專利名稱：含有雙歧桿菌提取物的脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性增進(jìn)用以及皮膚細(xì)胞增殖用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及維持并增進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞的特性的干細(xì)胞性增進(jìn)用組合物以及皮膚細(xì)胞增殖用組合物。
背景技術(shù)：
皮膚為構(gòu)成人體的器官中最大的器官，占我們身體體積的約16%，面積為1. 8m2， 厚度為2 4mm，重量為約3kg，由表皮、真皮以及皮下脂肪層構(gòu)成。這種皮膚與外部環(huán)境直接接觸而起到使人體免受人體有害微生物之類的多種有害因子和紫外線等外部刺激的影響的重要的保護(hù)膜作用，并且是營造全身的代謝所需的生化功能的對生命維持必不可少的器官。尤其，存在于真皮下方的皮下脂肪層由脂肪細(xì)胞(adipocyte)的小葉構(gòu)成，針對外部的熱量起到保護(hù)皮膚內(nèi)部的器官以及吸收沖擊的緩沖作用，將營養(yǎng)成分以甘油三酸酯 (Triglyceride)的形態(tài)儲存在稱之為脂肪體(Lipid droplet)的細(xì)胞小器官中，需要時(shí)作為能量源來使用。但是，隨著年齡的增加，皮膚因自然性因素和各種外部刺激而受到損傷， 尤其，真皮中左右彈性的膠原纖維(膠原蛋白)、彈性纖維(彈性蛋白)的活性以及表達(dá)降低，從而彈性降低的同時(shí)皮下脂肪中的脂肪生成也減少，結(jié)果皮膚全面性地?zé)o法正常實(shí)現(xiàn)各構(gòu)成細(xì)胞的原本的功能。因此，現(xiàn)在廣泛使用的方法為脂肪移植手術(shù)，它是利用具有郁金香針(tulip needle)形狀的尖部不鋒利的針的注射器，采集自身的脂肪而移植到看上去彈性降低的皮膚的各個(gè)部位的手術(shù)。但是，有報(bào)告指出，在脂肪移植手術(shù)以后，移植體積的 40 60%重新被吸收到體內(nèi)，皮膚薄且皮下脂肪少的部位上進(jìn)行的脂肪移植手術(shù)中被指出存在能夠摸到細(xì)胞塊等問題，且實(shí)際上移植的脂肪的生存率和生存時(shí)間無法達(dá)到預(yù)期而發(fā)生需要再次進(jìn)行移植的情形。因此，對能夠代替存在這些問題的脂肪移植手術(shù)且能夠增加足夠的皮下脂肪層的組合物的要求提高。最近，以抑制作為皮膚彈性減少的原因的膠原蛋白和彈性蛋白的減少為目的而開發(fā)并使用的維生素A和視黃酸等類維生素A雖然能夠表現(xiàn)出卓越的彈性改善效果，但存在對皮膚只使用少量也會產(chǎn)生刺激的缺陷。因此，最近為了解決這種原料的皮膚刺激問題而對利用更加安全且無皮膚刺激的原料的化妝品的開發(fā)的要求升高。皮膚的基本結(jié)構(gòu)由皮下脂肪組織來維持，這種皮下脂肪組織起到左右皮膚的體積和強(qiáng)度的作用，因此增加脂肪組織的體積會成為對維持皮膚的飽滿感的較好的解決方式， 由此為了維持以及增進(jìn)皮膚的飽滿感而需要開發(fā)沒有皮膚刺激且能夠增加脂肪組織的體積的組合物。另一方面，存在于皮膚基底層中的皮膚的角朊干細(xì)胞(Keratinocyte stem cells,KSC)被指出在位于皮膚最外側(cè)的表皮(印idermis)中表現(xiàn)出再生能力。角朊干細(xì)胞持續(xù)分裂而大體上生成兩種細(xì)胞，其中之一是進(jìn)行自我復(fù)制(self-renewal)而制造的一模一樣的干細(xì)胞，另一個(gè)是過渡放大細(xì)胞(Transit Amplifying Cells, TA cells) 0過渡放大細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增并進(jìn)行初期分化而成為角質(zhì)形成細(xì)胞(Keratinocyte cells)，繼續(xù)進(jìn)行分化而這些被擠到皮膚表面上。在此過程中，角質(zhì)形成細(xì)胞引起分化(Differentiation)和角化(Keratinazation)而形成角質(zhì)層，并在3 4周后從角質(zhì)層中脫落。上述角朊干細(xì)胞以及過渡-放大細(xì)胞一般以普通基底層細(xì)胞的約4-7%左右的極低的量進(jìn)行分布，增加角朊干細(xì)胞的數(shù)量不比增加過渡放大細(xì)胞的數(shù)量容易，且由于沒有分布在相對較廣的區(qū)域，因此給研究帶來較大的難度。由此，有待開發(fā)出表現(xiàn)對角朊干細(xì)胞以及過渡-放大細(xì)胞的增殖能力的組合物。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種沒有皮膚刺激且增進(jìn)能夠增加脂肪組織的脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性，并且能夠增加皮膚飽滿感的組合物。另外，另一目的在于提供一種使角朊干細(xì)胞以及過渡-放大細(xì)胞增殖同時(shí)表現(xiàn)出皮膚細(xì)胞再生能力的組合物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，提供一種含有雙歧桿菌提取物作為有效成分的脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性增進(jìn)用組合物。另外，本發(fā)明提供一種含有雙歧桿菌提取物作為有效成分的皮膚細(xì)胞增殖用組合物。另外，本發(fā)明提供一種含有雙歧桿菌提取物作為有效成分的用于增進(jìn)皮膚飽滿感的皮膚美容或整形用組合物。另外，本發(fā)明提供一種含有雙歧桿菌提取物作為有效成分的用于增進(jìn)皮膚飽滿感的皮膚外用劑組合物。另外，本發(fā)明提供包括用雙歧桿菌提取物對皮膚進(jìn)行處理的步驟的通過存進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖而進(jìn)行的皮膚美容方法。本發(fā)明的組合物含有雙歧桿菌提取物作為有效成分，從而增進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性，由此對美容或整形為目的的脂肪組織的增加有效。因此，本發(fā)明的組合物能夠增進(jìn)皮膚飽滿感，促進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞的再生，恢復(fù)損傷的皮下脂肪的功能，從而能夠作為用于增進(jìn)皮膚飽滿感的美容或整形用組合物而使用，并且能夠作為用于增進(jìn)皮膚飽滿感的皮膚外用劑組合物來使用。另外，本發(fā)明的組合物能夠促進(jìn)與表皮再生相關(guān)的皮膚表皮基底層的角朊干細(xì)胞和過渡-放大細(xì)胞的增殖，因此能夠促進(jìn)皮膚細(xì)胞的再生。


圖1為確認(rèn)雙歧桿菌提取物處理下的脂肪來源干細(xì)胞的細(xì)胞毒性的圖表。圖2為向脂肪來源干細(xì)胞施加氧化脅迫后，用雙歧桿菌提取物進(jìn)行處理而對代表脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性的特征的基因的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行比較的圖表。圖3為向脂肪來源干細(xì)胞施加氧化脅迫后，用雙歧桿菌提取物進(jìn)行處理而對代表脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性的特征的蛋白質(zhì)的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行比較的圖表。圖4為確認(rèn)在雙歧桿菌提取物的處理下的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞毒性的圖表。圖5為向皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞施加紫外線后，用雙歧桿菌提取物進(jìn)行處理而對代表皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的干細(xì)胞性的特征的基因的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行比較的圖表。
具體實(shí)施例方式
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以下，詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明提供一種含有雙歧桿菌提取物作為有效成分的脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性增進(jìn)用組合物。上述干細(xì)胞性(sternness)是指帶有干細(xì)胞的自我再生能力和動態(tài)平衡且具有干細(xì)胞的活性的狀態(tài)；干細(xì)胞性增進(jìn)是指增加干細(xì)胞的活性。雙歧桿菌是制造對人體有用的代謝產(chǎn)物且安全到能夠作為食品原料來使用的菌。本發(fā)明的雙歧桿菌提取物通過培養(yǎng)雙歧桿菌并用勻漿器使細(xì)胞破裂而獲得。該提取物含有雙歧桿菌的代謝成分、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁成分和多糖體等。本發(fā)明的一實(shí)施例中，上述脂肪來源干細(xì)胞(Adipose derived stem cell =ADSC) 是人脂肪來源干細(xì)胞(human adipose derived stem cells，hADSCs)。本發(fā)明的一實(shí)施例中，上述組合物使脂肪組織增加而使皮膚增加飽滿感。本發(fā)明的一實(shí)施例中，上述組合物能夠增加作為脂肪來源干細(xì)胞標(biāo)記物 (益只1 口 !"^I )的分化群 29 (Cluster of Differentiation 29 以下稱之為 CD29)、分化群 44 (Cluster of Differentiation 44 以下稱之為 CD44)、分化群 73 (Cluster of Differentiation 73 以下稱之為 CD73)或分化群 105 (Cluster of Differentiation 105 以下稱之為⑶10 的表達(dá)量。與陰性對照組比較，⑶四、⑶44、⑶73或⑶105的表達(dá)量的增加意味著脂肪來源干細(xì)胞的活性的增加。⑶四為整合素^Kintegrin beta 1)的別稱，是脂肪來源干細(xì)胞的標(biāo)記物，⑶44通過Wnt信號(signaling)活性而增加脂肪來源干細(xì)胞的活性。⑶73是5'-核苷酸酶(5:nUCle0tidase)的別稱，是將核苷酸轉(zhuǎn)化為核苷的酶，是脂肪來源干細(xì)胞的標(biāo)記物，CD105為內(nèi)皮糖蛋白(Endoglin)的別稱，是TGi^bW 受體的一部分，是脂肪來源干細(xì)胞的標(biāo)記物。本發(fā)明的一實(shí)施例中，相對于組合物總重量，上述組合物可含有0. 0001 10重量％的雙歧桿菌提取物、可優(yōu)選含有0. 0001 0. 1重量％、可更優(yōu)選含有0. 0001 0. 001
重量％。未達(dá)到0. 0001重量％時(shí)，效果甚微；若超過10重量％時(shí)，存在顯示細(xì)胞毒性的問題。本發(fā)明的一實(shí)施例提供一種含有雙歧桿菌提取物作為有效成分的皮膚細(xì)胞增殖用組合物。上述皮膚細(xì)胞為角朊干細(xì)胞(Keratinocyte Stem Cell 以下稱之為KSC)或過渡放大細(xì)胞(Transit-Amplifying cell 以下稱之為 TA cell)。根據(jù)上述組合物，可通過過渡放大細(xì)胞的增殖促進(jìn)來使皮膚表皮再生，過渡放大細(xì)胞與角朊干細(xì)胞一起，經(jīng)不斷的細(xì)胞分裂來克服角質(zhì)形成細(xì)胞脫落所致的表皮損失，起到使表皮再生的作用。因此，上述組合物可使皮膚再生或防止皮膚老化。另外，本發(fā)明中定義的用語“皮膚再生”是包括針對全面性的皮膚老化以及皮膚表皮等上誘發(fā)的傷口等而生成新的角質(zhì)形成細(xì)胞的能力的廣義的概念。具體而言，皮膚再生是指通過存在于皮膚表皮的基底層中的角朊干細(xì)胞的分裂而生成的過渡放大細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增，且進(jìn)行初期分化而變成角質(zhì)形成細(xì)胞，擠到皮膚表面上而引起分化(Differentiation)和角化(Keratinazation)的同時(shí)構(gòu)成角質(zhì)層的所有過程。 其中，皮膚再生的核心過程在于存在于基底層中的角朊干細(xì)胞和該細(xì)胞的子細(xì)胞即過渡放大細(xì)胞的增殖。發(fā)生了只有皮膚的表面部分消失的“擦傷”、被撓時(shí)出現(xiàn)的“裂傷”、火所致的燒傷等外部的物理性、化學(xué)性環(huán)境所致的皮膚損傷時(shí)，為了將此盡快恢復(fù)需要存在于皮膚基底層且左右皮膚再生的角朊干細(xì)胞和過渡-放大細(xì)胞的活躍的增殖。一般，年少時(shí)，即使發(fā)生皮膚損傷不會留下疤痕，但年老后發(fā)生皮膚損傷時(shí)會留下疤痕的原因也是因?yàn)槠つw再生所需的角朊干細(xì)胞和過渡放大細(xì)胞的增殖的水平程度根據(jù)年齡顯著降低的緣故。艮口， 若老化發(fā)展，這些細(xì)胞的增殖程度會降低，這意味著皮膚再生能力的減退，可導(dǎo)致傷口等的恢復(fù)被延遲，或使皮膚彈性減少嚴(yán)重。利用上述皮膚細(xì)胞增殖用組合物，可將增殖的皮膚細(xì)胞移植到需要角朊干細(xì)胞的個(gè)體上。如通過下述實(shí)驗(yàn)例獲得的結(jié)論，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)將根據(jù)本發(fā)明的含有雙歧桿菌提取物作為有效成分的皮膚細(xì)胞增殖用組合物應(yīng)用在皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞時(shí)，會有效增加角質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。上述角質(zhì)干細(xì)胞以皮膚表皮基底層約4-7%左右的極低的量來分布，如前面所述， 對使表皮再生起到重要作用。因此，通過利用根據(jù)本發(fā)明的組合物的角朊干細(xì)胞數(shù)的增加， 可以提高用于傷口恢復(fù)的皮膚再生能力，能夠防止由皮膚再生能力的減退所致的皮膚彈性降低以及皮膚老化的加深。上述組合物能夠增加表達(dá)分化群71 (Cluster of Differentiation 71 以下稱之為⑶71)和整合素α6(α6 integrin)的過渡放大細(xì)胞的標(biāo)記物的表達(dá)，且上述⑶71以及整合素α 6為對過渡放大細(xì)胞具有特異性的標(biāo)記物蛋白質(zhì)。上述CD71蛋白質(zhì)也稱之為轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)受體，只存在于基底層中。具體而言，轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferring)蛋白質(zhì)與隨著細(xì)胞血流而流動的鐵成分結(jié)合，上述CD71蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferring)蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用，經(jīng)過稱之為受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞(receptor mediated transferrin endocytosis)的過程，起到向細(xì)胞內(nèi)供給鐵成分的作用。活性化的細(xì)胞或增殖的細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)需要很多鐵分，這時(shí)CD71蛋白質(zhì)的表達(dá)會增加。上述整合素α 6對細(xì)胞的相互轉(zhuǎn)達(dá)(cellular communication)進(jìn)行介導(dǎo)，能夠影響細(xì)胞移動、增殖以及分化等多種領(lǐng)域的細(xì)胞功能，且在整合素α 6沒有表達(dá)時(shí)會發(fā)生嚴(yán)重的皮膚水泡。蛋白63 (protein63 以下稱之為p63)為代表性的角朊干細(xì)胞標(biāo)記物 (Keratinocyte stem cell marker)，是只在干細(xì)胞中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)。完全沒有 P63的鼠根本就不會生成表皮，在發(fā)生期間內(nèi)死亡，并且在將活性降低為一半時(shí)皮膚全面發(fā)生異常，加速老化而壽命縮短30%。在人身上發(fā)生p63的突變時(shí)在發(fā)生階段中形成表皮的外胚層(Ectoderm)無法正常發(fā)育而引發(fā)導(dǎo)致顎裂及手腳指畸形的EEC綜合征(EEC Syndrome ；Ectrodactyly Ectodermal dysplasia Cleft lip Syndrome)。從上述石if究可明確，P63對表皮干細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)和表皮層的再生起到非常重要的作用。本發(fā)明的組合物使作為上述角朊干細(xì)胞標(biāo)記物的P63的表達(dá)量增加。本發(fā)明的一實(shí)施例中，相對于組合物總重量，上述組合物含有0. 0001 10重量％ 的雙歧桿菌提取物、可優(yōu)選含有0.0001 0. 1重量％、可更優(yōu)選含有0. 0001 0. 001重量％。未達(dá)到0. 0001重量％時(shí)，其效果甚微；超過10重量％時(shí)，存在顯示細(xì)胞毒性的問題。本發(fā)明的一實(shí)施例提供一種含有雙歧桿菌提取物作為有效成分的用于增進(jìn)皮膚飽滿感的皮膚美容或整形用組合物。本發(fā)明的一實(shí)施例中，相對于組合物總重量，上述組合物含有0. 0001 10重量％的雙歧桿菌提取物、可優(yōu)選含有0. 0001 0. 1重量％、更優(yōu)選含有0. 0001 0. 001重量％。 未達(dá)到0. 0001重量％時(shí)，其效果甚微；超過10重量％時(shí)，存在顯示細(xì)胞毒性的問題。上述組合物例如可用于以下目的使用，即通過形成乳房組織而進(jìn)行的隆胸，微細(xì)脂肪移植術(shù)、自身脂肪移植術(shù)等增進(jìn)臉部皮膚的飽滿感而去除八字皺紋、眉宇皺紋以及維持彈性，但并非僅限于此。上述組合物可根據(jù)藥學(xué)領(lǐng)域的通常方法來制成適于向患者體內(nèi)給藥的單位給藥型制劑來進(jìn)行給藥。符合此目的的劑型優(yōu)選為作為非口服給藥劑型的注射劑或局部給藥用制劑等。注射用劑型優(yōu)選為等滲水溶液或懸濁液。但此時(shí)能夠?qū)⑼ǔＪ褂玫奶畛鋭⒃隽魁RU、結(jié)合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑等稀釋劑或塑形劑一同使用。這樣制備的本發(fā)明的制劑可根據(jù)通常的方法經(jīng)非口服，例如向特定部位直接給藥。此時(shí)，組合物注入利用注射器來實(shí)現(xiàn)。上述組合物的1日給藥量為IXIO5到IXIO7細(xì)胞/kg體重、優(yōu)選為5X IO5到5X IO6細(xì)胞/kg體重，可分成1次或數(shù)次來給藥。但是，應(yīng)理解，有效成分的實(shí)際給藥量應(yīng)根據(jù)所要分化以及增殖的脂肪細(xì)胞的量、給藥途徑、患者的體重、年齡以及性別等多種相關(guān)因素來確定，因此，上述給藥量不論是在任何方面上都并非用以對本發(fā)明范圍進(jìn)行限定。本發(fā)明的一實(shí)施例提供一種含有雙歧桿菌提取物作為有效成分的用于增進(jìn)皮膚飽滿感的皮膚外用劑組合物。本發(fā)明的一實(shí)施例中，相對于組合物總重量，上述組合物含有0. 0001 10重量％ 的雙歧桿菌提取物、可優(yōu)選含有0.0001 0. 1重量％、可更優(yōu)選含有0. 0001 0. 001重量％。未達(dá)到0. 0001重量％時(shí)，效果甚微；超過10重量％時(shí)，存在顯示細(xì)胞毒性的問題。上述皮膚外用劑組合物可以為化妝料組合物或藥物組合物。上述化妝料組合物的劑型沒有特別限制，可按需要適當(dāng)進(jìn)行選擇。例如制備成柔膚水、營養(yǎng)化妝水、按摩霜、精華、營養(yǎng)霜或面膜等劑型，但并非僅限于此。上述藥物組合物可以為洗劑、軟膏、凝膠、霜、貼片或噴霧劑等經(jīng)皮膚給藥型劑型， 但并非僅限于此。就根據(jù)各劑型的皮膚外用劑組合物而言，除了上述本發(fā)明的組合物之外的其它成分可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其它皮膚外用劑的劑型或使用目的等而毫無難度地進(jìn)行適當(dāng)選擇并進(jìn)行配比，此時(shí)，與其它原料一同使用時(shí)可起到協(xié)同效果。另外，本發(fā)明的組合物作為藥物組合物來使用時(shí)，可進(jìn)一步含有防腐劑、穩(wěn)定劑、 可濕性粉劑或乳化促進(jìn)劑、用于滲透壓調(diào)節(jié)的鹽或緩沖劑等藥物輔料以及其它治療上有效的物質(zhì)，根據(jù)通常的方法以多種口服或非口服給藥形態(tài)進(jìn)行劑型化。應(yīng)理解，有效成分的實(shí)際給藥量應(yīng)根據(jù)癥狀的嚴(yán)重度、選擇的給藥途徑、對象的年齡、性別、體重以及健康狀態(tài)等多種相關(guān)因素來決定。通常，有效成分的給藥量為0. OOlmg/kg/日到大約2000mg/kg/日的范圍。更優(yōu)選的給藥量為0. 5mg/kg/日到2. 5mg/kg/日。本發(fā)明的增進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性的組合物適用部位包括身體的所有脂肪組織，不限定在特定部位上，例如，可包括脂肪層少的臉部。另外，上述脂肪組織的增加效果有美容或整形目的的脂肪組織增加效果所致的皮膚飽滿感增加效果、皮膚彈性提高效果、皮膚皺紋改善效果、皮膚再生效果以及皮膚老化防止效果等，但并非限定于此。
本發(fā)明的一實(shí)施例提供包括對皮膚以雙歧桿菌提取物進(jìn)行處理的步驟的通過促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖而進(jìn)行的皮膚美容方法。上述雙歧桿菌提取物為培養(yǎng)雙歧桿菌而用勻漿器使細(xì)胞破裂而獲得的提取物。上述皮膚細(xì)胞增殖還可以在生物體外部進(jìn)行，并可將增殖的皮膚細(xì)胞移植到需要角質(zhì)干細(xì)胞個(gè)體中。以下，通過下述實(shí)施例以及實(shí)驗(yàn)例來對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但這僅僅是用于例示本發(fā)明，本發(fā)明的范圍不被此限定。[實(shí)驗(yàn)例1]研究雙歧桿菌提取物在人脂肪來源干細(xì)胞以及皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中的細(xì)胞毒性將脂肪來源干細(xì)胞在75cm2T-flaSk中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在(X)2培養(yǎng)箱(C02 Incubator)中以37°C，5% CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。一般在第二次或第三次中進(jìn)行了細(xì)胞的傳代培養(yǎng)(passage)。將人脂肪來源干細(xì)胞(humanadipose derived stem cells, hADSCs)從龍沙公司(Lonza，hc.WalkerSVille，MD，USA)購入，并根據(jù)龍沙公司的說明書來進(jìn)行培養(yǎng)。為了研究雙歧桿菌提取物的細(xì)胞毒性，以0. 0001 10%的濃度進(jìn)行處理，并利用CCK-8試劑盒 (Dojindo)確認(rèn)了細(xì)胞毒性程度。雙歧桿菌是購入CLR-Chemisches Laboratorium Dr. Kurt Richter GmbH公司的R印air Complex CLR PF原料而使用(INCI name = Bifida Ferment Lysate)。從圖1的結(jié)果可知，在以0. 001 %的濃度處理時(shí)無細(xì)胞毒性，且達(dá)到了約10%左右的細(xì)胞分裂增進(jìn)效果。將皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞在75cm2T-fIask中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在(X)2培養(yǎng)箱(C02 Incubator)中以37°C，5% CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。一般在第二次或第三次中進(jìn)行了細(xì)胞的傳代培養(yǎng)(passage)。人的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte)從龍沙公司(Lonza，he. Walkersville， MD, USA)購入，并根據(jù)龍沙公司的說明書來進(jìn)行培養(yǎng)。為了研究雙歧桿菌提取物的細(xì)胞毒性，以0. 0001 10%的濃度進(jìn)行處理，并利用CCK-8試劑盒(Dojindo)確認(rèn)了細(xì)胞毒性程度。從圖4的結(jié)果可知，在0.0001 0. 的濃度范圍內(nèi)無細(xì)胞毒性，且得到約10%左右的細(xì)胞分裂增進(jìn)效果。[實(shí)驗(yàn)例2]測定雙歧桿菌提取物對于脂肪來源干細(xì)胞以及皮膚干細(xì)胞/過渡-放大細(xì)胞標(biāo)記物基因的表達(dá)水平的效果脂肪來源干細(xì)胞的氧化脅迫是用過氧化氫(H2O2)以200uM濃度進(jìn)行了 M小時(shí)處理，為了研究脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性增進(jìn)效果，將5%雙歧桿菌提取物添加到培養(yǎng)基內(nèi)。對于皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞而言，以lOOmJ/cm2的UVB照射后，處理了雙歧桿菌提取物。用2ml磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)洗滌細(xì)胞之后，然后， 使用總 RNA 提取試劑(Trizol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)分離了細(xì)胞內(nèi)的 RNA。將分離后的 RNA 用凱杰公司的 RNA 試劑盒 ^jIAGEN RNeasy kt, QIAGEN, Valencia, CA) 再次提純后，使用安捷倫公司的2100型生物分析儀(Agilent 2100BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)確認(rèn)了 RNA 的質(zhì)量(quality)。利用英杰公司的逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Superscript Reverse Transcriptase (RT) kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)從上述RNA合成了 cDNA，將此通過實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real time-reversetranscription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR)進(jìn)行了定量分析。脂肪來源干細(xì)胞中^四、44、73、105基因的表達(dá)圖案變化是利用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的 TaqMan 基因表達(dá)系統(tǒng)(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA) (CD29 基因引物Hs00559595_ml，CD44 基因引物Hs01075861_ml，CD73 基因引物Hs01573922_ml，CD105基因引物Hs00923996_ml)進(jìn)行了評價(jià)，并將其結(jié)果顯示在圖2中。皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中基因的表達(dá)圖案變化是利用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的TaqMan基因表達(dá)系統(tǒng)(TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA)(整合素α 6基因引物:Hs01041011_ml，CD71基因引物:Hs00951083_ml，p63基因引物 Hs00978340_ml)進(jìn)行了評價(jià)，并將其結(jié)果顯示在圖5中。確認(rèn)了各基因的表達(dá)量比陰性對照組增加了約2. 5 4倍左右。這樣的增加在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性，且該統(tǒng)計(jì)是利用雙側(cè) t檢驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，表示了當(dāng)ρ值在0. 05以下時(shí)具有顯著的差異。[實(shí)驗(yàn)例3]通過流式細(xì)胞分析來進(jìn)行的脂肪來源干細(xì)胞的測定將人脂肪來源干細(xì)胞以0. 25%胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)從75cm2Ti瓶中進(jìn)行分離后，以1500rpm使細(xì)胞沉淀5分鐘后，去掉培養(yǎng)液后，加入3ml封閉液封閉緩沖液、2% 胎牛血清(Fetal calf serum :FCS)及 2 % 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin (BSA) KGM-2)，使細(xì)胞懸濁。使細(xì)胞(約IO6個(gè)細(xì)胞)在4°C適應(yīng)(岑告)15分鐘后，將附著有PE_Cy(藻紅蛋白-^cn (phycoerythrin-cyanine))白勺 CD29 (Cat No. 559882) (BD Pharmingen, CA, US)各以100 1加入，在4°C下反應(yīng)45分鐘。另一方面，作為陰性對照組來使用的細(xì)胞中將 PE-Cy5 mouse IgGlk 同種型(Cat No. 555750)也以 100 1 加入，在 4°C下反應(yīng) 45 分鐘。反應(yīng)結(jié)束后用3ml 洗滌緩沖液 O % Bovine Serum Albumin (BSA) KGM-2)洗滌 2 次后，使細(xì)胞懸濁。此后用FACSCalibur (BD Bioscience, San Jose, CA, U. S)觀察脂肪來源干細(xì)胞中表達(dá)CM9的細(xì)胞的數(shù)量的變化，將其表示于圖3、表1中。表 權(quán)利要求
1.一種脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性增進(jìn)用組合物，其中，含有雙歧桿菌提取物作為有效成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞性增進(jìn)用組合物，其中，所述脂肪來源干細(xì)胞為人的脂肪來源干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞性增進(jìn)用組合物，其中，所述組合物通過增加脂肪組織而使皮膚增進(jìn)飽滿感。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞性增進(jìn)用組合物，其中，所述組合物增加作為脂肪來源干細(xì)胞標(biāo)記物的⑶四、⑶44、⑶73或⑶105的表達(dá)量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞性增進(jìn)用組合物，其中，相對于組合物總重量，所述組合物含有0.0001 10重量％的雙歧桿菌提取物。
6.一種皮膚細(xì)胞增殖用組合物，其中，含有雙歧桿菌提取物作為有效成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的皮膚細(xì)胞增殖用組合物，其中，所述皮膚細(xì)胞為角朊干細(xì)胞或過渡放大細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的皮膚細(xì)胞增殖用組合物，其中，所述組合物用于使皮膚再生或防止皮膚老化。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的皮膚細(xì)胞增殖用組合物，其中，所述組合物用于增加作為角朊干細(xì)胞標(biāo)記物的P63的表達(dá)量，或用于增加作為過渡放大細(xì)胞標(biāo)記物的CD71或整合素 α 6的表達(dá)量。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的皮膚細(xì)胞增殖用組合物，其中，相對于組合物總重量，所述組合物含有0.0001 10重量％的雙歧桿菌提取物。
11.一種作為用于增進(jìn)皮膚飽滿感的皮膚美容或整形用組合物，其中，含有雙歧桿菌提取物作為有效成分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的美容或整形用組合物，其中，相對于組合物總重量，所述組合物含有0.0001 10重量％的雙歧桿菌提取物。
13.一種用于增進(jìn)皮膚飽滿感的皮膚外用劑組合物，其中，含有雙歧桿菌提取物作為有效成分。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的皮膚外用劑組合物，其中，相對于組合物總重量，所述組合物含有0. 0001 10重量％的雙歧桿菌提取物。
15.一種通過促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖而進(jìn)行的皮膚美容方法，其中，包括用雙歧桿菌提取物對皮膚進(jìn)行處理的步驟。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的通過促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖而進(jìn)行的皮膚美容方法，其中，所述雙歧桿菌提取物是培養(yǎng)雙歧桿菌、并利用勻漿器使細(xì)胞破碎而獲得的提取物。
全文摘要
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的而提供一種含有雙歧桿菌提取物作為有效成分的脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性增進(jìn)用組合物以及皮膚細(xì)胞增殖用組合物。本發(fā)明的組合物含有雙歧桿菌提取物作為有效成分，從而增進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞的干細(xì)胞性，由此對美容或整形為目的的脂肪組織的增加有用。因此，本發(fā)明的組合物能夠增進(jìn)皮膚飽滿感，促進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞的再生，恢復(fù)損傷的皮下脂肪的功能，因此能夠作為用于增進(jìn)皮膚飽滿感的美容或整形用組合物而使用，并且能夠作為用于增進(jìn)皮膚飽滿感的皮膚外用劑組合物來使用。另外，本發(fā)明的組合物能夠促進(jìn)與表皮再生相關(guān)的皮膚表皮基底層的角朊干細(xì)胞和過渡-放大細(xì)胞的增殖，因此能夠促進(jìn)皮膚細(xì)胞的再生。
文檔編號C12N5/074GK102477410SQ20111038424
公開日2012年5月30日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者盧旻秀, 李泰龍, 沈重鉉, 申東旭, 趙誠雅, 金漢坤, 金知賢, 閔大珍 申請人:株式會社愛茉莉太平洋