacc tcaccgagcatatctatcag5400076]caggatttcg accgcgattc caacgtgctggaagtgttca tcggccggctgcgcaagaag6000077]cttgacccgg atggtgagtt gaagccgatcgagaccgtgc gtggtcgcggttaccgcttc6600078]gccatcccgc gtacggaagg ctga6840079]<210>20080]<211>2270081]<212>PRT0082]<213>野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestrispv. campestris)0083]<400>20084]MetArglieLeuLeuValGluAspGluAlaProLeuArgGluThrLeu0085]1510150086]AlaAlaArgLeuLysArgGluGlyPheAlaValAspAlaAlaGlnAsp0087]2025300088]GlyGluGluGlyLeuTyrMetGlyArgGluValProPheAspValGly0089]3540450090]IlelieAspLeuGlyLeuProLysMetSerGlyMetGluLeulieLys0091]5055600092]AlaLeuArgAspGluGlyLysLysPheProValLeulieLeuThrAla0093]657075800094]ArgSerSerTrpGlnAspLysValGluGlyLeuLysGlnGlyAlaAsp0095]8590950096]AspTyrLeuValLysProPheHisValGluGluLeuLeuAlaArgVal0097]1001051100098]AsnAlaLeuLeuArgArgAlaAlaGlyTrpSerLysProThrLeuGlu0099]1151201250100]CysGlyProValAlaLeuAspLeuAlaAlaGlnThrValSerValAsn0101]1301351400102]GlyAlaAsnValAspLeuThrSerTyrGluTyrLysValLeuGluTyr0103]1451501551600104]LeuMetMetHisAlaGlyGluLeuValSerLysAlaAspLeuThrGlu0105]1651701750106]HislieTyrGlnGlnAspPheAspArgAspSerAsnValLeuGluVal0107]1801851900108]PhelieGlyArgLeuArgLysLysLeuAspProAspGlyGluLeuLys0109]1952002050110]ProlieGluThrValArgGlyArgGlyTyrArgPheAlalieProArg0111]2102152200112]ThrGluGly0113]225
0114]<210>3
0115]<211>26
0116]<212>DNA
0117]<213>人工序列
0118]<220>
0119]<223>
0120]<400>3
0121]gtcgacatgc gtatcctttt ggtcga26
0122]<210>4
0123]<211>26
0124]<212>DNA
0125]<213>人工序列
0126]<220>
0127]<223>
0128]<400>4
0129]ggtacctcag ccttccgtac gcggga26
0130]<210>5
0131]<211>25
0132]<212>DNA
0133]<213>人工序列
0134]<220>
0135]<223>
0136]<400>5
0137]tctagatgtt ccgtttggcg atagc25
0138]<210>6
0139]<211>24
0140]<212>DNA
0141]<213>人工序列
0142]<220>
0143]<223>
0144]<400>6
0145]gaattcttct tcgccgtcct gtgc24
0146]<210>7
0147]<211>26
0148]<212>DNA
0149]<213>人工序列
0150]<220>
0151]<223>
<400>7gaattcgtgc tggaagtgtt catcgg26<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>8ctgcagcgtc aggtcgcacc acttc25<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>9catatgcgta tccttttggt cga23<210>10<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>10ctcgaggcct tccgtacgcg gga2權利要求
1.一種野油菜黃單胞菌必需基因，具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQID No. 1的DNA序列；(2)編碼序列表SEQID No. 2的氨基酸序列的多核苷酸。
2.根據權利要求1所述的野油菜黃單胞菌必需基因，其特征在于，所述必需基因的檢測方法為1)利用序列表中SEQID No. 3和SEQ ID No. 4的多核苷酸作為引物，經PCR方法擴增序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列全長片段；2)將擴增出的核苷酸序列克隆到載體上，獲得在嚴謹性啟動子控制下的重組載體；3)將重組載體轉入野油菜黃單胞菌菌株中獲得重組菌株；4)利用重組自殺載體對重組菌株染色體上的必需基因核苷酸序列進行讀框內刪除獲得突變體；4)將該突變體置于培養基中，利用添加的嚴謹性物質作為誘導物，控制突變體中重組必需基因的轉錄水平，檢測該必需基因對野油菜黃單胞菌生長的影響；5)確定該基因是否為必需基因。
3.根據權利要求2所述的野油菜黃單胞菌必需基因，其特征在于，所述重組自殺質粒的制備方法為1)分別用PCR擴增必需基因的上游基因和下游基因，獲得上游基因片段和下游基因片段；2)將上游基因片段和下游基因片段分別克隆到自殺載體中獲得重組自殺載體。
4.一種野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白，具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸序列。
5.根據權利要求4所述的野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白，其特征在于所述蛋白為野油菜黃單胞菌生長所必需的反應調節蛋白。
6.根據權利要求5所述的野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白，其特征在于所述反應調節蛋白的檢測方法為1)將32P標記的醋酸磷酸與野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白混合；2)提取混合物樣品，利用電泳方法分離并進行同位素信號檢測確定所述蛋白是否被磷酸化。
7.根據權利要求5所述的野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白，其特征在于所述反應調節蛋白的檢測方法為1)將α-32P標記的組氨酸激酶與野油菜黃單胞菌必需基因編碼的蛋白混合；2)提取混合物樣品，利用電泳方法分離并進行同位素信號檢測確定所述蛋白是否被磷酸化。
8.一種制備野油菜黃單胞菌必需基因編碼的反應調節蛋白的方法，包括如下步驟1)利用序列表中SEQID No. 9和SEQ ID No. 10的多核苷酸作為引物，經PCR方法擴增序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列全長片段；2)將擴增出的核苷酸序列連接到載體上，轉化到大腸桿菌菌株上；3)將獲得的大腸桿菌菌株進行培養后離心收集裂解后進行親和層析獲得重組蛋白。
9.一種控制野油菜黃單胞菌生長的方法，以野油菜黃單胞菌中的蛋白或編碼該蛋白的基因作為靶標篩選能控制野油菜黃單胞菌的物質，所述蛋白具有序列表中的SEQ ID No. 2 的氨基酸序列；所述編碼該蛋白的基因具有序列表中的SEQ ID No. 1的核苷酸序列。
10.根據權利要求9的控制野油菜黃單胞菌生長的方法，其特征在于，所述方法是以控制野油菜黃單胞菌所述基因的轉錄來控制野油菜黃單胞菌的生長。
全文摘要
本發明公開了一種野油菜黃單胞菌必需基因及其編碼的蛋白與應用，其必需基因具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID No.1的DNA序列；(2)編碼序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列的多核苷酸。必需基因編碼的蛋白具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序列。以上述必需基因或其編碼的蛋白作為靶標，可以用于篩選抗野油菜黃單胞菌的物質。本發明的必需基因及其編碼的蛋白為野油菜黃單胞菌生長所必需的，因此可以作為野油菜黃單胞菌理想的、特異性的農藥作用靶標。由于該菌導致的十字花科植物黑腐病是世界上大宗蔬菜生產的重大病害，對該蛋白和基因的研究、開發和應用將會對控制黑腐病發揮獨特的作用。
文檔編號C12R1/19GK102399793SQ20111036330
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者彭寶玉, 錢韋 申請人:中國科學院微生物研究所