專利名稱：一種葡萄糖異構(gòu)酶突變體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種葡萄糖異構(gòu)酶，具體地說涉及一種高轉(zhuǎn)化率葡萄糖異構(gòu)酶突變體及其生產(chǎn)與應用。
背景技術：
葡萄糖異構(gòu)酶(glucose isomerase，GI)，又稱木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase, XI) (EC5.3. 1.5)，可以催化D-葡萄糖等醛糖至D-果糖等相應酮醣的異構(gòu)化反應。因此是工業(yè)生產(chǎn)上大規(guī)模以淀粉制備高果糖漿的關鍵酶之一。果葡糖漿也稱高果糖漿或異構(gòu)糖漿，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)作用，將其中一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，由葡萄糖和果糖而組成的一種混合糖糖漿。高果糖漿是甜度與蔗糖相當、風味純正、營養(yǎng)豐富，且具有協(xié)同增效、冷甜爽口、低熱量、不致齲齒防腐效果佳、吸水性好、發(fā)酵性能好等特點，是可以最佳替代蔗糖使用或取代蔗糖使用的新型甜味劑。此外，果糖代謝過程中不需胰島素的輔助，在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的肝糖生成量是葡萄糖的三倍，具有保肝作用；它還能抑制體內(nèi)蛋白質(zhì)的消耗，有利于運動員和體力勞動者的營養(yǎng)補給。由于果葡糖漿具有比葡萄糖、蔗糖明顯優(yōu)越的保健與營養(yǎng)功效以及良好的食品加工性能，目前被越來越廣泛地應用于飲料、冷食品、糖果、烘焙制品、水果罐頭及蜜餞、果醬等食品加工中，其需求量將不斷增加。果葡糖漿是一種由果糖和葡萄糖所組成的混合物，根據(jù)其果糖含量的不同，目前市場上主要有F42(果糖占42% )和F55(果糖占55% )兩個品種，F(xiàn)55糖漿相對于F42糖漿的主要優(yōu)點在于a. F42糖漿不能在低溫下儲存，易結(jié)晶析出葡萄糖，而F55糖漿則可以在沈 301的范圍內(nèi)儲存；b.在同等碳水化合物的前提下，F(xiàn)42糖漿其甜度只有普通蔗糖甜度75%，而F55糖漿甜度與蔗糖甜度相當；c由于F55糖漿果糖含量更高，其保健價值更高。而根據(jù)目前國內(nèi)的具體生產(chǎn)、技術條件和成本要求，絕大部分生產(chǎn)企業(yè)只能先生產(chǎn)F42 產(chǎn)品，再經(jīng)色譜分離系統(tǒng)的濃縮出F90糖漿(果糖占90% )，再與F42糖漿勾兌出F55糖漿， 如果能直接生產(chǎn)出F55糖漿，則生產(chǎn)投資將大大降低。高溫有利于葡萄糖異構(gòu)轉(zhuǎn)化率的提高，目前，人們已經(jīng)從一些天然嗜熱菌中分離出許多了耐熱性葡萄糖異構(gòu)酶，如 Bacills thermoantarcti. CUS, Thermus aquaticus HB8,Thermotoga neapolitana等。人們對其產(chǎn)生的耐熱葡萄糖異構(gòu)酶進行了純化、定性，肯定了它在制備高糖果漿工業(yè)中的巨大潛力。但由于嗜熱菌苛刻的培養(yǎng)條件、低的細胞產(chǎn)量及90°C以上的異構(gòu)轉(zhuǎn)化溫度造成副產(chǎn)物和色素的大量生成，其產(chǎn)酶并不適合工業(yè)化生產(chǎn)。 所以能在60-70°C下就有55%以上的轉(zhuǎn)化率的葡萄糖異構(gòu)酶真正是果葡糖漿工業(yè)生產(chǎn)所要解決的頭等問題！

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其親本具有NCBI 編碼YPJ89661所示的氨基酸序列，所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體是第243位或244位或284位或286位的氨基酸突變?yōu)橥蛔優(yōu)楦彼?ftx))或絲氨酸(kr)或丙氨酸(Ala)或異亮氨酸(Ile)或蘇氨酸(Thr)或纈氨酸(Val)。所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體為第244位組氨酸、第243位苯丙氨酸分別突變?yōu)楦彼帷⒔z氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體為第243位苯丙氨酸、第244位組氨酸、284位脯氨酸、 286位組氨酸均突變?yōu)楦彼帷⒔z氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體為是286位組氨酸突變?yōu)楦彼帷⒔z氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。編碼本發(fā)明的葡萄糖異構(gòu)酶突變體的基因序列也屬于本發(fā)明要求保護的范圍。本發(fā)明要解決的另一個技術問題是提供一種生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶突變體的方法，具體技術方案如下根據(jù)嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖異構(gòu)酶基因NCBI編碼 CP000088，設計定點突變的突變引物，以攜帶葡萄糖異構(gòu)酶基因的克隆載體為模板進行定點突變構(gòu)建突變體；以質(zhì)粒PT7-7或能表達該酶的載體為表達載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)細胞或能表達該酶的宿主細胞，挑選驗證后的陽性單克隆進行發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明應用于果葡糖漿的生產(chǎn)，應用溫度為60-70°C，應用pH為5. 0-8. 5，應用磷酸鹽濃度為50-100mM、鎂離子濃度為5-8mM。使用本突變體生產(chǎn)果葡糖漿，在上述轉(zhuǎn)化條件下，突變體酶生產(chǎn)果葡糖漿的轉(zhuǎn)化率達到55% -60%，較野生酶高3% -8%左右，此酶突變體解決了長期困擾果葡糖漿工業(yè)生產(chǎn)的技術難題，具有突出的技術進步。


圖1葡萄糖異構(gòu)酶突變體的分離純化SDS-PAGE圖譜M 標準蛋白Marker，1破壁上清液，2熱處理純化后的酶液，3離子交換和凝膠排阻純化后的酶液，圖2葡萄糖異構(gòu)酶突變體的最適溫度圖3葡萄糖異構(gòu)酶突變體的最適pHNaAc-HAc 緩沖液(pH 4. 0-5. 0)，Na-K-PO4 緩沖液(pH 5. 0-9. 0)和 Gly-NaOH 緩沖液(ρΗ9· 0-12. 0)圖4葡萄糖異構(gòu)酶突變體在70°C穩(wěn)定性研究圖5葡萄糖異構(gòu)酶突變體在70°C轉(zhuǎn)化率研究pH7. 5 ( O ), pH5. O(D)
具體實施例方式實施例1、葡萄糖異構(gòu)酶單位點突變體的構(gòu)建根據(jù)嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖異構(gòu)酶基因NCBI編號CP000088， 采用化學全合成法合成親本序列，克隆到PMD18-T，構(gòu)建載體XylA/pMD18-T。根據(jù)親本序列設計定點突變的突變引物，利用快速PCR技術，以載體xylA/pMD18-T為模板，單突變P284S 引物為引物 B-ST-I :5，-AGTGGCTACGACGGATCGCGCCACTTCGACTTCAAGACC-3'(下劃線為突變堿基)引物 B-ST-2 :5，-GGTCTTGAAGTCGAAGTGGCGCGATCCGTCGTAGCCACT-3’ (下劃線為突
變堿基)PCR反應體系為2 X PrimeSTARTM GC Buffer (含Mg2+) 25 μ L，dNTPs (各 2. 5mmol/ L) 4 μ L，正向引物(10 μ Μ) 1 μ L，反向引物(10 μ Μ) 1 μ L，模板 DNA 1 μ L, PrimeSTARTM HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1)0. 5μ L,力口入雙蒸水至 50 μ L。PCR擴增條件為94°C預變性^iin;隨后進行30個循環(huán)(94 °C 10s,60°C 5s, 72°C 4min30s) ；72°C延伸 IOmin ；最后 4°C保溫。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，感受態(tài)細胞在LB固體培養(yǎng)基(含 100 μ g/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，突變質(zhì)粒測序正確，構(gòu)建的突變體命名為xylA-S。實施例2、葡萄糖異構(gòu)酶雙位點突變體的構(gòu)建根據(jù)嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖異構(gòu)酶基因NCBI編號CP000088， 采用化學全合成法合成親本序列，克隆到PMD18-T，構(gòu)建載體XylA/pMD18-T。根據(jù)親本序列設計定點突變的突變引物，利用快速PCR技術，以載體xylA/pMD18-T為模板，雙突變F243I、 H244T，定點突變引物為引物 A-IT-I 5’ -TGGCACGGCAAACTGATCACCATCGACCTCAACGGC-3’ (下劃線為突變堿
基)引物 Α-IT-2 5，-GCCGTTGAGG TCGATGGTGA TCAGTTTGCC GTGCCA-3'(下劃線為突
變堿基)PCR反應體系為2 X PrimeSTARTM GC Buffer (含Mg2+) 25 μ L，dNTPs (各 2. 5mmol/ L) 4 μ L，正向引物(10 μ Μ) 1 μ L，反向引物(10 μ Μ) 1 μ L，模板 DNA 1 μ L, PrimeSTARTM HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1)0. 5μ L,力口入雙蒸水至 50 μ L。PCR擴增條件為94 V預變性^iin ；隨后進行30個循環(huán)(94 °C IOs，60°C 5s， 72°C 4min30s) ；72°C延伸 IOmin ；最后 4°C保溫。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，感受態(tài)細胞在LB固體培養(yǎng)基(含 100 μ g/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，突變質(zhì)粒測序正確，構(gòu)建的突變體命名為xylA-IT。實施例3、葡萄糖異構(gòu)酶四位點突變體的構(gòu)建根據(jù)嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖異構(gòu)酶基因NCBI編號CP000088， 采用化學全合成法合成親本序列，克隆到PMD18-T，構(gòu)建載體XylA/pMD18-T。根據(jù)親本序列設計定點突變的突變引物，利用快速PCR技術，以載體xylA/pMD18-T為模板，雙突變F243I/ H244T，定點突變引物為引物 A-IT-I 5’ -TGGCACGGCAAACTGATCACCATCGACCTCAACGGC-3’ (下劃線為突變堿
基)引物 A-IT-2 :5，-GCCGTTGAGG TCGATGGTGA TCAGTTTGCC GTGCCA-3，(下劃線為突
變堿基)再以載體XylA(FM3I/ffi44T)/pT7-7為模板，雙突變P284S/H286T，定點突變引物為
引物 B-ST-I :5，-AGTGGCTACGACGGATCGCGCACCTTCGACTTCAAGACC-3'(下劃線為突
變堿基)弓丨物 B-ST-2 5，-GGTCTTGAAGTCGAAGGTGCGCGATCCGTCGTAGCCACT-3，(下劃線為突變堿基)PCR 反應體系均為2 XPrimeSTARTM GC Buffer (含 Mg2+) 25 μ L, dNTPs (各 2. 5mmol/L)4y L,正向引物(10 μ Μ) 1 μ L，反向引物(ΙΟμΜ)Ιμ ，模板 DNA IyL, PrimeSTARTM HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1)0. 5μ L,加入雙蒸水至 50 μ L。PCR擴增條件均為94°C預變性^iin ；隨后進行30個循環(huán)(94°C 10s，60°C 5s， 72°C 4min30s) ；72°C延伸 IOmin ；最后 4°C保溫。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，感受態(tài)細胞在LB固體培養(yǎng)基(含 100 μ g/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，突變質(zhì)粒測序正確，構(gòu)建的突變體命名為xylA-ITST。實例4、野生或突變重組葡萄糖異構(gòu)酶的表達與發(fā)酵制備將上述得到的質(zhì)粒與ρΤ7_7載體(商業(yè)化載體)，進行NdeI和HindIII雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，他后抽提質(zhì)粒，得到富集的親本葡萄糖異構(gòu)酶質(zhì)粒和葡萄糖異構(gòu)酶突變體質(zhì)粒。將他們分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)細胞后在LB/Amp (含100 μ g/mL氨芐青霉素)平板上37°C培養(yǎng)，他后挑選轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中37°C 液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)37°C培養(yǎng)池后，降溫至25°C后，用％ig/LIPTG (異丙基硫代- β -D半乳糖苷)誘導培養(yǎng)30h。實例5、野生或突變重組葡萄糖異構(gòu)酶的純化取IOOml培養(yǎng)后的菌體10，000rpm，4°C離心lOmin，去盡上清，加入IOmL PBS緩沖液(50mM KP04, IOmM MgS04, pH 7.5)，充分混勻，ON 10s, OFF 10s，超聲破碎。4°C， 13，OOOrpm,離心30min,上清即為粗酶液，把粗酶液在70°C水浴lOmin, 4°C，13，OOOrpm,離心30min，取上清進行離子柱純化。采用ARTK蛋白純化系統(tǒng)，采用kpharose Fast Flow層析柱，DEAE為其陰離子交換介質(zhì)基團，洗脫液為A液(50mM KP04, 5mMMgS04, pH 7. 5)，B液 (OmM KP04，5mMMgS04，lM NaClpH 7. 5)。對出峰蛋白進行酶活測定，選取合適的洗脫液比例洗脫含目的蛋白的吸收峰。再把目的蛋白用分子排阻色譜進行二次純化，對出峰蛋白進行酶活測定，選取合適的洗脫時間回收含目的蛋白的吸收峰，把目的蛋白用分子用SDS-PAGE 蛋白電泳對粗酶液和不同純化的階段產(chǎn)物進行電泳，比較純化效果(見圖1)。多突變位點、雙突變位點和單突變位點葡萄糖異構(gòu)酶的酶學性質(zhì)基本相同，下文中以實例1中制備的多突變位點葡萄糖異構(gòu)酶為例進行說明。實例6、重組葡萄糖異構(gòu)酶的特性。當以葡萄糖為底物時，葡萄糖異構(gòu)酶的最適溫度為80°C (圖2)，最適pHIO (圖3)， 在70°C具有很高的穩(wěn)定性，半衰期大于30h(圖4)。實例7、HPLC方法分析葡萄糖異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化率。考察兩種pH條件下重組葡萄糖異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化能力，葡萄糖轉(zhuǎn)化體系為5mL，包含 50mM Na-K-P04 緩沖液(pH 7. 5 或 5.0),42% (W/V) D-葡萄糖水溶液，5mM MgS04 水溶液，100U的酶液，70°C水浴，間隔一定時間取樣，樣品于沸水中加熱5min使樣品中的酶失活變性后，稀釋為1/100，12000r/min離心25min，上清經(jīng)0. 45 μ m超濾膜過濾后取500 μ L進行分析。HPLC分析的條件為Agilentl200 HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，色譜柱Aminex HPX-87H Ion Exclusion Cloumn(7. 8mmX300mm)，Agilentl200 示差檢測器；流動相為 0. 0005M H2S04溶液，流速0. 6mL/min ；柱溫50°C ；池溫(檢測器)30V ；進樣量10 μ L。
實驗結(jié)果如圖5，將上述突變體表達獲得的突變酶與野生酶相比，可以發(fā)現(xiàn)，突變體實現(xiàn)了葡萄糖轉(zhuǎn)化率的提高，終產(chǎn)量達到60%。
權(quán)利要求
1.一種葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其特征在于在NCBI登陸號YPJ89661所示的氨基酸序列中進行一個或多個酶的氨基酸位點的取代。
2.權(quán)利要求1所述的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其特征所述氨基酸取代位點為第243位苯丙氨酸、第244位組氨酸、284位脯氨酸、286位組氨酸的一個或其組合。
3.權(quán)利要求2所述的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其特征是第244位組氨酸、第243位苯丙氨酸分別突變?yōu)楦彼帷⒔z氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。
4.權(quán)利要求2所述的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其特征是第243位苯丙氨酸、第244位組氨酸、284位脯氨酸、286位組氨酸均突變?yōu)楦彼帷⒔z氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。
5.權(quán)利要求2所述的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其特征是第286位組氨酸突變?yōu)楦彼帷⒔z氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。
6.權(quán)利要求1-5任一所述突變體應用于葡萄糖到果糖的轉(zhuǎn)化或制備果葡糖漿。
7.權(quán)利要求6所述應用，其特征在于葡萄糖到果糖的轉(zhuǎn)化的處理工藝控制溫度為 70°C，pH 為 7. 5。
8.編碼權(quán)利要求1-5任一所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體的核苷酸序列。
9.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-5任一所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體的方法，其特征是由嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)總DNA獲得葡萄糖異構(gòu)酶基因，NCBI編碼為CP000088，經(jīng)定點突變后，突變基因以質(zhì)粒PT7-7或能表達該酶的質(zhì)粒為表達載體，以E. coli BL2KDE3)或能表達該酶的菌株為表達宿主，實現(xiàn)葡萄糖異構(gòu)酶基因的高效表達。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葡萄糖異構(gòu)酶突變體及其應用，屬于酶基因工程和酶工程領域。本發(fā)明由嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)總DNA獲得高溫葡萄糖異構(gòu)酶基因(NCBI編碼CP000088)，經(jīng)定點突變后，葡萄糖異構(gòu)酶基因以質(zhì)粒pT7-7或能表達該酶的載體為表達載體，以E.coli BL21(DE3)或能表達該酶的菌株為表達宿主，實現(xiàn)高轉(zhuǎn)化率葡萄糖異構(gòu)酶基因的高效表達；該葡萄糖異構(gòu)酶基因全長個1158核苷酸，編碼385個氨基酸，本發(fā)明構(gòu)建了表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化細菌或酵母表達葡萄糖異構(gòu)酶，所獲得的重組酶突變體具有葡萄糖異構(gòu)酶活性，在70℃條件下轉(zhuǎn)化率為60％，比親本的轉(zhuǎn)化率高出7％。該重組葡萄糖異構(gòu)酶的最適溫度為80℃，最適pH＝10，70℃半衰期不低于30h。此酶非常適合食品工業(yè)生產(chǎn)F55高果糖漿應用的需要。
文檔編號C12N15/56GK102443578SQ20111040641
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者吳敬, 鄧輝, 陳堅, 陳晟 申請人:江南大學