專利名稱：一種PsPR10P796啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種啟動子及其應用，特別涉及一種PsPR10P796啟動子及其應用。
背景技術：
啟動子是DNA上結合RNA聚合酶并形成轉錄起始復合物的區域。外源基因在轉基因作物體內的表達依靠啟動子對其的調控作用，表達量不足往往得不到理想轉基因植物。 因此，選擇合適的植物啟動子是增強外源基因表達首要問題。根據啟動子所控制的基因表達范圍和方式不同，啟動子可以分成組成型啟動子和特異性啟動子。在組成型表達啟動子的控制下，外源基因在轉基因植物的所有部位和所有的發育階段都會表達。外源基因在植物內持續、高效的表達不但造成浪費，往往還會引起植物的形態發生改變，影響植物的生長和發育。為了使外源基因在植物體內有效發揮作用，同時又可減少對植物的不利影響，近年來人們對特異性啟動子的研究越來越重視。隨著植物根特異性表達啟動子研究的不斷改進，現已分離了一些植物根特異性表達基因和增強序列，這些序列能在根部特異性或優先激活從而啟動基因的表達，啟動子中存在負責根特異性表達的順式作用元件，受外來因素誘導或特定蛋白調控，包括組織特異性啟動子和誘導表達型啟動子。例如來自煙草的富含羥脯氨酸的糖蛋白(HRGP)基因，盡管其表達水平很低但是根特異性的，在煙草側根分化誘導過程中，在中柱鞘和內皮層中其啟動子表現短時間活躍，特別是后期根發生組織細胞中活性強，屬于組織特異性啟動子。誘導表達是指植物細胞由于環境的變化而導致相關基因的表達。植物體內存在著一套防御機制來對付不良環境，在這個過程中，環境誘導基因啟動子起著關鍵的作用。根對于植物從土壤中吸收水分和養分，維持正常生長具有重要作用。在環境脅迫下，最先受到影響的器官是根部組織，如果將根部誘導型特異性啟動子應用于植物抗脅迫基因工程中，使抗性基因在根部細胞中特異表達，這樣就能降低能量消耗，使轉基因植物在獲得抗性的同時，又不影響正常的生長發育，對抗逆、抗病蟲的基因工程具有十分重要的意義。

發明內容
本發明目的是提供一種能夠調控目的基因高效特異表達于植物的根部組織的 PsPR10P796啟動子，并應用于植物抗逆基因工程。本發明采用的技術方案是一種I^raiOP796啟動子，所述啟動子含有下列任意一組核苷酸序列a、SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列互補的序列；本發明也不排除對上述a或b所述序列進行一個或多個堿基的取代、缺失或修飾的核苷酸序列；或與上述a或b所述序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。進一步，所述的I^raiOP796啟動子優選為含有SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列的
啟動子。一種DNA構建體，所述DNA構建體包含所述的Ι^Ι^10Ρ796啟動子以及與之進行可操作連接的基因序列。一種載體，所述載體含有所述的啟動子或所述的DNA構建體。一種重組細胞，所述的重組細胞包含所述的啟動子或所述的DNA構建體或所述的載體。進一步，所述的重組細胞優選為重組大腸桿菌細胞或重組農桿菌細胞。一種含有所述的啟動子或所述的DNA構建體或所述的載體或所述重組細胞的植物愈傷組織或植物。進一步，所述的植物愈傷組織或植物優選為煙草。所述的PsPR10P796啟動子在植物抗逆基因工程中的應用。進一步，所述的I^raiOP796啟動子在植物抗逆基因工程中的應用為Ι^Ι^10Ρ796 啟動子在在抗逆轉基因煙草中的應用，將抗逆基因置于I^raiOP796啟動子下游，構建植物表達載體，將載體導入煙草，得到抗逆轉基因煙草。本發明提供的啟動子核苷酸序列來自美洲東部白松(Pinus strobus) 0本發明利用同源克隆和RACE技術獲得美洲東部白松I3sI3RIO基因上游796bp序列啟動子，其核苷酸如SEQ. ID. NO. 1所示，具體方法如下本發明從美洲東部白松根中提取 DNA，根據國際基因庫(GenBank)中已經發布的其它植物I3RlO基因上游DNA序列，設計引物，序列如下Fl :AAAAGCTTCTCGAGATGACTCTTRl :CATTTTCAACTCTCT CGCAACTA利用上述引物進行常規聚合酶鏈式反應(PCR)。將PCR產物與克隆載體(pEASY-T) 連接轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，然后篩選陽性重組子，進行序列測序，根據獲得的序列設計引物，引物序列如下F796 :AAAAGCTTGGTGATTACTCCAACAAAATCR2 :AAGGATCCCATTTTCAACTCTCTCGCAAC以美洲東部白松根DNA為模板進行PCR擴增，將PCR產物與克隆載體(pEASY_T)連接轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，然后篩選陽性重組子，進行序列測序，得到一個796bp 啟動子序列，將該序列命名為PsPR10P796。該啟動子序列SEQ. ID. NO. 1信息如下
長度:796bp
類型核酸
鏈型雙鏈
來源美洲東部白松(Pinus ttrobus)
-796GTGATTACTCCAACA
-781AAATCTAATCCATCAATAAAAATGTACACAAACTAATTTTCATTTAATCTTTTTCTGCCC
-721ATTTAATAAAAAGATCAAAATTCTGGCAGCCGAATATTTGGTCTTTTGAACTTAACGAAT
-661ATATATATATCCACTGAAAAGTCATTTTGAAATATATGCATTCCACGGTAGCGATGGCAC
-601GGCGTTGGTGAATGTAGAAGCCTTTGTAAGCAATTTACGGCGTCTTTGACATTTGTGTAT
-541CTCTTCTAGATGGGTTAACAACACGGACTGACAAAACCGCGGTGGTTAGGGAAGTTAGAA
-481ACGATATTCATTGAAGGATCAGCCTGTAAATAAATAAATAAAAACAAATTATCCATTTCA
-421TGTCTTATCTTGTTATCTGGTCGTATCTACTCTTTGTCATTAATCGTCTCTGAAAGTGGG
-361AACCGGAACCGGAATCGTCTCTTGTCATTAGATGAGAAGAGAAATAACAAATCACCATGG
-301GATCTAGAAACATCCATCCATTCCGTTTATTCAAAGTCAGCACACACAGTGGGGTCCGGG
-241GGATCGTTGTCCTTTAGGACTTATCGAAACCAGGCATGGAGCTCGGTATTGTCGGCCACA
-181AAGGCCAAGGGTTCAATAAGAAAACCCAAGTAGTTGGCATTATGTGCGTCCATCGGTCAG
-121TCCAAATAACAAATAGTCACTTTCGAGTCTCATGTCATTACCTACGCGCTCTCTTTAATG
-61 TACAGATTTTAAAGGTTTGTAAACGACTACTATAAATACGGGCTCGTCTAGTGCAGTTGA
-1 GAACAAGGAGCTTTGTGCGATAATATTGAAGAAATATAAGTATTGTGTAGTTGCGAGAGA
60 GTTGAAAATG啟動子序列SEQ. ID. NO. 1中負號表示啟動子序列，正號表示啟動子下游序列。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在本發明提供了一種新的 I^raiOP796啟動子，具有較高的根特異誘導表達活性，能夠提高下游抗逆基因根特異轉錄水平，從而能夠增強轉基因植物抗逆能力。


圖1轉基因煙草受不同信號分子誘導后⑶S在I^raiOP796啟動子驅動下表達能力，(A B)為T3代對照處理轉基因煙草；(C H)為T3轉基因煙草分別利用以下信號分子處理NaCl，甘露醇，聚乙二醇，脫落酸，茉莉酸，水楊酸。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此基于本生煙草生長速度快、生活周期短、離體培養再生能力強和遺傳轉化效率高等特點，在下述實施例中以煙草為例對本發明進行了詳細說明。氨芐LB固體培養基、LB固體培養基、MS培養基、YEP培養基、MS液體培養基、MS預分化培養基、MS基本培養基、MS生根培養基、1/2MS培養基及其組成均為公知常識。實施例1 調控目的基因高效特異表達于植物的根部組織的美洲東部白松 ^Ι^10Ρ796啟動子的克隆1. DNA提取利用植物DNA提取試劑盒(TransGen，Bei jing)提取美洲東部白松基因組DNA，作為模板。2. PRlO基因上游DNA序列擴增利用引物Fl :AAAAGCTTCTCGAGATGACTCTT 和 Rl :CATTTTCAACTCTCT CGCAACTA 進行PCR擴增，體系如下10XBuffer5 μ L, 10mmoL/L dNTP 2 μ L，PCR引物各25pmol，DNA模板 1 μ L (約200ng)，Taq酶2U，加滅菌雙蒸水至50 μ L0PCR反應步驟為94°C預變性5min ；93°C 變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸90sec，循環30次；最后72°C延伸lOmin。瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒(TransGen，Beijing)回收片段，將所得片段連入pEASY_T載體(TransGen，Beijing)，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞CTransGen，Bei jing)，然后利用氨芐LB固體培養基篩選陽性重組子，并進行PCR鑒定，然后進行序列測序，獲得一個1750bp 序列。
3. PsPR10P796 啟動子獲得利用引物F796 :AAAAGC TTG TGATTACTC CAACAAAAT C 禾口 R2 :AAG GAT CCC ATT TTC AAC TCT CTC GCAAC進行PCR擴增，體系如下=IOXBuffer 5 μ L, 10mmoL/L dNTP 2 μ L, PCR引物各25pmol，DNA模板1 μ L(以步驟2獲得的1750bp序列為模板)，Taq酶2U，加滅菌雙蒸水至50 μ L。PCR反應步驟為94°C預變性5min ；93°C變性30sec，5(TC退火30sec， 72°C延伸60sec，循環30次；最后72°C延伸lOmin。1 %瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒(TransGen，Beijing)回收片段，將所得片段連入pEASY_T載體，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，然后利用含50mg/mL氨芐的LB固體培養基篩選陽性重組子，并進行PCR鑒定，然后進行序列測序，獲得一個796bp序列，命名為I^raiOP796啟動子。實施例2 表達載體構建及重組細胞的構建(1)根據分離的I^raiOP796啟動子核苷酸序列，設計引物正向引物5，-AAAAGCTTGGTGATTACTCCAACAAAATC-3，劃橫線部分為HindIII酶切位點反向引物5，-AAGGATCCCATTTTCAACTCTCTCGCAAC-3，劃橫線部分為BamH I酶切位點以該啟動子全長測序質粒為模板，利用上述正向和反向引物進行PCR反應。(2)取步驟(I)PCR 產物 2μ L 與克隆載體 pEASY_T(TransGen，Beijing)連接轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞(TransGen，Beijing)，然后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養基上培養過夜，篩選陽性重組子，進行PCR鑒定，獲得陽性大腸桿菌。(3)利用質粒提取試劑盒(TransGen，Beijing)提取上述步驟(2)得到的陽性大腸桿菌的質粒，將質粒用HindIII和BamH I酶切，與用相同限制酶酶切的pBI121表達載體連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，然后在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固體培養基上培養過夜，對生長出的菌落進行PCR鑒定和質粒酶切鑒定，獲得表達載體pBI 121。(4)取5μ 1表達載體pBI121，加入200μ 1農桿菌感受態細胞(Agrobacterium tumefaciens)，混勻；冰浴5min，再利用液氮冷凍lmin，迅速置于37°C水浴溫育5min，然后冰浴aiiin ；加入800 μ 1 YEB液體培養基，在，250r/min培養4 證；用移液器將培養液轉移至YEB固體培養基(含100 μ g/ml利福平，50 μ g/ml卡那霉素)表面，均勻涂布于整個平板；倒置培養1 2d，可看到單克隆，挑取單菌落用微量堿法提取質粒，進行PCR 和酶切檢測，獲得重組農桿菌細胞。實施例3 轉基因植株的獲得(1)本生煙草(Nicotiana tabacum)種子，播種于MS培養基中，25°C培養至5 6 片真葉期，備用。(2)挑取實施例2獲得的重組農桿菌(攜帶重組質粒的農桿菌單菌落)接種于含 50mg/L卡那霉素的YEP培養基中，，250rpm，振蕩培養4 至對數生長后期，將菌液用 MS液體培養基稀釋10倍待用。(3)取步驟(1)培養的煙草葉片剪切成5mmX5mm小塊，置于MS預分化培養基中， 280C，光照為16h/d，2000Lux,預培養2d，獲得預培養后的煙草葉片外植體。(4)將步驟( 預培養后的煙草葉片外植體浸入上述步驟( 菌液中5 lOmin， 用滅菌濾紙吸干多余菌液，轉入MS基本培養基，弱光，280C，共培養2d。
(5)將步驟(4)共培養后的煙草葉片外植體先用含氨芐青霉素250mg/L的無菌水洗滌3次，再用含氨芐青霉素250mg/L的MS培養基洗滌1次，然后用濾紙吸干，轉入含卡那霉素100mg/L，氨芐青霉素250mg/L的MS培養基上，25°C恒溫培養至芽長至Icm時，切下芽后，將芽轉入含卡那霉素50mg/L，氨芐青霉素250mg/L的MS生根培養基中，25 °C培養促進生根，生根后，移入無菌土的花盆中，溫室中25°C培養收種子，獲得T1、T2和Τ3代轉基因煙草種子。(6)轉基因陽性植株的鑒定將步驟(5)中獲得的Τ1、Τ2和Τ3代轉基因煙草種子先用70%乙醇消毒30 60s，10%次氯酸鈉消毒15min，用滅菌水漂洗至少4次；去盡水加入0.2%的瓊脂，將種子均勻分布到V2MS培養基(含50mg/L卡那霉素)表面；轉入光照培養箱中培養10天，葉片顏色為綠色的幼苗即為陽性苗(煙草轉基因陽性植株)，并提取煙草轉基因陽性植株葉片基因組DNA，禾Ij用PCR驗證獲得的轉基因陽性植株。實施例4 啟動子提高根部基因表達能力分析將上述實施例3獲得的T3代煙草轉基因陽性植株分別置于NaCl (200mM)，甘露醇 (300mM)和聚乙二醇(15% )脅迫條件下，或葉面噴灑水楊酸(5mM)，脫落酸(100 μ M)和茉莉酸(100 μ Μ)，并以相應無菌水處理作為對照。對小時后，GUS染色檢測轉基因煙草中 PsPR10P796啟動子下游⑶S基因表達活性，結果見圖1，(Α B)為Τ3代對照處理轉基因煙草；(C H) Τ3代轉基因煙草分別利用以下信號分子處理=NaCl，甘露醇，聚乙二醇，脫落酸，茉莉酸，水楊酸。通過以上脅迫誘導和信號分子誘導實驗，發現Ι^Ι^10Ρ796啟動子能夠激活下游⑶S基因表達活性顯著上調，達到1200pM Hig-1Iiiirr1,說明I^raiOP796啟動子具有較高的根特異誘導表達能力。該基因可以轉化水稻等農作物，提高其抗脅迫能力，具有重大的經濟和社會價值。
權利要求
1.一種I^PR10P796啟動子，其特征在于所述啟動子含有下列任意一組核苷酸序列a、 SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列；b、與SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列互補的序列。
2.如權利要求1所述的I^raiOP796啟動子，其特征在于所述啟動子為含有SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列的啟動子。
3.一種DNA構建體，其特征在于所述DNA構建體包含權利要求1所述的Ι^Ι^10Ρ796啟動子以及與之進行可操作連接的基因序列。
4.一種載體，其特征在于所述載體含有權利要求1所述的啟動子或權利要求3所述的 DNA構建體。
5.一種重組細胞，其特征在于所述的重組細胞包含權利要求1所述的啟動子或權利要求3所述的DNA構建體或權利要求4所述的載體。
6.如權利要求5所述的重組細胞，其特征在于所述的重組細胞為重組大腸桿菌細胞或重組農桿菌細胞。
7.一種含有權利要求1或2所述的啟動子或權利要求3所述的DNA構建體或權利要求 4所述的載體或權利要求5所述重組細胞的植物愈傷組織或植物。
8.如權利要求7所述的植物愈傷組織或植物為煙草。
9.如權利要求1或2所述的PsPR10P796啟動子在植物抗逆基因工程中的應用。
10.如權利要求9所述的I^raiOP796啟動子在植物抗逆基因工程中的應用，其特征在于所述的應用為I^raiOP796啟動子在在抗逆轉基因煙草中的應用，將抗逆基因置于 PsPR10P796啟動子下游，構建植物表達載體，將載體導入煙草，得到抗逆轉基因煙草。
全文摘要
本發明公開了一種PsPR10P796啟動子、DNA構建體、載體、重組細胞、植物愈傷組織或植物及所述的PsPR10P796啟動子在植物抗逆基因工程中的應用，所述啟動子含有下列任意一組核苷酸序列a、SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列；b、與SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列互補的序列；本發明PsPR10P796啟動子具有較高的根特異誘導表達活性，能夠提高下游抗逆基因根特異轉錄水平，從而能夠增強轉基因植物抗逆能力。
文檔編號C12N1/21GK102559675SQ20111038431
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月28日 優先權日2011年11月28日
發明者徐祥彬, 王慧中 申請人:杭州師范大學