專利名稱：制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法
技術領域：
本發明涉及一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條(strip)的方法。更具體而言，本發明涉及一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐試紙條的方法，該方法包括將核苷酸探針與載體連接以制備結合物并通過真空轉移將該結合物固定到多孔固體支撐上。
背景技術：
在確定疾病的遺傳因素、治療的恰當性、生物鑒定等中利用核苷酸診斷。通常，用于分析從細菌或細胞分離的核苷酸樣品或者通過核苷酸聚合擴增該樣品而獲得的產物中的特定核苷酸序列的技術被用于證實核苷酸的存在，該技術采用具有與要被分析的部分核苷酸特異性連接的互補堿基序列的核苷酸片段(即，核苷酸探針)，這基于它們之間的確存在連接。目前使用的用于分析特定核苷酸序列的方法的實例包括通過將探針粘附到微孔板表面的特定核苷酸探針與要被分析的核苷酸的雜交，包括在膜上固定探針并向其加入擴增的核苷酸的特定核苷酸探針與核苷酸的雜交(逆向點/線印跡雜交)，以及包括在由如玻璃的材料制成的板上固定多種探針并向其加入擴增的核苷酸的核苷酸雜交(DNA芯片)等寸。為了制備用于核苷酸雜交的診斷條，需要一種用于在固體支撐上固定核苷酸探針的方法。具體地，物理吸附、紫外線(UV)照射和包括共價連接的化學連接是將核苷酸粘附到固體支撐上的最常用的方法(參考R Lutgarde等人，Applied EnvironmentalMicrobiology,62，300-303，1996)。物理吸附是在固體表面物理吸附生物分子的方法，其在體外診斷中引起了極大的關注。生物分子被吸附到固體相的機制并不清楚。實際上，可能涉及到生物分子與表面之間的相互作用。這種相互作用可能通過5個步驟發生，S卩，1)分子向表面移動，2)其吸附在表面，3)吸附分子的重排，4)吸附分子的潛在解吸附作用(latent desporption)，以及5)吸附分子離開表面的運動(參考W Norde，Advances in Colloid and InterfaceScience,25，267-340，1986)。該概要提示解吸附作用是潛在地固有的，但是，實際上，當分子足夠大時，結合不可逆地發生(參考AW Adamson, “ The Solid-liquid Interface =Adsorption FromSolution " , in Physical chemistry of surfaces,5th ed. (Chichester, UK :ffiley,1990),421-459)。該行為的原因是，由于結合位點的數量隨著分子量的增加而增加，因此盡管一個結合位點從表面解離，但其余的多個位點仍然保持結合狀態。就此而言，有報道稱核苷酸表現出與蛋白質相同的作用。盡管核苷酸的結合力比蛋白質的低，但大的核苷酸與膜結合良好。
但是，物理吸附存在的嚴重問題是固定在表面的核苷酸被重排并因此可能具有不適于與任何引入的堿基序列相互作用的構造。具有長的堿基序列的核苷酸不會遇到問題，但當核苷酸的堿基序列變短時，潛在活性的降低會成為嚴重的問題。當堿基沒有保持能與溶液相互作用的游離形式并被固定在表面上時，由于變形的結構，雜交不能正常發生。此外，核苷酸探針具有的分子大小對于直接施用真空轉移來說是小的，并且核苷酸探針具有的物理力(靜電力、疏水性相互作用等)對于將探針吸附到多孔固體支撐上來說也是相對弱的，因此，將核苷酸探針固定到多孔固體支撐上時相當困難的。因為這個原因，除非進行另外的固定，否則核苷酸探針可能未被均勻地涂覆，并且在檢驗過程中會容易地解吸附，因此核苷酸探針在應用于需要優良的再現性和高敏感性的分子診斷的雜交檢驗中是不利地無效的。考慮到這些問題，廣泛地應用采用UV的方法。UV交聯是將核苷酸探針與尼龍膜共價結合的最簡單的方法之一。連接主要通過胸腺嘧啶殘基(其他核苷出現得不是這么頻繁)來進行。當胸腺嘧啶殘基被激活時，它們與存在于尼龍膜上的胺反應(GM Church and W Gilbert,PNAS,81,1991-1995,1984 ；I Saito等人，Tetrahedron Letters, 22, 3265-3268，1981)。這些堿基中的一部分與膜表面共價連接，因此在雜交過程中不參與反應。當膜過度暴露于UV時，UV連接必然會干擾雜交。因此，重要的是正確地確定UV的照射量。換言之，當將膜暴露于少量的UV時，未進行有效的交聯，而當將膜暴露于過量的UV時，雜交的效率下降。同時，與膜的UV照射相關的一個重要方面是膜水含量。水吸收UV，并且干燥步驟中的偏差造成交聯發生的水平高于或低于預期。就此而言，膜的UV照射存在的問題是，通過胸腺嘧啶堿基控制交聯水平具有相當的難度。同時，將可光敏化的化合物用于膜或探針的技術是改良的交聯方法(參考JKVeilleux and Lff Duran, IVD Technology 2，no. 2，洸_31，1996)。當可光敏化的化合物(例如，光生物素)用于探針時，它們使探針具有正確的取向(方向性)和自由度，但很少應用它們，因為在將其暴露于UV照射時常常會發生不可控的反應。共價連接作為采用常規化學方法將核苷酸探針固定到固體支撐表面的方法獲得了關注。胺、羰基、羧基和巰基是多種化學連接方法中最常使用的。共價連接能夠控制探針取向，受控的化學連接在通過末端殘基控制核苷酸的同時使核苷酸發生粘附，并且通過引入具有合適大小的間隔可以進行使固定的核苷酸與任何加入的探針的自由雜交(free hybridization)。探針和固體支撐等之間的共價連接通常應用于微點陣系統，S卩，如玻璃片、小球等的形式，并且也可以應用于如膜的多孔固體支撐。但是，采用探針和膜之間的直接共價連接的常規技術通常限于胺標記的探針與被羧基活化(采用碳化二亞胺(如1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC或EDAC)試劑))的膜之間的共價連接。此外，以在膜上控制的連接的形式將核苷酸探針固定到膜上的方法本質上是分批過程，其難以用于大規模生產和自動化處理。此外，這些方法需要長時間周期和高成本。如上所述，由于與用于核苷酸雜交檢驗的核苷酸探針涂覆的膜條的生產相關的物理和化學優點和缺點，能以簡單且快速的方式進行正常雜交膜條的大規模生產受到限制。因此，為了在診斷領域實現基于膜的核苷酸測試的廣泛應用，對開發解決常規問題并因此確保可制造性的膜條的需要日益增加。

發明內容
技術問題因此，考慮到上述問題而完成了本發明，并且本發明的一個目的為提供一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法，該方法通過使核苷酸探針與載體結合而能夠確保核苷酸探針的取向，避免固定到固體支撐表面上的核苷酸的重排，并且，由于要與靶堿基序列互補連接的探針的雜交堿基序列的一部分未被固定，從而防止了因降低的活性而發生的異常雜交。本發明的另一個目的為提供一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法，該方法有效地避免了在常規方法中遇到的控制UV最佳照射量的不便之處，并且由于該方法不采用常規方法(其中通過化學連接固定核苷酸探針)本身所需要的分批過程，因此實現了大規模生產和自動化處理。本發明的又一個目的為提供一種制備核苷酸探針檢驗系統的方法，該方法采用低成本通過大規模生產以簡單的方式來快速實現，該方法具有再現性，防止膜表面干擾相互作用從而有利于靶堿基序列與核苷酸探針之間的雜交，并且表現出優良的穩定性和敏感性。技術方案因此，根據本發明的一個方面，提供了一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法，該方法包括將核苷酸探針與載體連接以制備結合物以及通過真空轉移將該結合物固定到多孔固體支撐上。對于應用于體外診斷核苷酸實驗的雜交，有多種方法用于將核苷酸探針固定到如膜的多孔固體支撐上，并且應該在考慮多種因素的情況下識別這些方法。因此，就與檢驗的性能和制備方法的方便性有關的結合效率而言，必然存在優點和缺點。以最低的成本用最容易的方式實現大規模生產是最重要的方面。就此而言，根據本發明的制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法通過將核苷酸探針與載體結合而有效地確保核苷酸探針的取向，避免固定在固體支撐上的核苷酸的重排，并且，由于要與靶堿基序列互補連接的探針的雜交堿基序列的一部分未被固定，從而防止了因降低的活性而發生的異常雜交。此外，所述方法有效地避免了在常規方法中遇到的控制UV最佳照射量的不便之處，并且由于該方法不采用化學連接本身所需的分批過程，因此實現了大規模生產和自動化處理。所述核苷酸探針包括正義(正向)和反義(反向)核苷酸，其中包括DNA、RNA、 PNA(肽核苷酸)等正義靶基因序列。包括大片段0嫩、短DNA(包括cDNA) ,RNA和肽核苷酸(PNA)的四種類型的核苷酸探針可被固定到固體相上用于快速檢驗的目的。這些用于固定不同分子的方法具有相同的性質，但實際上由于分子結構和大小的不同而彼此不同。用于在固體上固定大片段DNA的方法從不用于診斷試驗，通常是用在固體上固定較短DNA序列的方法來代替。在此使用的核苷酸探針與載體之間的連接優選化學結合，并且化合物學結合包括共價結合以及如離子相互作用和氫鍵的非共價結合。其中，優選共價結合。可以使用通過親和結合的連接，盡管其不是共價連接，但表現出與共價連接相當的強結合力。最常使用的是與親和結合相關的生物素-抗生物素蛋白/抗生物素蛋白鏈菌素固定技術，其能夠以 10-1 的結合常數形成強鍵。此外，在探針和固體支撐之間可以使用具有強親和結合力的谷胱甘肽-GST (谷胱甘肽S-轉移酶)、組氨酸-金屬離子(Co、Ni、Cu)、 麥芽糖-MBP (麥芽糖結合蛋白)、凝集素(例如，伴刀豆蛋白)-甘露糖/葡萄糖結合蛋白的偶聯。因此，為了使所有核苷酸探針的全部堿基序列參與雜交，優選可以向核苷酸探針引入官能團從而將探針與載體共價結合并且可以引入配體以實現核苷酸探針與載體之間的親和結合。使用如下所述的多種官能團能夠完成實現核苷酸探針與固體支撐之間的共價連接的表面修飾羧基(-C00H)、磷酸酯基、氨基(-RNH2, -ArNH2 ；其中R表示H或C1-C6烷基)、 氯代甲基(-ArCH2Cl)、酰胺基(-CONH2)、醛(-CH0)、羥基(-0H)、環氧基、巰基等(參考2005 & 2010 Integrated DNATechnologies,Strategies for Attaching Oligonucleotides to Solid Supports) 0這些官能團可以單獨或者以兩種以上類型的組合使用。同時，用于實現核苷酸探針與固體支撐之間親和偶聯的技術可以通過如生物素-抗生物素蛋白/抗生物素蛋白鏈菌素、谷胱甘肽-GST、組氨酸-金屬離子、凝集素-糖蛋白、抗體-抗原等的多種系統來進行。在優選的實施方式中，在氨基修飾的核苷酸探針的情況下，氨基直接連接到核苷酸探針上，或者通過帶有短碳鏈的氨基C6接頭(linker)或氨基C12接頭來連接。此外，在核苷酸探針的固定技術中，通過末端基團的反應最有效并且連接基團優選引入到核苷酸的5’或3’ -活性末端基團。因此，核苷酸探針的5’ -端或3’ -端可以用能與載體共價結合的官能團來修飾。 核苷酸探針的修飾可以在核苷酸探針的制備過程中或者在將其用于膜之前在溶液狀態中進行。此外，核苷酸探針可以為，例如包括16至22個核苷酸的合成的低聚核苷酸。具體地，在能夠檢測結核分枝桿菌(TB)并識別對利福平和異煙胼的耐藥性的核苷酸探針的情況下，可以使用靶向對結核分枝桿菌菌種具有特異性的轉錄間間隔區(ITS， intertranscriptional spacer)基因位點的核苷酸探針用于識別結核分枝桿菌。為了確定對如利福平的抗結核藥物的敏感性和耐藥性，可以使用包含編碼RNA聚合酶β亞單位的基因的野生型-或突變型堿基序列的核苷酸探針。此外，為了確定對異煙胼的敏感性和耐藥性，也可以使用含有編碼katG(過氧化氫酶過氧化物酶)的基因位點以及inhA(烯酰基載體蛋白(ACP)還原酶)和ahpC(烷基過氧化物還原酶)的啟動子位點的野生型或突變型堿基序列的核苷酸探針。同時，當使用核苷酸探針來區分非結核分枝桿菌(NTM)和結核分枝桿菌(TB)的菌種時，也可以使用靶向分枝桿菌屬特異性的轉錄間間隔區(ITS)基因位點的核苷酸探針。此外，所述核苷酸探針優選含有能被分光鏡、光化學、生物化學、免疫學或化學方式直接或間接檢測的標記，并且在內部區域可以進一步含有間隔區以提高雜交位點內堿基序列(其能夠與靶堿基序列互補地結合)與載體之間的雜交效率。標記的實例包括酶(例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)、放射性同位素(例如，32P)、熒光分子和化學基團(例如，生物素)等。所述間隔區優選為非特異性的聚T尾，其可以加在氨基修飾位點之后。作為間隔區使用的聚T尾的長度可為5至30個胸腺嘧啶堿基。例如，可將核苷酸探針設計成在5’ -端標記氨基C6接頭，將作為間隔區的包括 10個胸腺嘧啶堿基的聚T尾與其連接，以及能與靶基因的核苷酸序列互補連接的雜交位點的堿基序列包括16至22個核苷酸。在本發明中，所述載體可為，例如多糖、蛋白質、合成聚合物等。其中，優選多糖，并且特備優選與核苷酸探針共價連接或親和結合的葡聚糖或其衍生物。在親和結合的情況下，例如，抗生物素/抗生物素蛋白鏈菌素、麥芽糖結合蛋白、 糖蛋白或金屬離子(Co、Ni、Cu等)等與載體連接，并且將能與其親和結合的作為配體的生物素、麥芽糖、凝集素、組氨酸或其衍生物標記在核苷酸探針上。其中，更優選生物素-抗生物素/抗生物素蛋白鏈菌素連接技術。由于葡聚糖具有多種活性基團，所以每個葡聚糖分子能夠固定多個DNA探針，因此能夠固定多種配體，例如天門冬氨酸和低聚核苷酸(參考GoSS，Τ. Α.等人， J.Chromatogr. 508,279-287,1990 ；Schacht Ε. H ^ A, Modification of Dextran and application in prodrug design. In Industrial polysaccharide Engineering Genetic Engineering, Structure/Property Relations and Applications Yalpani, Μ. , Ed.； Elsevier Amsterdam, 1987)。此外，葡聚糖是長的且柔性的聚合物，因此相當有利于促進固定的DNA分子的雜交，消除因固體支撐的表面引起的空間位阻(參考=Goris J.等人，Can J Microbiol, 44,1148-1153,1998 ；Shepinov Μ· S等人，Nucleic Acids Res.，25，1155-1161， 1999 ；Gingeras Τ. R等人，15，p. 13，1987 ；Penzol G等人，Biotechnol Bioeng. 60，518-523， 1998)。最為一個代表性的實例，醛基-天門冬氨酸-葡聚糖是具有相當大分子量的物質， 其具有陰離子和醛基，因此能夠與氨化的DNA探針形成非常強的共價連接，其中，該連接非常穩定從而能夠表現出對雜交混合物的極端PH、高溫或高濃度鹽、溶劑以及親核試劑的耐藥性(參考Fuentes Μ.等人，Biomacromolecules，5，883-888，2004)。在優選的實施方式中，所述載體可為通過氧化葡聚糖能夠形成醛官能團的多糖。例如，聚醛葡聚糖可以通過氧化43kDa的葡聚糖(與500kDa的葡聚糖相比，與核苷酸探針具有更高的結合效率)來制備。這種聚醛葡聚糖，例如，可通過以下步驟來制備將葡聚糖和1(104在預先確定的等摩爾量的62. 5mmol單位的葡萄糖中混合，以40rpm的速度旋轉該混合溶液，使該溶液靜置 6小時以上并用滅菌水透析該溶液三次(每個循環2小時)。如上所述，所述載體可為如白蛋白或合成聚合物的蛋白質。在這種情況下，官能團可與蛋白質或合成聚合物的氨基、巰基等共價連接，或者可將能與其親和結合的配體引入核苷酸探針。例如，聚醛葡聚糖載體與胺-標記的核苷酸探針在室溫下pH值為11時反應以形成希夫氏堿基(Schiff’ s base)的亞胺中間體，希夫氏堿基用例如硼氫化鈉的溫和的還原劑作為還原劑還原，促使不可逆的連接形成從而實現穩定的共價連接。核苷酸本身缺乏穩定性，但當向其施加足夠的能量時獲得與其他基團的反應活性。在如亞甲藍的光敏劑存在下將核苷酸暴露于可見光時，或者沒有任何光敏劑時將其暴露于UV，其能夠直接與蛋白質交聯(參考R Lalwani等人，J. Photochemistry and Photobiology 7,57-73,1990 Jff Hockensmith φ A, Methods in Enzymology,208, 211-236，1991)。通過制備活化的固體多孔支撐(例如，活化膜)來直接交聯核苷酸的方法存在兩個問題。第一個問題是損失活性。換言之，膜的化學活性表面與空氣反應并因此損失其活性。當化學活性增加時，即，當與靶的交聯速度提高時，活性損失的速度提高。為了解決這些問題，最近，制造商使用較低活性的基團，特異性地與靶探針本身反應。典型的實例為醛與胺之間的反應，這兩者均是相對穩定的。由于與生產、儲存和處理相關的活性固體的內在問題，活性膜根本不能用于與探針共價連接的目的。通常使用具有能與探針特異性地結合、同時表現出較低活性，并在儲存過程中活性隨著時間降低較慢的表面化學性質的膜。這種膜通常在其表面帶有胺或醛基。用醛活化表面的優勢在于通過希夫氏堿基的形成就可以形成重要的連接而無需加入任何其他試劑。希夫氏堿基是相對穩定的，但在生理條件下可以逆轉。因為這個原因，應該用硼氫化鈉作為溫和還原劑來還原希夫氏堿基從而形成不可逆的連接(MB Meza, “ Covalent Binding in Diagnostic Test Design" in The latex Course，2000)。第二個問題是在使用前應該封閉非特異性的連接和活化膜。如果不這樣，樣品則會與膜連接。封閉步驟應該簡單、快速并相當有效。理想的是，作為封閉結果，在膜的表面形成親水的不帶電荷的殘基。當在膜的表面形成保護膜(鈍化)時，引入新的化學官能團并且該膜可不具有對核苷酸的反應活性。但是，由于樣品連接或檢測系統的電荷吸引力或疏水吸引力會增加，而非特異性信號也會因此增加。除二硫鍵以外的大多數共價連接本身為分批過程，其包括將靶與膜連接然后封閉膜，因此需要大約30分鐘至數小時。這樣的偏差使自動化控制和大規模生產變得困難。光敏連接化學使大規模生產變得簡單，但增加了成本并且不實用。另一方面，本發明，例如，通過特異性地與聚醛葡聚糖(通過活化(氧化)作為載體的葡聚糖)反應的氨基修飾的核苷酸探針的共價結合而解決了這些問題，因此使大規模生產成為可能，并且不另外需要其他有毒試劑，這從通過使用1-乙基-3- [3- 二甲基氨基丙基]碳化亞胺鹽酸鹽(EDC或EDAC)的胺基和羧基之間的共價連接可以看出，因此降低了與使用有機溶劑相關的成本。在優選的實施方式中，所述多孔固體支撐可為膜并且其基底(substrate)可為纖維素或尼龍。用于核苷酸固定的固體支撐的實例包括膜(硝化纖維素或尼龍膜)、玻璃珠(可控孔度玻璃珠)、丙烯酰胺凝膠、聚苯乙烯基體、活化的葡聚糖、抗生物素蛋白涂覆的聚苯乙烯珠和玻璃等，并且將這些不同的固體支撐用于DNA診斷(參考Saiki R.K et al,PNAS, 86,6230-6234,1989 ；Meinkoth Jet al, Anal. Biochem,138,267-284,1984 ；Ghosh S. S et al, Nucl. Acids Res. , 15, 5353-5372,1987 ；Rasmussen S. R 等人，Anal. Biochem, 198, 138-142,1991 ；Gingeras Τ. R, Nucl. Acids Res.，15，5373-5390，1987 ；Lund V.等人，Nucl. Acids Res. ，16，10861-10880，1988)。本發明主要研究了將多種靶物質固定到多孔固體支撐上的機制，在這些多種固體支撐中特別研究了膜。所述膜包括能用于核苷酸固定的大范圍的物質。具體地，所述膜的實例包括常規的鑄膜，例如硝化纖維素和尼龍；新型膜，例如陶瓷或徑跡蝕刻膜；以及用于微點陣的基底型膜(substrate-type membrance)。應該確定用于核苷酸固定的多種建議的膜的最佳連接狀態。在任何一種連接技術中，核苷酸可以以不可控的方式加到膜上。在這種情況下，由于核苷酸探針不會排列成其主要的方向，所以反應能夠潛在地受限。因此，在大多數情況下，定向吸附，即本申請中的固定核苷酸的末端連接是優選的。硝化纖維素的主要優點為可快速適用性，但除非通過烘干聚酯涂覆硝化纖維素， 否則該性能較弱，并且與其他膜相比具有較低的結合力。近來，尼龍具有更高的物理強度和更高的結合力，其具有更寬范圍的可用表面化合性質，能夠最優化核苷酸的粘附，并因此促使其成為用于核苷酸連接的基底。將核苷酸與硝化纖維素連接最常使用的是物理吸附，而尼龍膜上的固定是通過物理吸附、UV交聯或化學活化來實現的。如上所述，本發明能夠解決常規物理吸附工藝的問題。但是，就生產和制造效率而言，物理吸附是相當簡單和粗糙的技術(參考=TC Tisone, IVDTechnology 6，no. 3，43-60， 2000)。當在干燥過程中通過連續工藝將材料用于連接時，基于膜的系統的簡單生產是最容易的。可將可固定的材料用于連續工藝，并且通過簡單且控制良好的工藝(即，干燥)來進行連接。如果解決了物理吸附的特定問題，S卩，加強物理吸附從而使更強的直接連接成為可能，作為用于核苷酸診斷試驗的大規模生產的技術，物理吸附是有益的。就此而言，本發明可進一步包括在載體與多孔固體支撐的孔之間通過干燥形成的物理吸附結合物。大多數加強的物理吸附技術不僅提高與非常短的探針的結合效率，而且也使探針的重要堿基序列排列成在遠離固體表面的方向上突出。結果，在加入的樣品與重要的堿基序列之間可以發生自由的相互作用。特別是即使使用短探針，由于提高了選擇性和敏感性， 物理吸附技術也相當有效。
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就此而言，根據本發明，核苷酸探針的重要堿基序列具有通過共價連接將它們排列成遠離多孔固體支撐表面的方向的取向。在本發明中，所述真空轉移優選包括在自動線印跡裝置(automatic line blotter)的核苷酸狹縫線(slit line)上裝入核苷酸探針-載體結合物以及采用真空泵將結合物吸附到多孔固體支撐上。本發明還提供了由所述方法制備的核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條。根據本發明的核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條本身具有特定的結構，該結構通過如上所述的特定制備工藝而與常規支撐條區分開來。有益效果從上文中可以明顯地看出，本發明通過將核苷酸探針與載體結合而有效地確保了核苷酸探針的取向，避免了固定在固體支撐表面上的核苷酸的重排，并且由于與靶堿基序列互補連接的雜交堿基序列的一部分未被固定，所以防止了由于降低的活性而引起的異常雜交。此外，本發明有效地避免了常規方法中涉及的控制UV最佳照射量的不便之處，并且由于所述方法不采用常規方法(其中通過共價連接固定核苷酸探針)本身所需要的分批過程，因此實現了大規模生產和自動化處理。換言之，本發明有效地制備核苷酸-探針檢驗系統，其能夠采用低成本通過大規模生產以簡單的方式來快速實現，其具有再現性，防止膜表面干擾靶堿基序列與核苷酸探針之間的相互作用，從而有利于這兩者之間的雜交并且表現出優良的穩定性和敏感性。


聯系附圖從下文詳細描述中將會更清晰地理解本發明的上述和其他目的、特點和其他優點，在附圖中圖1為圖示制備條的整個過程的視圖，包括通過共價連接將核苷酸低聚核苷酸探針與作為載體的葡聚糖結合以及通過真空轉移將該結合物固定到膜上；圖2為顯示其中將核苷酸探針與專利藍色V染料(作為藍色染料)一起涂覆在膜條上的狀態的圖，其中，上部的探針為根據一個實施方式檢測對利福平、異煙胼的敏感性/ 耐藥性的探針，下部的探針為根據另一個實施方式識別和檢測分枝桿菌屬的探針；圖3為顯示由用于利福平和異煙胼敏感性/耐藥性樣本的PCR和反向雜交線印跡檢驗而得到的圖；以及圖4為顯示由用于分枝桿菌樣本和對照(陰性、陽性)組的PCR和反向雜交線印跡檢驗而得到的圖。
具體實施例方式現在，將參照下面的實施例更詳細地描述本發明。這些實施例僅用于解釋說明本發明而不應用于限制本發明的范圍和實質。下面的實驗涉及通過真空轉移將核苷酸探針固定到膜上來制備條的方法以及證實下列有效性的實驗(i)檢測結核分枝桿菌和確認對利福平和異煙胼藥物的耐藥性的實驗，( )采用兩個具體實施例中使用膜條的反向雜交線印跡檢驗法來進行檢測和識別分支桿菌的實驗，即，在痰液、支氣管沖洗液、腦脊液、尿液、組織、全血和培養菌株中區分結核分枝桿菌(TB)和非結核分枝桿菌(NTM)。實施例1 制備聚酵葡聚糖(PAD)(1)所需試劑和儀器的準備使用葡聚糖(Sigma，D-4133，Mr 43kDa)、KIO4 (Aldrich, 32242-3, F. W230. 00)、 纖維素透析膜截留 12000 :Spectra/Por,MWCO 12-14000)、鹽酸羥胺(NH2OH-HCl = 69. 49)、 甲基橙粉末、ION鹽酸、酸度計、0. IN氫氧化鈉(NaOH)、冷凍干燥機和真空離心蒸發濃縮器寸。(2)氧化葡聚糖的制備將0. 5g的葡聚糖(Sigma, D-4133, Mr 43kDa/相當于62. 5mmol的葡萄糖)完全溶解在熱壓處理過的D. W中從而將總體積調節至10ml。向其中加入0. 72g的KIO4(相當于 62. 5mmol 的相同當量)(參考Azzam T 等人，J. Med. Chem.，45，1817-1824，2002 ；Azzam T 等人，Macromolecules, 35,9947-9953, 2002 ；Azzam T 等人，J. Controlled Release, 96, 309-323,2004 ；Hosseinkhani H. et al, . Gene Therapy，11，194-203，2004)。將得到的混合物保持6至12小時同時在40rpm的速度下旋轉。將氧化葡聚糖加到纖維素透析膜上，在2L滅菌三蒸水中0/N透析一次并繼續透析，總共三次，每次透析2小時并更換滅菌蒸餾水。透析后，準確測量聚醛葡聚糖的體積。根據Huiru Zhao等人在期刊中報道的公開方法(Pharmaceutical Research, 8, 400-402，1991)來測量氧化葡聚糖中醛基的量。首先，通過將1. 75g的干燥鹽酸羥胺溶解于 15ml的滅菌蒸餾水中來制備0.25N鹽酸羥胺-甲基橙(pH4. 0)試劑。單獨地，制備0.6ml 的終濃度為0. 05%的甲基橙試劑并將其加入鹽酸羥胺溶液。將ION HCl緩慢加入制得的混合物中以調節pH值至4.0，并用滅菌蒸餾水稀釋該溶液以制備IOOml的0. 25N鹽酸羥胺-甲基橙(pH 4. 0)試劑。用0. IN NaOH標準溶液對聚醛葡聚糖進行氧化-還原滴定。透析后，將1. 25ml的 0. 25N鹽酸羥胺-甲基橙(pH 4. 0)溶液加入到100 μ L制得的聚醛葡聚糖中，接著在室溫下進行反應2小時，同時在40rpm下旋轉。然后，用0. IN NaOH作為標準溶液進行滴定。準確測量在氧化-還原滴定中加入的NaOH的體積(yL)并且可以從顏色的變化(顏色從紅色變為黃色)看出滴定終點。聚醛葡聚糖的氧化-還原反應和醛基的取代水平的計算顯示在下面的公式中，并且計算在透析后測量的聚醛葡聚糖(PAD)的總體積中存在的醛基的總摩爾數并將其顯示在下表1中。葡聚糖-(CHO)η+Η2Ν-0Η · HCl =葡聚糖 _(CH = N_0H)n+H20+HCl (1)HCl+NaOH = NaCl+H20(2)醛基的取代水平
(SaQH體積(mL) χ NNaOH) χ 10'3 mol_ CHO的摩爾數
樣品重量(g) χ 葡聚糖(MW)葡聚糖的摩爾數[表1]
權利要求
1.一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法，其包括將核苷酸探針與載體連接以制備結合物；以及通過真空轉移將所述結合物固定在多孔固體支撐上。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探針為選自DNA、RNA和PNA中的至少一種。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探針與所述載體之間的連接為共價連接，或者為具有與共價連接相當的結合力的親和結合。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探針的5’-端或3’ -端用能與載體共價連接或親和結合的官能團或配體修飾。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，所述官能團為選自羧基(-C00H)、磷酸酯基、氨基(-RNH2, -ArNH2 ；其中，R為H或C1-C6烷基)、氯代甲基(-ArCH2Cl)、酰胺基(-CONH2)、醛基(-CH0)、羥基(-0H)、環氧基和巰基中的至少一種。
6.根據權利要求4所述的方法，其中，所述配體為選自生物素、谷胱甘肽、麥芽糖、組氨酸、凝集素及其衍生物中的至少一種。
7.根據權利要求5所述的方法，其中，所述氨基直接與所述核苷酸探針連接。
8.根據權利要求6所述的方法，其中，所述配體直接與所述核苷酸探針連接。
9.根據權利要求5所述的方法，其中，所述氨基為具有短碳鏈的氨基C6接頭或氨基C12接頭。
10.根據權利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探針包含能被分光鏡、光化學、生物化學、免疫學或化學的方式直接或間接檢測的標記。
11.根據權利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸探針為合成的低聚核苷酸。
12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述合成的低聚核苷酸包含16至22個核苷酸。
13.根據權利要求4所述的方法，其中，所述核苷酸探針包含間隔區以提高在內部區域內的雜交效率。
14.根據權利要求13所述的方法，其中，所述間隔區為非特異性聚T尾。
15.根據權利要求1所述的方法，其中，所述載體為選自多糖、蛋白質和合成聚合物中的至少一種。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，所述載體為葡聚糖或葡聚糖衍生物。
17.根據權利要求16所述的方法，其中，所述葡聚糖衍生物為氧化葡聚糖。
18.根據權利要求17所述的方法，其中，所述氧化葡聚糖為聚醛葡聚糖。
19.根據權利要求1所述的方法，其中，所述結合物通過胺-標記的核苷酸探針與作為載體的聚醛葡聚糖反應以形成希夫氏堿基的亞胺中間體并采用還原劑還原該希夫氏堿基以引發不可逆的連接來制備。
20.根據權利要求1所述的方法，其中，所述多孔固體支撐為膜。
21.根據權利要求20所述的方法，其中，所述膜由硝化纖維素或尼龍組成。
22.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括在所述載體和所述多孔固體支撐之間物理吸附所述結合物。
23.根據權利要求1所述的方法，其中，所述真空轉移包括在自動線印跡裝置的核苷酸狹縫線上裝入所述核苷酸探針與載體的結合物；以及采用真空泵將該結合物吸附到多孔固體支撐上。
24.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括用預雜交緩沖液預處理所述固體支撐。
25.根據權利要求M所述的方法，其中，所述預雜交緩沖液為含有登哈特溶液、SSC、SDS和變性的鮭精DNA的組合物。
26.一種核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條，其由根據權利要求1至25中任一項所述的方法制備。
全文摘要
本申請公開了一種制備核苷酸探針涂覆的多孔固體支撐條的方法。所述方法包括將核苷酸探針與載體連接以制備結合物并通過真空轉移將該結合物固定到多孔固體支撐上。
文檔編號C12Q1/68GK102559877SQ201110431650
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月16日 優先權日2010年12月16日
發明者俞恩珠, 吳宰勛, 姜鎮錫, 樸榮石, 權準徹 申請人:株式會社Lg生命科學