專利名稱：藏獒源犬細小病毒的分離鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種藏獒源犬細小病毒的分離鑒定方法，屬于病毒學技術領域。
背景技術：
藏獒生活在青藏高原，已有3000多年的育成歷史，主要分布于我國西部地區的西藏、青海和四川等省區，不僅是我國特有的珍貴犬種，而且也是我國人民引以驕傲和自豪的保種動物。所以目前在所有品種的犬中只有藏獒的價格高居不下。盡管藏獒經歷了漫長的自然和人工選擇以及嚴酷的生存環境使藏獒具備了非一般犬所具備的智力、體能、適應性和抗病力，但是近年來，犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)對藏獒特別是藏獒幼犬的感染和危害越來越嚴重，其發病率和死亡率比一般的犬種更高，成為當前危害藏獒養殖業最嚴重的傳染病。雖經注射過國產疫苗或進口疫苗，但仍有部分藏獒得不到有效保護，甚至有一些患犬久治不愈最終死亡。這不僅使許多藏獒養殖戶經濟上蒙受巨大的損失，而且導致藏獒的保種與市場開發受到極大的挑戰。目前國內外對CPV分離鑒定的報道很多，但藏獒源CPV的分離鑒定卻鮮有報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種藏獒源犬細小病毒的分離鑒定方法。藏獒源犬細小病毒的分離鑒定方法，包括以下步驟Al、病料采集與處理臨床上經CPV膠體金試紙檢測為陽性的藏獒，將滅菌棉簽伸入發病藏獒肛門，擦拭直腸壁，沾取腸黏膜上皮，將棉簽頭置于1. 5ml EP管，加入無血清的DMEM至Iml ；反復凍融3次，每次化凍后在振蕩器上振蕩IImin后再進行下一次凍融； 凍融后將液體轉入15ml離心管中，用無血清DMEM反復沖洗、振蕩棉簽頭3_4次，并將沖洗后的液體也轉入離心管中，最后加無血清DMEM至10ml，制成10%混懸液；8000rpm離心 10-15min ；取上清液，0. 22um微孔濾膜過濾后，置于_20°C備用；A2、病毒分離10%混懸液按1 30-1 60同步接毒F81細胞，加入含15% FBS的 DMEM后，置于37°C、5% CO2中2_4h，換液，PBS蕩洗細胞1_2次，加15% DMEM，繼續培養Mh ； 每天觀察細胞，配制含FBS 15%和5%的DMEM，根據細胞生長情況及時改變FBS的濃度； 長滿一層后仍不出現CPE，按常規方法傳代，如傳至第5代仍無CPE，則視為病毒分離陰性； 細胞若出現大面積CPE時收細胞和上層培養液，反復凍融3次，IOOOOrpm,離心10-15min ； 取出上清，調節PH值到7. 2-7. 5，加入乙二醇至最終濃度為8% (w/v)；置于4°C中濁后， llOOOrpm，濃縮2h，加入少量無血清DMEM溶解病毒團塊，置于_20°C中備用；A3,PCR鑒定；根據GenBank上公布的CPV的VP2核酸序列分別設計擴增VP2片段的特異性引物一對P1、P2 ；擴增VP2全基因的特異性引物一對P3、P4 ；擴增的目的片段大小分別為825bp和1755bp ；由上海Invitrogen公司合成，引物序列為上游引物Pl :5，-AACGGATGGGTGGAAATCAC-3，；
下游引物P2 :5，-TAATAGTAGCTTCAGTAATA-3，；上游弓丨物P3 5，-CCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3，；下游引物P4 5，-AATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGA-3，。本發明從8份患病藏獒的直腸棉拭子中成功分離到6株CPV，分析比對其VP2全基因序列，均為CPV-2a。1978年首次發現CPV至今已有CPV-2，CPV_2a，CPV_2b，CPV_2c等亞型，國內CPV仍以CPV-加流行為主。病毒由CPV-2進化為CPV-加是由于VP2上四個氨基酸殘基位點(L87M，I101T, A300G, D305Y)發生了變異，本次分離的6個毒株在上述四個位點的變異情況與CPV-加的相同，說明CPV在藏獒中的流行情況與在國內的流行情況一致。本發明嘗試了用直腸棉簽拭子法采樣，既能保證樣品的新鮮度、減少污染，又能及時采到樣品、節約采樣時間。


圖1為CPV分離株在F81細胞上的變化；a 正常的F81細胞；b :CPV_YA_ZA1在F81 細胞上出現的CPE ；c :CPV-YA-ZA2在F81細胞上出現的CPE ；d :CPV_YA_ZA4在F81細胞上出現的CPE ；e :CPV-YA-ZA5在F81細胞上出現的CPE ；f :CPV_CD_ZA1在F81細胞上出現的 CPE ；g CPV-LS-ZAl 在 F81 細胞上出現的 CPE ；圖 2 為 6 株分離病毒 PCR 結果；M :D-2000Marker ；1 =CPV-YA-ZAl ；2 :CPV-YA_ZA23 CPV-YA-ZA4 ；4 :CPV-YA-ZA5 ；5 =CPV-CD-ZAl ；6 =CPV-LS-ZAl ；圖3為6株分離病毒VP2全序列擴增結果；M :D-2000Marker ；1 =CPV-YA-ZAl ；2 CPV-YA-ZA2 ；3 :CPV-YA-ZA4 ；4 :CPV-YA_ZA5 ；5 =CPV-CD-ZA 1 ；6 =CPV-LS-ZA 1 ；圖4為熱、酸和有機溶劑處理前后各分離株TCID5tl效價的比較。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。1材料與方法1. 1病料采集與處理臨床上經CPV膠體金試紙(韓國BI0INDIST)檢測為陽性的藏獒，將滅菌棉簽伸入發病藏獒肛門，擦拭直腸壁，沾取腸黏膜上皮，將棉簽頭置于1. 5ml EP管，加入無血清的 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)至lml。反復凍融3次，每次化凍后在振蕩器上振蕩Ι-aiiin后再進行下一次凍融。凍融后將液體轉入15ml離心管中，用無血清DMEM反復沖洗、振蕩棉簽頭3-4次，并將沖洗后的液體也轉入離心管中，最后加無血清DMEM至10ml， 制成10%混懸液。8000rpm離心10-15min。取上清液，0. 22um微孔濾膜過濾后，置于_20°C 備用。1. 2主要試劑F81貓腎傳代細胞(簡稱為F81細胞)購于中科院上海細胞庫，Takara Ex Taq Polymerase (5U/ul)購于寶生物(大連)有限公司，DP438_magnetic viral DNA/RNA kit、 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、Maker D2000購于天根生化科技，小牛血清(FBQ、L-谷氨酰胺、DMEM培養液購于GIBC0。1.3引物設計
根據GenBank上公布的CPV的VP2核酸序列分別設計擴增VP2片段(Pl，P2)和 VP2全基因(P3，P4)特異性引物各一對，擴增的目的片段大小分別為825bp和1755bp ；由上海hvitrogen公司合成，引物序列為上游引物P1 5，-AACGGATGGGTGGAAATCAC-3，下游引物P2 5，-TAATAGTAGCTTCAGTAATA-3，上游引物P3 5，-CCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3，下游引物P4 5，-AATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGA-3，1. 4病毒分離10%混懸液按1 30-1 60同步接毒F81細胞，加入含15% FBS的DMEM(后簡稱 15% DMEM)后，置于 37°C>5% CO2 中 2_4h，換液，PBS 蕩洗細胞 1-2 次，加 15% DMEM, m 續培養Mh。每天觀察細胞，配制含FBS 15%和5%的DMEM，根據細胞生長情況及時改變 FBS的濃度。長滿一層后仍不出現CPE，按常規方法傳代，如傳至第5代仍無CPE，則視為病毒分離陰性；細胞若出現大面積(70% 85%) CPE時收細胞和上層培養液，反復凍融3次， lOOOOrpm，離心 10_15min。取出上清，調節 PH 值到 7. 2-7. 5，加入乙二醇(PEG, MW = 6，000) 至最終濃度為8% (w/v)。置于4°C中濁后，IlOOOrpm,濃縮濁，加入少量無血清DMEM溶解病毒團塊，置于-20°C中備用。1.5PCR 鑒定1.5. IDNA 提取將1. 4中濃縮后病毒液200ul加入1. 5mlEP管中，按照Magnetic Viral DNA/RNA Kit說明書提取病毒DNA，進行下一步PCR擴增，或者置于-20°C保存，避免反復凍融。1. 5. 2VP2特異性片段的PCR擴增采用25ul 體系進行擴增模板 DNA 1. Oul ；TaKaRa Ex Taq (5U/ul) 0. 125ul ； IOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus) 2. 5ul ；dNTP Mixture (各 2. 5mM) 2ul ；上游引物(Pl)Iul ；下游引物(P2)lul ；加入滅菌水使反應體系達到25ul。PCR程序為96°C預變性180s，94°C變性30s ；52°C退火35s ；72°C延伸40s ；30個循環，最后延伸IOmin0 PCR結束后，1 %瓊脂糖凝膠電泳，觀察并記錄結果。1. 5. 3VP2全基因的PCR擴增采用50ul 體系進行擴增模板 DNA2. 5ul ；TaKaRa Ex Taq(5U/ul)0. 25ul ； 10 X Ex Taq Buffer (Mg2+Plus) 5. Oul ；dNTP Mixture (各 2. 5mM) 4ul ；上游引物(P3)2ul ；下游引物 (P4)2ul ；加入滅菌水使反應體系達到50ul。PCR程序為預變性96°C 180s，變性95°C 30s, 退火50°C 30s，延伸72°C 140s，35個循環，最后延伸lOmin。PCR完成后，在0. 8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，觀察并將目的條帶切下，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目的產物進行回收后送由上海hvitrogen公司測序。1. 6 血凝試驗(HA)無菌采集健康豬、牛、山羊、小鼠、狗、貓、兔等血液，以阿氏液為抗凝劑。用 PBS洗滌紅細胞3-5次制成紅細胞泥，最后加入含0.1% (w/v)牛血清白蛋白(bovine serumalbumin)的PBS，制成1 %紅細胞懸液(ν/ν)。按常規方法測定各分離毒株對上述動物紅細胞的HA效價。1. 7TCID5Q 效價測定
將各分離株第5代細胞培養物(含10% FBS的DMEM)做倍比稀釋(Κ^-ΙΟ—6)。在 96孔細胞培養板的每個孔中加入處于對數增長期F81細胞IOOul (約1. 5 X IO4個/孔)。 再加入各個稀釋度病毒液lOOul，最后兩個孔加入10% FBS的DMEMlOOul做空白對照，同一細胞培養板上做8次重復。置于37°C中讓細胞貼壁和病毒吸附2- 后用PBS沖洗1-2遍， 再往每孔中加入10% FBS的DMEM200ul繼續培養。此后每天觀察CPE，至第5天判讀結果。 以 Reed-Muench 法計算 TCID5tl 效價。1. 8病毒理化性質檢測將各分離株病毒進行如下處理60°C水浴作用30min ；4°C, PH = 3的環境中作用 2h;48%氯仿4°C作用IOmin ；20%乙醚4°C過夜。然后再按1. 7的方法計算出各分離株 TCID5tl 效價。2 結果2. 1病毒分離采集的8份藏獒直腸棉拭子經過處理，有6份在接種F81細胞后6_13d出現了較為明顯的CPE，即表現為細胞融合、變圓或者細胞變細變長，呈現“拉網”病變(見圖1)，同批次空白對照細胞正常。各分離株依次被命名為CPV-YA-ZA1、CPV-YA-ZA2、CPV-YA-ZA4、 CPV-YA-ZA5, CPV-CD-ZA UCPV-LS-ZA 1。2. 2PCR鑒定及基因型結果2. 2. 1VP2特異性片段的擴增結果用引物P1、P2進行PCR擴增后的產物在瓊脂糖凝膠中電泳后出現了與預期值 825bp大小相符的特異性條帶(圖幻。表明各分離株的細胞培養物中存在CPV。2. 2. 2VP2全基因擴增結果用引物P3、P4進行PCR擴增后的產物在0. 8%瓊脂糖凝膠中電泳后出現了與預期值1755bp大小相符的特異性性條帶(圖幻，說明擴增出VP2的全基因序列。將分離株所測得的序列與GenBank中CPV的VP2序列進行比對，6個分離株均為CPV-加。2. 3分離株血凝試驗結果各分離株細胞培養物與豬、牛、山羊、小鼠、狗、貓、兔紅細胞進行凝集反應，結果見表1。實驗結果表明分離株對豬紅細胞能很好的凝集，對貓紅細胞有一定凝集能力，但對其他動物的紅細胞基本不凝集。表1各分離株血凝結果
權利要求
1. 一種藏獒源犬細小病毒的分離鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟 Al、病料采集與處理臨床上經CPV膠體金試紙檢測為陽性的藏獒，將滅菌棉簽伸入發病藏獒肛門，擦拭直腸壁，沾取腸黏膜上皮，將棉簽頭置于1. 5ml EP管，加入無血清的DMEM 至Iml ；反復凍融3次，每次化凍后在振蕩器上振蕩Ι-aiiin后再進行下一次凍融；凍融后將液體轉入15ml離心管中，用無血清DMEM反復沖洗、振蕩棉簽頭3_4次，并將沖洗后的液體也轉入離心管中，最后加無血清DMEM至10ml，制成10%混懸液；8000rpm離心10_15min ；取上清液，0. 22um微孔濾膜過濾后，置于-20°C備用；A2、病毒分離10%混懸液按1 30-1 60同步接毒F81細胞，加入含15%FBS的DMEM 后，置于37°C、5% CO2中2-4h，換液，PBS蕩洗細胞1_2次，加15% DMEM，繼續培養Mh ；每天觀察細胞，配制含FBS 15%和5%的DMEM，根據細胞生長情況及時改變FBS的濃度；長滿一層后仍不出現CPE，按常規方法傳代，如傳至第5代仍無CPE，則視為病毒分離陰性；細胞若出現大面積CPE時收細胞和上層培養液，反復凍融3次，IOOOOrpm,離心10-15min ；取出上清，調節PH值到7. 2-7. 5，加入乙二醇至最終濃度為8 % (w/v)；置于4°C中2h后，1 IOOOrpm, 濃縮2h，加入少量無血清DMEM溶解病毒團塊，置于_20°C中備用；A3、PCR鑒定；根據GenBank上公布的CPV的VP2核酸序列分別設計擴增VP2片段的特異性引物一對P1、P2 ；擴增VP2全基因的特異性引物一對P3、P4 ；擴增的目的片段大小分別為825bp和1755bp ；由上海Invitrogen公司合成，引物序列為 上游引物 Pl :5’ -AACGGATGGGTGGAAATCAC-3， 下游引物 P2 :5’ -TAATAGTAGCTTCAGTAATA-3’ 上游引物 P3 :5’ -CCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3， 下游引物 P4 :5，-AATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGA-3，。
全文摘要
本發明公開了一種藏獒源犬細小病毒的分離鑒定方法，包括以下步驟A1、病料采集與處理；A2、病毒分離；A3、PCR鑒定；本發明嘗試了用直腸棉簽拭子法采樣，既能保證樣品的新鮮度、減少污染，又能及時采到樣品、節約采樣時間。
文檔編號C12R1/93GK102533670SQ20111044261
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者卿佰春, 張恒, 彭廣能, 李思琪, 梁璐琪, 王英柱, 符華林, 舒龍, 鐘志軍, 魏勝男 申請人:四川農業大學