專利名稱：一種嗜熱菌蛋白酶的固定化方法
技術領域：
本發明涉及一種嗜熱菌蛋白酶的固定化方法。
背景技術：
酶作為一種生物催化劑，因其具有高選擇性、催化反應條件溫和、無污染等特點， 廣泛應用于食品加工、醫藥和精細化工等行業。但天然酶穩定性差、易失活、不能重復使用， 并且反應后混入產品，純化困難，使其難以在工業中更為廣泛的應用。此外，分離和提純酶以及它們的一次性使用也大大增加了其作為催化劑的成本。在此條件下，固定化酶的概念和技術得以提出和發展，并成為近幾年酶工程研究的重點。酶的固定化，即用固體材料將酶束縛或限制于一定區域內，仍能進行其特有的催化反應，并可回收及重復使用的一類技術。依據酶的性質及用途，可分為吸附法、共價結合法、交聯法、包埋法這幾種。嗜熱菌蛋白酶(EC3. 4. 24. 27)是一種存在于嗜熱溶蛋白芽孢桿菌(Bacillus thermoproteolyticus)中的耐熱性中性金屬蛋白酶，含有4個鈣離子和1個鋅離子。其曾被用來研究卵傳鐵蛋白的結構，因為嗜熱菌蛋白酶可以完全消化N端葉卻留下大多數的C 端葉免受破壞。嗜熱菌蛋白酶不但廣泛應用于肽鍵的水解中，特別是水解亮氨酸，苯丙氨酸，異亮氨酸，纈氨酸等氨基酸的疏水性的或大的氨基側鏈的N端，而且其還催化肽鍵的形成，特別是催化人造甜味劑阿斯巴甜的合成。阿斯巴甜是一種二肽甜味劑，甜度大約是蔗糖的200倍，其味如白糖，不膩不苦；低熱量可減肥；不會使血糖升高，適合于肥胖癥、糖尿病和心血管病人食用；不被微生物發酵、不怕發霉，無虞齲齒，現在在100多個國家中被廣泛用于食品與飲料中。采用酶催化此甜味劑的合成，與化學工藝相比，具有明顯優勢，如避免了有毒有害催化劑的使用，減少了有機溶劑的使用量，使反應條件變的溫和，從替代傳統化學合成工藝催化劑的角度，該酶催化的反應具有很強的綠色屬性，對傳統化學工藝的綠色化學改造有著重要意義，因而該酶具有廣闊的應用前景。固定化能夠改善酶的性質，使固定化酶比游離酶具有更好的穩定性和更高的使用效率，并且使酶能夠回收利用，極大節約生產成本。但是由于嗜熱菌蛋白酶溶解性低 (1. 0 1. ang/ml)又只有9個氨基(嗜熱菌蛋白酶通過氨基與載體共價連接)其共價固定化存在很大的困難。

發明內容
本發明目的在于提供一種簡單，快速，高效的嗜熱菌蛋白酶共價固定化方法，該共價固定化是通過對苯醌交聯劑與酶及載體的共價連接實現的，最終獲得固定化酶產品，獲得了性能比嗜熱菌蛋白酶自由酶大為改善的嗜熱菌蛋白酶固定化酶。本發明采用的技術方案是一種嗜熱菌蛋白酶的固定化方法，所述方法包括(1)載體活化將氨基化的介孔泡沫硅載體MCFS-NH2浸漬在0. 5 2. 5mM的對苯醌溶液中，在20 30°C、100 200rpm的條件下振蕩活化1 3小時，離心，取沉淀依次用 20 30 %乙醇和純水洗滌，洗滌后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的載體液；(2)酶的固定化將活化的載體液，按40 IOOmg嗜熱菌蛋白酶(自由酶)/g MCFs-NH2的加酶量，加入嗜熱菌蛋白酶得到混合液，將混合液在冰浴中電磁攪拌反應18 20h或者在0 7°C、20 50W微波條件下照射2 ％iin，離心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗滌，得到固定化嗜熱菌蛋白酶；步驟(1)中所制得的氨基化的MCFs載體是本領域常規的氨基化的介孔泡沫硅載體，其孔徑約為26nm。步驟(1)禾Π (2)中所述MES-NaOH溶液組成如下NaCl 2 5M，ZnCl2 10 30mM， MES-NaOH 0. 01 0. 05M, pH 7. 0 7. 5，溶劑為水。本發明在固定化時加入2 5MNaCl可以使嗜熱菌蛋白酶的溶解性提高約10倍， 使得嗜熱菌蛋白酶可以充分分散在溶液中不至于聚集在一起從而能很好地與載體共價連接。目前微波輻射在有機合成化學中的應用廣泛受到關注，其可以大大地加快反應的進行并有效地提高產率。微波對物質分子的作用是直接作用于分子內部的。物質分子偶極振動同微波振動具有相似的頻率，在快速振動的微波磁場中，分子的偶極振動盡力同磁場振動相匹配，而分子的振動又往往滯后于磁場，物質分子吸收電磁能以每秒數十億次高速振動從而加速分子間的作用。其中極性物質受到微波的作用更加明顯，而蛋白質和多肽都是典型的極性分子，所以微波能夠加速嗜熱菌蛋白酶與載體的共價連接。因此研究中性鹽增溶和微波輻射強化嗜熱菌蛋白酶固定化具有重要意義，可以將酶的固定化技術提高到一個新的水平。所述嗜熱菌蛋白酶以MES-NaOH溶液分散后添加到載體液中，所述嗜熱菌蛋白酶在MES-NaOH溶液中濃度為0. 5 2mg/mL，所述MES-NaOH溶液組成如下NaCl 2 5M，ZnCl2 10 30mM, MES-NaOH 0. 01 0. 05M, pH 7. 0 7. 5，溶劑為水。步驟(1)中對苯醌溶液與MCFs-NH2的體積質量用量之比為2 5ml IOmgo步驟(1)中重新分散時所用的MES-NaOH溶液與MCFs-NH2的體積質量用量之比為 2 5ml IOmg0所述方法如下(A)酶的分散取嗜熱菌蛋白酶，用MES-NaOH溶液分散，在_4°C下放置半小時，即得嗜熱菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液；(B)載體活化將氨基化的介孔泡沫硅載體MCFs-NH2浸漬在1. 5mM的對苯醌溶液中，在25°C、160rpm的條件下振蕩活化2小時，離心，取沉淀依次用20%乙醇和純水洗滌，洗滌后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的載體液；活化時所用的對苯醌溶液與 MCFs-NH2的體積質量用量之比為:3ml IOmg ；重新分散時所用的MES-NaOH溶液與MCFs-NH2 的體積質量用量之比為2 2.6ml IOmg ；(C)酶的固定化將活化的載體液，按40 IOOmg嗜熱菌蛋白酶(以自由酶計)/ g MCFs-NH2的加酶量，加入嗜熱菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液得到混合液，將混合液在冰浴中電磁攪拌反應20h或者在O 7°C、40W微波條件下照射3min，離心，取沉淀用
4MES-NaOH溶液洗滌，得到固定化嗜熱菌蛋白酶；步驟(A) (C)中所述MES-NaOH 溶液組成如下NaCl 3M, ZnCl220mM, MES-NaOH 0. 02M, pH 7. 0，溶劑為水。本發明中，所述氨基化的介孔泡沫硅載體MCFs-NH2可按如下方法制備得到①水熱過程先稱取P123(三嵌段共聚物聚(乙二醇)-block-聚(丙二醇)-block-聚(乙二醇))5 IOg用水分批次溶解，再加入50 IOOmg氟化銨后開始攪拌，再加入5 IOml TMB (1. 3. 5-三甲苯)和25 50ml鹽酸(36% 38%，w/w), 200 300rpm、10 50°C下攪拌20 60min，然后加入10 30ml TEOS (正硅酸四乙酯)，繼續攪拌12 24h后，將溶液轉入高壓反應釜中，置于烘箱中100 200°C，老化6 30h，最后用水過濾，所得載體烘干待用；②去模板反應稱取步驟①所制的載體0. 5 3. 5g于高壓反應釜中，加入5 25ml濃硝酸(65% 68%，w/w)和1 IOml雙氧水( 濃度20 40%，ν/ν)，置于烘箱中50 150°C反應6 30h，用水洗滌過濾，得到去模板載體烘干待用；③硅烷化稱取2 IOg步驟②制得的去模板載體于三口燒瓶中，加入甲苯200 300ml和氨基化試劑(例如硅烷偶聯劑)20 60ml，再通冷凝水，油浴100 150°C加熱回流6 30h，待反應結束后冷卻分別用甲苯和無水乙醇洗滌，待載體中的有機溶劑基本揮發之后，放入烘箱中烘干，即得所述氨基化的介孔泡沫硅載體MCFs-NH2。為了將微波輔助固定化與常規方法進行比較，本發明實施了嗜熱菌蛋白酶的常規固定化和微波條件下固定化方法，微波條件下固定化方法得到的固定化嗜熱菌蛋白酶在催化活力，耐熱性，耐有機溶劑的性能上都得到了巨大的提高(1)固定化嗜熱菌蛋白酶的催化活力得到了提高，其催化活力是自由酶催化活力的1.6倍，是常規固定化酶催化活力的 4.5倍。( 固定化嗜熱菌蛋白酶的熱穩定性有所改善。當在70°C的條件下孵育3. ，固定化嗜熱菌蛋白酶的活力沒有降低，而自由酶在孵育池后就已經沒有活性。當在80°C的條件下孵育60min，自由酶已經完全沒有活性，而固定化酶卻保留著74. 的催化活性。(3)固定化嗜熱菌蛋白酶抵御有機溶劑的性能也得到了很大的提高。在5%叔戊醇中70°C下孵育 2h，固定化酶的活性沒有改變，而自由酶的催化活力降低了 32.5%。甚至在80%叔戊醇中 70°C下孵育池，固定化酶還保留著46. 3%的催化活力，自由酶已經完全沒有活力了。對于乙酸乙酯來說，固定化嗜熱菌蛋白酶也展示了強大的抵御能力。在5%乙酸乙酯中70°C下孵育2h，當自由酶的活力降低了 32. 5%時，固定化酶卻保留著92%的活力。而在80%乙酸乙酯中70°C下孵育2h時，自由酶已經毫無活力了，固定化酶卻保留著53. 的催化活力。本發明的有益效果體現在，通過本發明方法制得的固定化嗜熱菌蛋白酶在性能上比自由酶有了很大的提高。而且，通過本發明方法對嗜熱菌蛋白酶進行固定化還大大地縮短了固定化時間，從20h縮短到了 3min，整整縮短了 399倍，這使得酶固定化的成本得到了降低。


圖1為嗜熱菌蛋白酶催化合成阿斯巴甜前體的機制；其中，ZD :N-芐氧羰基-L-天冬氨酸FM =L-苯丙氨酸甲酯ZDFM =N-芐氧羰基-L-天門冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯；圖2為對苯醌濃度對固定化嗜熱菌蛋白酶負載率與催化活力的影響；
圖3為氯化鈉增溶和微波輔助共價固定化嗜熱菌蛋白酶的反應機制；圖4為微波輻射功率對固定化嗜熱菌蛋白酶負載率與催化活力的影響；圖5為自由酶和固定化酶的溫度穩定性；其中，·微波固定化嗜熱菌蛋白酶孵育于70°C水浴中，·微波固定化嗜熱菌蛋白酶孵育于80°C水浴中，▲嗜熱菌蛋白酶自由酶孵育于70°C水浴中，★嗜熱菌蛋白酶自由酶孵育于80°C水浴中；圖6為自由酶和固定化酶在70°C水浴中的耐叔戊醇性；FE 嗜熱菌蛋白酶自由酶 MW-IME 微波固定化嗜熱菌蛋白酶；圖7為自由酶和固定化酶在70°C水浴中的耐乙酸乙酯性；FE 嗜熱菌蛋白酶自由酶MW-IME 微波固定化嗜熱菌蛋白酶；
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 制備嗜熱菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液(1)取2mg嗜熱菌蛋白酶(自由酶，購自于西格瑪奧德里奇上海分公司，下同)，用 2ml pH 7.0,0. 02M的MES-NaOH溶液分散，在_4°C下放置半小時，既得lmg/ml的嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液。(2)取 2mg 嗜熱菌蛋白酶，用 2ml 含有 20mM ZnCl2 的 pH 7. 0,0. 02M 的 MES-NaOH 溶液分散，在-4°C下放置半小時，既得lmg/ml的嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液。(3)取 ang 嗜熱菌蛋白酶，用 2ml 含有 3M NaCl, 20mM ZnCL2 的 pH7. 0,0. 02M 的 MES-NaOH溶液分散，在-4°C下放置半小時，既得lmg/ml的嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液。實施例2 將嗜熱菌蛋白酶自由酶制備成固定化嗜熱菌蛋白酶A.制備嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液取2mg嗜熱菌蛋白酶自由酶，用 2ml 含有 3M NaCl, 20mM ZnCl2 的 pH 7. 0,0. 02M 的 MES-NaOH 溶液分散，在 _4°C下放置半小時，既得lmg/ml的嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液。B.將嗜熱菌蛋白酶自由酶制備成固定化嗜熱菌蛋白酶(1)載體 MCFs-NH2 的制備①水熱過程先稱取P123(三嵌段共聚物聚(乙二醇)-block-聚(丙二醇)-block-聚(乙二醇)，ΡΕ0-ΡΡ0-ΡΕ0) 5. 34g用水分批次溶解使其能全部轉移到容器中去，再加入61. 氟化銨后安裝開始攪拌，再加入6. ^iil TMB (1.3. 5-三甲苯)和27.細1 鹽酸(36. 5wt% )。設置攪拌轉速為250rpm，40°C下攪拌45min，然后加入12. 6ml TEOS (正硅酸四乙酯)，繼續攪拌20h。攪拌完畢之后，將溶液轉入高壓反應釜中，至于烘箱中120°C， 老化Mh。最后用水過濾，烘干待用；②去模板反應稱取上面所制的載體1. Og于高壓反應釜中，加入IOml濃硝酸 (65. 5wt% )和7ml雙氧水(30%，ν/ν)，置于烘箱中100°C反應12h。然后用水洗滌過濾， 烘干待用；③硅烷化稱取4. 5g步驟②制得的去模板載體于三口燒瓶當中，然后加入甲苯270ml，氨基化試劑27ml (硅烷偶聯劑JH-Al 12)，然后通冷凝水，油浴110°C加熱回流12h，待反應結束后冷卻然后分別用甲苯和無水乙醇洗滌，待載體中的有機溶劑基本揮發之后，放入烘箱中烘干得MCFs-NH2,孔徑為^nm ；(2)對載體進行活化處理選用對苯醌溶液3ml使其在反應液的終濃度為1. 5mM 和IOmg的MCFs-NH2在25°C的恒溫水浴搖床中160rpm的條件下振蕩2小時，離心，取沉淀分別用20% (ν/ν)乙醇和純水洗滌，洗滌后的沉淀并將其重新分散于2.6ml含有3Μ NaCl, 20mM ZnCl2WpH 7. 0，0. 02M的MES-NaOH溶液中，其中因離心過程中固液實現分離，故認為載體重量保持不變，仍為10mg。(3)取步驟(2)得到的活化的載體液2. 6ml，再加入步驟A制得的嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽緩沖液0.細1，混勻得混合液，所述的固定化酶制備過程中加酶量為40mg嗜熱菌蛋白酶自由酶/g MCFs-NH2. (4)取步驟( 的混合液進行固定化處理將混合溶液在冰浴中電磁攪拌反應20h，離心，用含有3M NaCl, 20mM ZnCl2的PH 7. 0,0. 02M的 MES-NaOH溶液洗滌，得到固定化嗜熱菌蛋白酶。實施例3 將嗜熱菌蛋白酶自由酶用微波法制備成固定化嗜熱菌蛋白酶A.制備嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液取2mg嗜熱菌蛋白酶自由酶，用 2ml 含有 3M NaCl, 20mM ZnCL2 的 PH 7. 0,0. 02M 的 MES-NaOH 溶液分散，在 _4°C下放置半小時，既得lmg/ml的嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液。B.將嗜熱菌蛋白酶自由酶制備成固定化嗜熱菌蛋白酶(1)載體的制備同實施例2。(2)對載體進行活化處理選用對苯醌溶液3ml使其在反應液的終濃度為1. 5mM 和IOmg的MCFs-NH2在25°C的恒溫水浴搖床160rpm的條件下振蕩2小時，離心，取沉淀分別用20%乙醇和純水洗滌，洗滌后的沉淀并將其重新分散于2. 6ml含有3M NaCl, 20mM ZnCl2 的PH 7. 0,0. 02M的MES-NaOH溶液中，其中因離心過程中固液實現分離，故認為載體重量保持不變，仍為10mg。(3)取步驟(2)得到的活化的載體液2. 6ml，再加入步驟A制得的嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液0.細1，混勻得混合液，所述的固定化酶制備過程中加酶量為 40mg嗜熱菌蛋白酶自由酶/gMCFs-NH2。(4)取步驟(3)的混合液進行固定化處理將混合溶液在O 7°C，40W微波條件下照射3分鐘，離心，取沉淀用含有3M NaCl, 20mM ZnCl2的PH 7. 0,0. 02M的MES-NaOH溶液洗滌，得到微波固定化嗜熱菌蛋白酶。實施例4 活化載體的交聯劑種類對固定嗜熱菌蛋白酶的影響用3ml終濃度為1. 5mM的對苯醌溶液和戊二醛溶液分別對IOmg的MCFs-NH2進行活化處理，將經活化處理后的載體用anl PH 7.0，0.02M的MES-NaOH溶液溶解。按照IOOmg 酶/g載體的質量比，加入實施例1(1)得到的lmg/ml的嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液1ml，混勻得混合液。對于環氧基化的MCFs不需要活化，直接將IOmg環氧基化的MCFs (制備過程參見實施例2，這里用的硅烷偶聯劑是JH-S1891)溶解于anl PH7.0,0. 02M MES-NaOH溶液中。 再按照IOOmg酶/g載體的質量比，加入實施例1(1)得到的lmg/ml的嗜熱菌蛋白酶自由酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液Iml混勻得混合液。將以上三種混合液分別在冰浴中電磁攪拌反應20h，離心，用PH 7. 0,0. 02M的 MES-NaOH溶液洗滌，得到固定化嗜熱菌蛋白酶。對這三個固定化酶進行活力測定，結果見表 1。表1 交聯劑種類對固定化嗜熱菌蛋白酶活性的影響
權利要求
1.一種嗜熱菌蛋白酶的固定化方法，所述方法包括(1)載體活化將氨基化的介孔泡沫硅載體MCFs-NH2浸漬在0.5 2. 5mM的對苯醌溶液中，在20 30°C、100 200rpm的條件下振蕩活化1 3小時，離心，取沉淀依次用20 30 %乙醇和純水洗滌，洗滌后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的載體液；(2)酶的固定化將活化的載體液，按40 IOOmg嗜熱菌蛋白酶/gMCFs-NH2的加酶量， 加入嗜熱菌蛋白酶得到混合液，將混合液在冰浴中電磁攪拌反應18 20h或者在0 7V、 20 50W微波條件下照射2 ％iin，離心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗滌，得到固定化嗜熱菌蛋白酶；步驟(1)和(2)中所述MES-NaOH溶液組成如下NaC12 5M，SiCl2IO 30mM，MES-NaOH 0. 01 0. 05M, pH 7. 0 7. 5，溶劑為水。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述嗜熱菌蛋白酶以MES-NaOH溶液分散后添加到載體液中，所述嗜熱菌蛋白酶在MES-NaOH溶液中濃度為0. 5 ang/mL，所述MES-NaOH 溶液組成如下:NaCl 2 5M, ZnCl2 10 30mM, MES-NaOH 0. 01 0. 05M, pH7. 0 7. 5，溶劑為水。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中對苯醌溶液與MCFs-NH2W體積質量用量之比為2 5ml IOmg0
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中重新分散時所用的MES-NaOH溶液與MCFs-NH2的體積質量用量之比為2 5ml IOmgo
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(A)酶的分散取嗜熱菌蛋白酶，用MES-NaOH溶液分散，在-4°C下放置半小時，即得嗜熱菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液；(B)載體活化將氨基化的介孔泡沫硅載體MCFs-NH2浸漬在1.5mM的對苯醌溶液中，在 250C、160rpm的條件下振蕩活化2小時，離心，取沉淀依次用20 %乙醇和純水洗滌，洗滌后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的載體液；(C)酶的固定化將活化的載體液，按40 IOOmg嗜熱菌蛋白酶/gMCFs-NH2的加酶量， 加入嗜熱菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸鹽溶液得到混合液，將混合液在冰浴中電磁攪拌反應 20h或者在O 7°C、40W微波條件下照射3min，離心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗滌，得到固定化嗜熱菌蛋白酶；步驟(A) (C)中所述 MES-NaOH 溶液組成如下NaC13M，ZnCl220mM，MES-NaOH 0. 02M, pH 7.0，溶劑為水。
全文摘要
本發明提供了一種嗜熱菌蛋白酶的固定化方法，(1)載體活化將氨基化的介孔泡沫硅載體MCFs-NH2浸漬在0.5～2.5mM的對苯醌溶液中，振蕩活化1～3小時，離心，取沉淀洗滌，洗滌后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的載體液；(2)酶的固定化將活化的載體液，按40～100mg嗜熱菌蛋白酶/g MCFs-NH2的加酶量，加入嗜熱菌蛋白酶得到混合液，將混合液在冰浴中電磁攪拌反應18～20h或者在0～7℃、20～50W微波條件下照射2～4min，離心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗滌，得到固定化嗜熱菌蛋白酶；通過本發明方法制得的固定化嗜熱菌蛋白酶在性能上比自由酶有了很大的提高，還大大地縮短了固定化時間，從20h縮短到了3min，整整縮短了399倍，這使得酶固定化的成本得到了降低。
文檔編號C12N11/08GK102433317SQ20111036333
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者張方凱, 杜方川, 王安明, 謝恬, 陳飛飛 申請人:杭州師范大學