專利名稱：檢測或輔助檢測ii類細菌素產生菌群體感應信號肽的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測或者輔助檢測來源于II類細菌素產生菌代謝物的待檢測肽是否含有II類細菌素產生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產生菌群體感應信號肽的方法。
背景技術：
微生物在生長的過程中能夠自發產生、釋放一些特定的信號分子，并能感知其濃度變化，調節其群體行為，這種現象稱為群體感應(Quorum sensing, QS),產生的信號分子叫做自誘導物(autoinducer, Al)。目前已知很多種類的細菌可以通過群體感應來調控生理行為。目前對一些G-細菌群體感應信號分子——N-酰基高絲氨酸內酯(AHLs)的檢測已有很多研究報道和相關專利，如儲衛華等“群體感應信號分子及其抑制劑快速檢測方法的建立”，郭秀春等“氣質聯用技術檢測海綿共棲細菌中N-酰基高絲氨酸內酯類信號分子”，曹廣霞等“細菌群體感應信號分子N-酰基高絲氨酸內酯的檢測”，周志剛等“水產病原菌群體感應信號分子的檢測方法及其專用試劑盒”。但對于許多產II類細菌素乳酸菌，其信號分子一般為寡肽，由于缺乏相關的遺傳背景，對其結構和組成知之甚少，目前還沒有群體感應信號肽的檢測方法的專利。自誘導肽(AIP)類化合物是產II類細菌素乳酸菌群體感應中最重要的一類信號分子，調控包括其自身基因在內的一系列細菌素合成調控基因以及結構基因的表達。Saucier 等(Saucier L, Poon A, Stiles ME.1nduction of bacteriocin inCarnobacterium piscicola LV17.J Appl Mocrobiol, 1995, 78:684-690)的研究表明自誘導妝可以啟動細菌素的合成，Schmitz 等(Schmitz S, Hoffmann A, Szekat C, et al.Thelantibiotic mersacidin is an autoinducing peptide.Appl Environ Microbiol,2006,72:7270-7277)認為自誘導肽可以誘發細菌素提早合成。快速、簡便、有效地檢測細菌能否產生AIP，成為深入研究和了解產II類細菌素乳酸菌群體感應的重要手段。脫脂乳培養基是適合大多數乳酸菌生長的培養基，但許多乳酸菌在脫脂乳培養基中生長緩慢，以此培養基來檢測自誘導肽，周期長。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測或者輔助檢測來源于II類細菌素產生菌代謝物的待檢測肽是否含有II類細菌素產生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產生菌群體感應信號肽的方法。該方法包括如下步驟:先將II類細菌素產生菌懸浮于無菌生理鹽水中，接種于液體改良脫脂乳培養基中培養，在達 到穩定期之前的這一時間段中的任一時刻(上述培養體系此時不含有II類細菌素)，向所述液體改良脫脂乳培養基中添加待檢測肽，繼續培養至10-16h，如13h，得到培養物；檢測所述培養物中是否存在所述II類細菌素，按照如下方法確定所述待檢測肽是否含有II類細菌素產生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產生菌群體感應信號肽:若所述培養物中存在所述II類細菌素，則所述待檢測肽含有或候選含有所述II類細菌素產生菌的群體感應信號肽，或所述待檢測肽為或候選為II類細菌素產生菌群體感應信號肽；反之，則所述待檢測肽不含有或候選不含有所述II類細菌素產生菌的群體感應信號肽，或所述待檢測肽不為或候選不為所述II類細菌素產生菌的群體感應信號肽。所述II類細菌素產生菌產生II類細菌素受群體感應系統調控；所述待檢測肽來源于將所述II類細菌素產生菌在產生II類細菌素狀態下進行發酵得到的發酵上清液；所述改良脫脂乳培養基是在脫脂乳培養基中添加酵母浸粉得到的培養基，在所述改良脫脂乳培養基中，所述酵母浸粉、脫脂乳與水的配比為0.5g: (8-12g): 100ml，如0.5g: Ilg: 100ml。在本發明的一個實施例中，所述將所述II類細菌素產生菌接種于液體改良脫脂乳培養基中培養，接種量為0.5% (體積比)，培養溫度為37°C，培養至指數期，時間為0-12h，如 8h。在本發明的實施例中，所述待檢測肽具體是通過包括如下步驟的方法制備得到的:用40% -80%，如60%飽和度的硫酸銨溶液過夜沉淀所述II類細菌素產生菌在產生II類細菌素狀態下的發酵上清液，進而得到所述待檢測肽。所述發酵上清液是按照包括如下步驟的方法獲得的:將所述II類細菌素產生菌接種于能使所述II類細菌素產生菌產生II類細菌素的培養基中培養至穩定期這一時間段中的任一時刻，如穩定期末期(上述培養體系此時含有II類細菌素)，收集得到所述發酵上清液。在本發明的實施例中，所述能使所述II類細菌素產生菌產生II類細菌素的培養基具體為MRS培養基。實際操作中，所述發酵上清液的獲得方法包括如下步驟:將所述II類細菌素產生菌以體積百分比0.5 I %，或體積百分比0.5 %的接種量接種到MRS培養基中，30 37°C培養10-48h，或37°C培 養10-48h，或37°C培養24h后，收集獲得含有所述待檢測肽的所述發酵上清液。所述液體MRS培養基的溶劑為水，溶質為蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、K2HPO4.3Η20、檸檬酸三銨、NaAC、葡萄糖、MgSO4.7H20、MnSO4.H2O和吐溫80 ;所述水、所述蛋白胨、所述牛肉膏、所述酵母浸粉、所述K2HPO4.3H20、所述檸檬酸三銨、所述NaAC、所述葡萄糖、所述MgSO4.7Η20、所述MnSO4^H2O和所述吐溫80 的配比為 100ml: IOg: IOg: 5g: 2g: 2g: 5g:20g: 0.58g: 0.25g: lmL。所述方法中檢測所述培養物中是否存在所述II類細菌素是通過檢測所述培養物對指示菌的抑菌作用實現的，如果所述培養物對指示菌有抑菌作用，所述培養物中含有所述II類細菌素，如果所述培養物對指示菌無抑菌作用，所述培養物中不含有所述II類細菌素。所述指示菌為其生長能被所述II類細菌素抑制的菌株，如單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)54002。在本發明的實施例中，檢測所述培養物對所述指示菌的抑菌作用的方法具體可包括如下步驟:首先，將經過所述待檢測肽誘導培養10-16h，如13h的所述II類細菌素產生菌培養物的上清液過濾除菌，并調整pH至6.5 7.0。其次，取新鮮過夜培養的指示菌，用無菌生理鹽水稀釋至IO6 107CFU/mL，如106CFU/mL，取ImL與冷卻至45 55°C，如50°C的15 20ml MRS固體培養基混勻倒平板。待平板凝固后，放入牛津杯，分為實驗組和對照組。實驗組按照50 200 μ I/杯，如100 μ I/杯的用量，加入上述處理過的上清液，對照組中不加入上述待測液體。37°C培養18 36h，如24h，觀察抑菌效果。如果對照組無抑菌圈，而實驗組出現抑菌圈，則所述培養物對所述指示菌有抑菌作用，如果對照組無抑菌圈，而實驗組也未出現抑菌圈，則所述培養物對所述指示菌無抑菌作用。上述方法中的所述待檢細菌為乳酸菌，如乳桿菌。在本發明的實施例中具體為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus) 31-1。本發明的另一個目的是提供一種檢測或輔助檢測II類細菌素產生菌群體感應信號肽的培養基，為改良脫脂乳培養基。所述改良脫脂乳培養基是在脫脂乳培養基中添加酵母浸粉得到的培養基。在所述改良脫脂乳培養 基中，所述酵母浸粉、脫脂乳與水的配比為
0.5g: (8-12g): 100ml，如 0.5g:1lg: 100ml。本發明所提供的改良的脫脂乳培養基以脫脂乳培養基為基礎，添加酵母浸粉，力口快了乳酸菌的生長和產細菌素進程，使得自誘導的檢測更加簡便、快速。與MRS培養基相t匕，乳酸菌在此培養基中II類細菌素合成速度慢，在某一培養狀態下，自誘導肽對細菌素合成的誘導效應能夠被有效地監測。多數乳酸菌均可在此培養基上生長，當接種量小于某特定閾值時，控制培養時間，使乳酸菌不產生細菌素，當加入自誘導肽后可恢復其產II類細菌素的能力。將產II類細菌素乳酸菌接種于該培養基，通過控制接種量和培養時間，控制乳酸菌的細菌素合成行為，使之處于不產細菌素的狀態，添加來自于該菌株自身的肽類提取物，控制培養時間，監測II類細菌素的產生。該體系的建立有助于大規模高通量篩選產II類細菌素乳酸菌群體感應自誘導肽。本發明方法準確率高，沒有假陰性現象，易于定性定量分析，操作簡便，成本低，獲得結果迅速，適合大規模高效率檢測。


圖1為檢測或者輔助檢測來源于II類細菌素產生菌代謝物的待檢測肽是否含有II類細菌素產生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產生菌群體感應信號肽的流程圖。圖2為自誘導肽誘導II類細菌素產生的抑菌活性實驗結果。其中，A為對照組
I(用等量MRS液體培養基代替待檢測肽誘導的液體脫脂乳培養基培養物的抑菌效果)；B為實驗組(經待檢測肽F22誘導的液體脫脂乳培養基培養物的抑菌效果)；(:為對照組2(待檢測肽F22的抑菌效果)山為對照組3 (培養物與待檢測肽相加的抑菌效果，與實驗組不同之處在于待檢測肽F22是在培養完成之后加入的)。圖3為利用液體脫脂乳培養基檢測或輔助檢測待檢細菌產生II類細菌素是否存在群體感應調控現象的流程圖。圖4為自誘導物誘導II類細菌素產生的抑菌活性實驗結果。其中，A實驗組* (經自誘導物誘導的液體脫脂乳培養基培養物的抑菌效果)出為對照組I * (用等量MRS液體培養基代替自誘導物誘導的液體脫脂乳培養基培養物的抑菌效果)；(:為對照組3* (對照組I *與等量的自誘導物混合后的抑菌效果)山為對照組2 * (自誘導物的抑菌效果)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。液體改良脫脂乳培養基:稱取脫脂乳(哈爾濱美華生物技術股份有限公司原料乳)llg，酵母浸粉(北京奧博星生物技術有限責任公司貨號:01-012)0.5g，溶于IOOmL蒸懼水中，115°C滅菌 13min，pH 6.5 7.0。液體脫脂乳培養基:稱取脫脂乳llg，溶于IOOmL蒸餾水中，115°C滅菌13min，pH6.5 7.0。液體MRS培養基:稱取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，K2HPO4.3H20 2g，檸檬酸三銨 2g，NaAC 5g，葡萄糖 20g, MgSO4.7H20 0.58g，MnSO4.H2O 0.25g，吐溫 801mL，溶于 IOOmL 蒸餾水中，121°C滅菌 20min, ρΗ6.5 7.0。液體1/2MRS培養基:除蒸餾水外，其他各種MRS培養基成分X 1/2，ρΗ6.5 7.0，121°C 滅菌 20min。 液體1/5MRS培養基:除蒸餾水外，其他各種MRS培養基成分X 1/5，pH6.5 7.0，121°C 滅菌 20min。液體1/10MRS培養基:除蒸餾水外，其他各種MRS培養基成分X 1/10，pH6.5
7.0,121°C滅菌 20min。固體MRS培養基:為液體MRS培養基加入15g/L瓊脂。實施例1、檢測或輔助檢測來源于II類細菌素產生菌L.pentosus 31-1的待檢測肽是否是群體感應信號肽戍糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus) 31-1 為 II 類細菌素產生菌(GuorongLiu, Yanni Lv,Pinglan Li,Kang Zhou,Jinglan Zhang.Pentocin 31-1,an anti—Listeriabacteriocin produced by Lactobacillus pentosus 31-1 isolated from Xuan-ffeiHam, a traditionalChina fermented meat product.Food Control,2008,19:353-359.Zhang Jinlan, Liu Guorong, Shang Nan, Cheng ffanpeng, Chen Shangwu, Li Pinglan二Purification and Partial Amino Acid Sequence of Pentocin 31-1,an Ant1-ListeriaBacteriocin Produced by Lactobacillus pentosus 31—1.Journal of FoodProtection, Volume 72，Number 12.2524-2529.)，經鑒定其II類細菌素的產生存在群體感應調控現象(具體鑒定方法參見本實施例結尾處)。本實施例將詳述如何利用本發明的方法檢測或輔助檢測來源于II類細菌素產生菌L.pentosus 31-1的待檢測肽是否是群體感應信號肽(實驗流程如圖1所示)。具體按照如下步驟進行:1、待檢測肽的提取將懸浮于無菌生理鹽水(109cfu/ml)中的L.pentosus 31-1以0.5% (體積比)的接種量接種到MRS培養基中，37°C培養24h(L.pentosus 31-1處于穩定期末期，IlOOOXg離心5min，收集上清液，調節pH至6.5 7.0，過濾除菌，制備發酵上清液。用60%飽和度硫酸銨過夜沉淀，IlOOOXg冷凍離心IOmin,收集沉淀,冷凍干燥。將上述樣品用0.02M的Na2HPO4-NaH2PO4 (pH7.0)復溶至終濃度為0.5g/ml。用NMWL3000(截留相對分子質量為3000，美國Millipore，NMWL 3000), NMWL 1000(截留相對分子質量為1000，，美國Millipore，NMWL 1000)濾膜超濾，分別收集> 3000Da和1000 3000Da的組分。過辛基-瓊脂糖凝膠(Octyl Sepharose 4FF)柱(北京瑞達恒輝科技發展有限公司HA-0670-01，層析柱規格30cm(柱長)X 1.0cm(內徑))，進行疏水層析，具體按如下操作:用 0.02mol/L ρΗ7.0 的 Na2HPO4-NaH2PO4 加(NH4)2SO4 的平衡緩沖液(0.02mol/L ρΗ7.0的 Na2HPO4-NaH2PO4 溶液的配方為:61ml 濃度為 0.2mol/L 的 Na2HPO4, 39ml 濃度為 0.2mol/L的NaH2PO4，用蒸餾水定容至1000ml) ((NH4)2SO4在上述平衡緩沖液中的終濃度為lmol/L)平衡洗去雜質，以1.5ml/min的流速勻速上樣，上樣量為0.5ml，待樣品上完后，再用0.02mol/L ρΗ7.0 的 Na2HPO4-NaH2PO4 洗脫液(配方為:61ml 濃度為 0.2mol/L Na2HPO4, 39ml 濃度為
0.2mol/L NaH2PO4，用蒸餾水定容至1000ml)洗下目標產品。測定OD22tl值(用HD-5型電腦紫外檢測儀進行在線檢測，上海青浦滬西儀器廠)，根據圖形波峰波谷的情況，分別收集在220nm有吸收的各個洗脫峰，再把收集的每個洗脫峰對應的收集液用真空冷凍干燥機冷凍干燥(FD-1博醫康冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司)，共得到2份粗品待檢測肽(每一份粗品待檢測肽對應所收集的一個洗脫峰)，分別命名為Fl和F2。將上述獲得的粗品待檢測肽(Fl和F2)分別用0.02mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4 (配方為:61ml濃度為0.2mol/L的Na2HPO4, 39ml濃度為0.2mol/L的NaH2PO4,用蒸懼水定容至1000ml)復溶至終濃度為5mg/ml。再將其過Sephadex G-1O柱((0.7cmX 18.5cm)，柱填料購自北京拜爾迪生物公司(Pharmacia 17-0010-01)，進行凝膠過濾層析，上樣量為0.5ml,流速為 0.3ml/min,用 0.02mol/L 的 Na2HPO4-NaH2PO4 洗脫。測定 OD220 值(用 HD-5 型電腦紫外檢測儀進行在線檢測，上海青浦滬西儀器廠)，根據圖形波峰波谷的情況，分別收集在220nm有吸收的各個洗脫峰，再把收集的每個洗脫峰對應的收集液用真空冷凍干燥機冷凍干燥(FD-1博醫康冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司)，共得到4份待檢測肽(每一份待檢測肽對應 所收集的一個洗脫峰)。由粗品待檢測肽Fl得到的待檢測肽分別命名為F11、F12 ；由粗品待檢測肽F2得到的待檢測肽分別命名為F21和F22。其中，一個待檢測肽F22所對應的洗脫峰的保留時間是60min。2、誘導時間的確定將懸浮于無菌生理鹽水中的L.pentosus 31-1 (109cfu/ml)以0.5% (體積比)的接種量分別接種到液體改良脫脂乳培養基、液體脫脂乳培養基中，37°C培養，每a檢測上述兩種液體培養基的培養物中是否存在II類細菌素，記錄出現細菌素活性的時間。具體方法為:分別收集上述兩種液體培養基的培養物，13800Xg離心5min，取上清液過濾除菌，調節pH至6.5 7.0,取100 μ I備用。以可被L pentosus 31-1所產II類細菌素抑制生長的植物乳桿菌(L.Plantarum) PL2 (武朋朋，劉國榮,暢曉淵，張香美，李平蘭.抗豬鏈球菌戊糖乳桿菌素的純化及特性研究.中國農業大學學報，2011，16 (5):121-126)為指示菌用杯碟法測定上述兩種液體培養基培養物上清液的抑菌活性，從而判定所述培養物中是否含有II類細菌素。具體操作為:取過夜培養的新鮮指示菌植物乳桿菌(L.plantarum)PL2，用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL，取Iml與冷卻至50°C的20ml的MRS固體培養基混勻倒平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100 μ I/杯的用量，加入經上述處理的上清液，37°C培養24h，觀察抑菌效果。結果顯示，加入了液體改良脫脂乳培養基中> 14h(指數期末期)培養物上清液的平板均產生了抑菌圈，而加入液體脫脂乳培養基中的直至72h的培養物上清液的平板也未產生抑菌圈。這一結果表明，所述兩種培養基的培養物上清液在指數期中期(< 14h)這一時段均不存在II類細菌素，進而說明在指數期中期(< 14h)這一時段(L.pent0SUS31-l菌株未產生II類細菌素的時間段)均可用于檢測自誘導肽。3、誘導將步驟I制備的共4份待檢測肽分別添加到步驟2培養有L.pentosus 31-1 (L.pentosus 31-1處于指數期，培養8h)的上述兩種液體培養基中進行誘導，使待檢測肽的濃度為0.5 μ g/ml (實驗組)，繼續培養一段時間(脫脂乳培養基培養至13h或60h，改良脫脂乳培養基培養至13h)。同時，每種培養基均設置以等量液體MRS培養基替代待檢測肽進行誘導的對照(對照組I)。4、檢測收集步驟3中兩種液體培養基的培養物，13800 Xg離心5min，取上清液過濾除菌，調節pH至6.5 7.0,以可被L.pentosus 31-1所產II類細菌素抑制生長的植物乳桿菌(Lplantarum)PL2為指示菌，用杯碟法測定上述兩種液體培養基培養物上清液的抑菌活性，從而判定所述培養物中是否含有II類細菌素，進而判定所述L.pentosus 31-1經待檢測肽處理后，是否恢復產生II類細菌素。具體操作為:取過夜培養的新鮮指示菌植物乳桿菌(L.plantarum)PL2，用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL，取Iml與冷卻至50°C左右的20ml的MRS固體培養基混勻倒 平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100 μ I/杯的用量，加入經上述處理的上清液，同時以100 μ I待檢測肽(所述待檢測肽溶于MRS培養基中，使其終濃度與誘導所用濃度相同，即待檢測肽終濃度為0.5 μ g/ml)(對照組2)，以及100 μ I L.pentosus31-1培養物(脫脂乳培養基培養至13h或60h，改良脫脂乳培養基培養至13h)與待檢測肽(終濃度為0.5 μ g/ml)的混合物，與實驗組不同之處在于待檢測肽F22是在培養完成之后加入的(對照組3)作為對照，37°C培養24h，觀察抑菌效果。結果顯示:(I)對于脫脂乳培養基(加入待檢測肽后繼續培養至13h組)，添加了不同待檢測肽的3個對照組和實驗組均無抑菌圈出現；(2)對于脫脂乳培養基(加入待檢測肽后繼續培養至60h組)，添加了 F22的3個對照組無抑菌圈出現，而實驗組出現抑菌圈；添加了 Fl1、F12、F21的3個對照組和實驗組均無抑菌圈出現；(3)對于改良脫脂乳培養基(加入待檢測肽后繼續培養至13h組)，添加了 F22的3個對照組無抑菌圈出現，而實驗組出現抑菌圈(圖2);添加了 F11、F12、F21的3個對照組和實驗組均無抑菌圈出現。本實施例的實驗結果表明，加入待檢測肽F22(保留時間為60min)繼續培養(改良脫脂乳培養基繼續培養至13h，脫脂乳培養基繼續培養至60h)后使L.pentosus 31-1啟動II類細菌素合成(相應的培養物上清中存在II類細菌素)，則說明待檢測肽F22 (保留時間為60min)為L.pentosus 31_1菌株產生II類細菌素群體感應的自誘導肽。與脫脂乳培養基(加入自誘導肽后培養至60h)相比，選用改良脫脂乳培養基(加入自誘導肽后培養至13h)可以快速地甄別群體感應自誘導肽，縮短檢測時間。上述實施例中，鑒定L pentosus 31_1產生II類細菌素存在群體感應調控現象的具體方法如下(實驗流程如圖3所示):具體按照如下步驟進行:I)制備自誘導物(發酵上清液)將懸浮于無菌生理鹽水(109cfu/ml)中的戍糖乳桿菌(L.pentosus) 31-1以0.5% (體積比)的接種量接種到液體MRS培養基中，37 °C培養24h(戊糖乳桿菌(L.pentosus) 31-1處于穩定期末期)，13800 Xg離心5min,收集發酵上清液,作為自誘導物。2)獲得具有不產II類細菌素細胞表型的L.pentosus 31-1將懸浮于無菌生理鹽水(109cfu/ml)中的L.pentosus 31-1以0.5% (體積比)的接種量分別接種到液體脫脂乳培養基(同時設置如下四種液體培養基作為液體脫脂乳培養基的對照:液體MRS培養基、液體1/2MRS培養基、液體1/5MRS培養基和液體1/10MRS培養基)中，并在37°C條件下培養12h、24h、36h、48h、60h、72h后，分別檢測此時五種液體培養基的培養物中是否存在II類細菌素。具體方法為:分別收集不同培養時間的五種液體培養基的培養物，13800 X g離心5min，取上清液過濾除菌，調節pH至6.5 7.0，取100 μ I備用。以可被所述待檢細菌所產II類細菌素抑制生長的植物乳桿菌(L.plantarum)PL2為指示菌用杯碟法測定上述不同培養時間的五種液體培養基培養物上清液的抑菌活性，從而判定所述培養物中是否含有II類細菌素。具體操作為:取過夜培養的新鮮指示菌植物乳桿菌(L.plantarum)PL2，用無菌生理鹽水稀釋至106CFU/mL，取Iml與冷卻至50°C的20ml的MRS固體培養基混勻倒平板。待凝固后，放入牛津杯，按照100 μ I/杯的用量，加入經上述處理的上清液，37°C培養24h，觀察抑菌效果。結果顯示，經過72h培養，加入了液體脫脂乳培養基培養物上清液的平板仍未產生抑菌圈，而加入作為對照的四種液體培養基(MRS培養基、1/2MRS培養基、1/5MRS培養基和1/10MRS培養基)平板均產生抑菌圈(表I)。這一結果表明，包括對照培養基在內的共五種培養基中，只有所述液體脫脂乳培養基的培養物上清液中不存在II類細菌素，進而說明利用所述液體脫脂乳培養基獲得了不產II類細菌素細胞表型的L.pentosus 31_1。表I不同培養基對L.pentosus 31-1合成II類細菌素的影響
權利要求
1.檢測或者輔助檢測來源于II類細菌素產生菌代謝物的待檢測肽是否含有II類細菌素產生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產生菌群體感應信號肽的方法，包括如下步驟: 先將II類細菌素產生菌接種于液體改良脫脂乳培養基中培養，在到達穩定期之前的這一時間段中的任一時刻，向所述液體改良脫脂乳培養基中添加所述待檢測肽，繼續培養至10-16h，得到培養物；檢測所述培養物中是否存在所述II類細菌素，按照如下方法確定所述待檢測肽是否含有II類細菌素產生菌群體感應信號肽或是否為II類細菌素產生菌群體感應信號肽:若所述培養物中存在所述II類細菌素，則所述待檢測肽含有或候選含有II類細菌素產生菌群體感應信號肽，或所述待檢測肽為或候選為II類細菌素產生菌群體感應信號肽；反之，則所述待檢測肽不含有或候選不含有所述II類細菌素產生菌的群體感應信號肽，或所述待檢測肽不為或候選不為所述II類細菌素產生菌的群體感應信號肽；所述II類細菌素產生菌產生II類細菌素受群體感應系統調控；所述待檢測肽來源于將所述II類細菌素產生菌在產生II類細菌素狀態下進行發酵得到的發酵上清液；所述改良脫脂乳培養基是在脫脂乳培養基中添加酵母浸粉得到的培養基，在所述改良脫脂乳培養基中，所述酵母浸粉、脫脂乳與水的配比為0.5g: (8-12g): 100ml。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述發酵上清液是按照包括如下步驟的方法獲得的:將所述II類細菌素產生菌接種于能使所述II類細菌素產生菌產生II類細菌素的培養基中培養至穩定期，如穩定期末期，，收集得到所述發酵上清液。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述發酵上清液是按照包括如下步驟的方法獲得的:將所述II類細菌素產生菌接種于MRS培養基中培養至穩定期，如穩定期末期，收集得到所述發酵上清液。
4.根據權利要求3所述的 方法，其特征在于:所述發酵上清液是按照包括如下步驟的方法獲得的:將所述II類細菌素產生菌以體積百分比0.5 1%，或體積百分比0.5%的接種量接種到MRS培養基中，30 37°C培養10-48h，或37°C培養10_48h，或37°C培養24h后，收集獲得含有所述待檢測肽的所述發酵上清液。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述II類細菌素產生菌為乳酸菌。
6.根據權利要求5中任一所述的方法，其特征在于:所述II類細菌素產生菌為乳桿菌。
7.根據權利要求6中任一所述的方法，其特征在于:所述II類細菌素產生菌為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus) 31-1。
8.檢測II類細菌素產生菌群體感應信號肽的培養基，為改良脫脂乳培養基，其特征在于:所述改良脫脂乳培養基是在脫脂乳培養基中添加酵母浸粉得到的培養基；在所述改良脫脂乳培養基中，所述酵母浸粉、脫脂乳與水的配比為0.5g: (8-12g): 100ml。
9.根據權利要求8所述的培養基，其特征在于:在所述改良脫脂乳培養基中，所述酵母浸粉、脫脂乳與水的配比為0.5g: Ilg: 100ml。
全文摘要
本發明公開了一種檢測或者輔助檢測來源于II類細菌素產生菌代謝物的待檢測肽是否含有或為II類細菌素產生菌群體感應信號肽的方法。本發明所提供的方法包括如下步驟先將II類細菌素產生菌接種于液體改良脫脂乳培養基中培養，在到達穩定期之前這一時段中的任一時刻，向所述液體改良脫脂乳培養基中添加待檢測肽，繼續培養至10-16h，得到培養物；檢測所述培養物中是否存在所述II類細菌素；若所述培養物中存在所述II類細菌素，則所述待檢測肽含有或候選含有，或是或候選是所述II類細菌素產生菌的群體感應信號肽。本發明選用改良脫脂乳培養基可以甄別群體感應自誘導肽，且與脫脂乳培養基相比，更加快速，大大縮短了檢測時間。
文檔編號C12Q1/02GK103173513SQ201110431610
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月21日 優先權日2011年12月21日
發明者李平蘭, 張香美, 張寶, 劉麗莎 申請人:中國農業大學