專利名稱：磷酸化肌球蛋白和驅動蛋白的激酶的發現的制作方法
技術領域：
: 本發明屬于基礎生命科學，生物化學，細胞生物學，分子生物學,腦科學,神經細胞骨架學和神經細胞信號轉導學等多個領域，創新性地揭示了同時調節細胞肌球蛋白和驅動蛋白的新機理和神經細胞形成及工作的基本原理。
背景技術：
:生命在于運動，探索生命運動的原理是生命科學的最重要領域之一。肌球蛋白(myosin)和驅動蛋白(kinesin)作為細胞運動的主要分子馬達，在肌肉收縮，細胞內物質，小胞和膜細胞器的輸送以及動態細胞骨架的構成和功能上起著重要的作用。細胞微管和微絲的動態和神經細胞軸突的形成，細胞分裂以及細胞移動等有密切的關系。肌球蛋白和驅動蛋白分別與細胞微絲和細胞微管緊密地協作，擔負著各種復雜細胞運動的使命。揭示調節肌球蛋白和驅動蛋白功能的基本分子原理是生命科學家的最熱衷研究領域之一。還沒有關于既磷酸化肌球蛋白也磷酸化驅動蛋白的激酶的報道。模式生物秀麗線蟲和哺乳動物的神經系統在形態學和生物化學上是相似的；一個保存性基因在秀麗線蟲和哺乳動物的不同實驗系里能表達相同的功效。秀麗線蟲的unc-51基因編碼一個從線蟲到人類的進化上具有保存性的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是神經形成所必須的；這個基因的突變引起線蟲的神經形成及運動的欠缺和短粗體形。揭示unc-51基因所編碼的蛋白激酶的底物和其生物化學功能的意義是重要的
發明內容
:本發明的目的在于揭示unc-51基因所編碼的蛋白激酶的重要底物和其生物化學功能，弄清楚神經細胞形成的分子機理，為神經疾病的治療提供嶄新的原理和方法。本發明的內容為: (I)首次揭示肌球蛋白和驅動蛋白都能夠結合UNC-51激酶肌球蛋白及驅動蛋白和UNC-51激酶的體外結合如圖1所示。圖1顯示體外酶聯免疫吸附測定(ELISA)的結果,肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MHC),肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)和驅動蛋白重鏈(myosin heavy chain,KHC)都能夠在體外結合UNC-51激酶。(2)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性既能夠磷酸化肌球蛋白也能夠磷酸化驅動蛋白圖2顯示UNC-51激酶在體外能夠磷酸化肌球蛋白重鏈(MHC)并自我磷酸化。圖3顯示UNC-51激酶在體外能夠磷酸化肌球蛋白輕鏈(MLC)并自我磷酸化。圖4顯示用凝膠移位分析法的結果，UNC-51激酶在體內(HeLa細胞)能夠磷酸化驅動蛋白。圖5表示UNC-51激酶活性通過對肌球蛋白和驅動蛋白的磷酸化反應誘導神經軸突形成的模型。
:圖1肌球蛋白及驅動蛋白和UNC-51激酶的體外結合圖2UNC-51激酶在體外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化圖3UNC-51激酶在體外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化圖4UNC-51激酶在體外磷酸化微管蛋白并自我磷酸化圖5UNC-51激酶活性通過對肌球蛋白及驅動蛋白的磷酸化反應誘導神經軸突形成的模型
具體實施方式
:1肌球蛋白及驅動蛋白和UNC-51蛋白激酶結合的測定用細胞溶解緩沖液溶解表達UNC-51蛋白激酶的HEK293細胞，得到溶胞產物的上清。利用親和層析法從以上溶胞產物的上清純化得到UNC-51蛋白激酶。運用固相酶聯免疫測定法(ELISA)分析肌球蛋白及驅動蛋白和UNC-51蛋白激酶的體外結合。2激酶活性的測定在含有50 μ M末端放射性表記的腺苷三磷酸[Y -32Pl-ATP的Ifepes激酶緩沖反應液(ρΗ7.4)中，進行了 UNC-51蛋白激酶磷酸化肌球蛋白及驅動蛋白的反應。用6.5%的SDS-PAGE和X-線膠片放射自顯影法分析測定了激酶活性。用凝膠移位分析法發現了 UNC-51激酶在體內(HeLa細胞)能夠磷酸化驅動蛋白。
權利要求
1.本發明首次發現第一個既結合肌球蛋白及驅動蛋白也磷酸化肌球蛋白及驅動蛋白的激酶是UNC-51激酶。其關鍵發現為:在試管內的生化實驗中，首次揭示肌球蛋白(MHC和MLC)和驅動蛋白(KHC)都能夠結合UNC-51激酶。
2.首次揭示UNC-51蛋白激酶活性既能夠磷酸化肌球蛋白(MHC和MLC)也能夠磷酸化驅動蛋白(KHC)。
肌球蛋白+UNC-51+驅動蛋白+ATP(GTP)— —移動性P-肌球蛋白-UNC-51-驅動蛋白-P復合體+ADP (⑶P)
3.上記二項要求的技術原理在生命科學，腦科學，腫瘤科學，計算機科學，宇宙科學，交通科學，醫學，藥學和制藥學，中藥科學，各種疾病的治療法，醫療技術以及所有其他方面的應用 和推廣。
全文摘要
生命在于運動。肌球蛋白(myosin)和驅動蛋白(kinesin)作為細胞運動的主要分子馬達，在肌肉收縮，細胞內物質，小胞和膜細胞器的輸送以及動態細胞骨架的構成和功能上起著重要的作用。揭示調節肌球蛋白和驅動蛋白功能的基本分子原理是生命科學家的最熱衷研究領域之一。還沒有關于既磷酸化肌球蛋白也磷酸化驅動蛋白的激酶的報道。在這里，首次揭示肌球蛋白和驅動蛋白都能夠結合UNC-51激酶，首次揭示UNC-51蛋白激酶活性既能夠磷酸化肌球蛋白也能夠磷酸化驅動蛋白，并提出UNC-51激酶活性通過對肌球蛋白和驅動蛋白的磷酸化反應誘導神經軸突形成的模型。
文檔編號C12Q1/48GK103160571SQ20111040779
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者田懷澤, 李素云, 田華希 申請人:彩虹天健康科技研究(北京)有限責任公司