專利名稱：一種克隆表達腈水合酶調控蛋白的方法
技術領域：
一種克隆表達腈水合酶調控蛋白的方法，具體涉及一種在大腸桿菌BL21中表達腈水合酶調控蛋白的方法。
背景技術：
腈水合酶(Nitrilehydratase，簡稱 NHase，EC 4. 2. 1. 84)，是一種催化腈基化合物轉變為酰胺基化合物的金屬酶。用這種酶所生產的丙烯酰胺已近百萬噸，占整個丙烯酰胺產量的三分之一。生物技術相對于傳統的化學法有著成本低、能耗少、少污染的優勢。目前，在美國、日本、法國等發達國家，這項生物技術正在取代傳統的化學法。在我國，腈水合酶合成丙烯酰胺的生物技術雖然起步較晚，但發展很快，2008年數據統計，我國生物法生產的丙烯酰胺占整個丙烯酰胺產量的41%。丙烯酰胺是一種應用廣泛的基礎化工原料，在石油開采、造紙、裝潢等方面發揮著重要的作用。隨著市場的不斷拓展，對丙烯酰胺的需求也在不斷增長。另外這種酶也被應用在尼克酰胺的生產上。尼克酰胺是一種B組維生素，以輔酶I及輔酶II的形式參與機體代謝，在人體和動物代謝方面起著十分重要的作用，廣泛應用在醫藥、食品添加劑及飼料生產上。腈水合酶的廣泛應用促使科學工作者開始研究這種金屬酶的合成機制和催化機理。腈水合酶按所含金屬離子的不同分為含鐵和含鈷兩種，按基因結構的不同又可以分為四類。雖然它們催化的是同一類化學反應，這幾類酶的合成模式卻不同，這些不同突出表現在金屬離子攝取方式的不同。其中第一類和第二類腈水合酶中鈷離子的攝取機理已經判明，而第三類還沒有報道，第四類腈水合酶(含鐵型)的相關結論也不明確。阻礙探明第三類鈷離子攝取機理的關鍵原因就是該類腈水合酶(以惡臭假單胞菌腈水合酶為代表)調控蛋白目前尚無成功克隆表達的方法。其原因在于目前惡臭假單胞菌中腈水合酶調控基因序列的ORF部分報道有誤，而且即使正確識別該調控蛋白的0RF，該調控蛋白在SDS-PAGE上也很難檢測到。

發明內容
本發明提供了一種識別腈水合酶調控蛋白的開放閱讀框，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。本發明還提供了一種應用上述開放閱讀框克隆表達腈水合酶調控蛋白的方法。為解決上述問題，提供技術方案如下1)從NCBI上下載GenBank號為U89363. 1的序列并且識別SEQ ID NO. 1 ；2)在調控蛋白基因序列前加SD序列(AAGGAG)和His-tag序列；3)將上一步驟中構建的序列串聯在腈水合酶成熟酶下游克隆到pET_Ma(+)，導入大腸桿菌BL21誘導表達；4) HPLC檢測改造后腈水合酶酶活。本發明所述腈水合酶基因是來源于惡臭假單胞菌(I^eudomonas put i da)NRRL-18668 ( "A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase，，發表在 1997 的 Biochemistry)。
本發明的詳細的步驟為
(1)獲得正確的調控蛋白基因序列并識別正確的ORF
通過查閱惡臭假單胞菌中腈水合酶基因序列設計引物分別正確擴增成熟酶基因序列和調控蛋白基因序列。由于目前惡臭假單胞菌中腈水合酶調控基因序列的ORF部分報道有誤(該調控蛋白基因序列有3種可能的0RF)，而且該調控蛋白在SDS-PAGE很難檢測到，所以給正確識別調控蛋白的ORF增大了難度。通過嘗試各種ORF并且在該調控蛋白N端加His-tag保護，對成功表達出有活性調控蛋白的0RF，最終確定為正確的調控蛋白ORF ；
(2)調控蛋白基因序列N端加His-tag
大腸桿菌BL21中表達惡臭假單胞菌中天然的腈水合酶全序列，國際上已多有報道其調控蛋白不能成功表達，通過在調控蛋白基因序列N端加His-tag，可成功表達調控蛋白；
(3)重疊PCR串聯腈水合酶成熟酶與調控蛋白基因序列
通過重疊PCR將腈水合酶N端加有His-tag的調控蛋白基因序列串聯在成熟酶基因序列下游；
(4)克隆到pET_Ma(+)導入大腸桿菌BL21中表達
將上一步驟中構建的腈水合酶全序列克隆到pET_Ma(+)導入大腸桿菌BL21中誘導表達；
(5) HPLC檢測改造后腈水合酶酶活
腈水合酶HPLC檢測條件流動相磷酸乙腈緩沖液；檢測波長210nm ；色譜柱采用 C18 柱；
(6)腈水合酶調控蛋白N端測序
將表達出來的蛋白過鎳柱純化后N端測序，測序結果(見附圖幻為His-tag對應序列，而這個His-tag是我們人為添加的，這就說明該蛋白就是腈水合酶調控蛋白，為進一步解析腈水合酶金屬離子攝取機理和改進腈水合酶的工業化生產工藝打下良好的基礎。
本發明的有益效果本發明提供了一種克隆表達腈水合酶調控蛋白的方法，該方法能在大腸桿菌BL21中成功表達腈水合酶調控蛋白。


圖1.腈水合酶全基因PCR
1、蛋白分子量標準；2、腈水合酶全基因PCR(調控蛋白基因N端加His-tag)。
圖2.腈水合酶表達的SDS-PAGE電泳圖
1、蛋白分子量標準；2、(含pET_Ma(+)和腈水合酶基因全序列其中調控蛋白N端加His-tag)全細胞。
圖3.腈水合酶調控蛋白純化后N端測序圖
具體實施例方式
材料和檢測方法
菌種為惡臭假單胞菌(I^seudomonasputic^NRRL-lSeeS，相關文獻"A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase，，發表在 1997 的 Biochemistry上。腈水合酶HPLC檢測條件流動相磷酸乙腈緩沖液；檢測波長210nm ；色譜柱為C18柱。實施例11)獲得正確的調控蛋白基因序列并識別正確的ORF通過查閱惡臭假單胞菌中腈水合酶基因序列設計引物分別正確擴增成熟酶基因序列和調控蛋白基因序列。由于目前惡臭假單胞菌中腈水合酶調控基因序列的ORF部分報道有誤(該調控蛋白基因序列有3種可能的0RF)，而且該調控蛋白在SDS-PAGE很難檢測到，所以給正確識別調控蛋白的ORF增大了難度。通過嘗試各種ORF并且在該調控蛋白N端加His-tag保護，對成功表達出有活性調控蛋白的0RF，最終確定為正確的調控蛋白ORF ；2)調控蛋白基因序列N端加His-tag大腸桿菌BL21中表達惡臭假單胞菌中天然的腈水合酶全序列，國際上已多有報道調控蛋白不能成功表達，通過在調控蛋白基因序列N端加His-tag，可成功表達調控蛋白；3)重疊PCR串聯腈水合酶成熟酶與調控蛋白基因序列通過重疊PCR將腈水合酶N端加有His-tag的調控蛋白基因序列串聯在成熟酶基因序列下游；4)克隆到pET_Ma(+)導入大腸桿菌BL21中表達將上一步驟中的腈水合酶全序列克隆到pET_Ma(+)導入大腸桿菌BL21中誘導表達；5) HPLC檢測改造后腈水合酶酶活腈水合酶HPLC檢測條件流動相磷酸乙腈緩沖液；檢測波長210nm ；色譜柱采用 C18 柱；6)腈水合酶調控蛋白N端測序將表達出來的蛋白過鎳柱純化后N端測序，測序結果(見附圖3)為His-tag對應序列，而這個His-tag是我們人為添加的，這就說明該蛋白就是腈水合酶調控蛋白，為進一步解析腈水合酶金屬離子攝取機理和改進腈水合酶的工業化生產工藝打下良好的基礎。
權利要求
1.一種識別腈水合酶調控蛋白的開放閱讀框，其特征在于，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1。
2.一種克隆表達腈水合酶調控蛋白的方法，是在權利要求1所述開放閱讀框前端加SD 序列和His-tag，與腈水合酶成熟酶基因串聯，在大腸桿菌BL21中共表達。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述腈水合酶基因序列來源于惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL-18668。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，構建pUC19-AB(his-tag)P克隆載體和 pET-24a(+) -AB (his-tag)P 表達載體。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述表達宿主菌為大腸桿菌BL21。
6.如權利要求2-5所述的任一方法，其特征在于，所述表達腈水合酶調控蛋白的重組大腸桿菌發酵培養基為1.2%胰蛋白胨，2.4(%酵母提取物，0.4(%甘油，1711111^2 04， 72mMK2HP04。
全文摘要
本發明公開了一種克隆表達腈水合酶調控蛋白的方法，是采用在腈水合酶調控蛋白基因序列N端加His-tag，與腈水合酶成熟酶基因串聯，在大腸桿菌BL21中共表達，屬于基因克隆技術領域。本發明方法操作簡單，具有較高的效率和成功率。
文檔編號C12R1/19GK102492697SQ201110384089
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月28日 優先權日2011年11月28日
發明者劉義, 周哲敏, 崔文璟 申請人:江南大學