專利名稱：用于同時檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、i型和ii型犬腺病毒的多重pcr檢測引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一套檢測病毒的引物，尤其涉及一套用于同時檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒多重PCR方法的引物，屬于病毒的檢測領域。
背景技術：
犬痕熱病毒(Caninedistemper virus, CDV)、犬細小病毒(Canine parvovirus, CPV)和犬腺病毒(Canine adenovirus,CAV)是引起犬發病的主要病原，這3種病毒單一或混感后臨床致死率可達50% -100%，給養犬業造成巨大經濟損失。臨床上，⑶V引起的犬瘟熱主要有呼吸型、消化型、神經型和混合型四種，CPV主要引起犬急性出血性胃腸炎和幼犬急性心肌炎。CAV根據其血凝和中和試驗等特性不同可將 CAV分為I型和2型，即CAV-I和CAV-II。。CAV-I在臨床上可導致犬傳染性肝炎、狐貍和熊腦炎的發生。CAV-II引起犬、狐傳染性喉氣管炎。犬的這幾種主要疾病臨床癥狀相似，并常有混合感染，給診斷造成困難。常用的單項PCR方法耗時長，有必要建立快速的早期診斷方法，以便盡快采取有效的防控措施，減少這些疾病對養犬業造成的危害。鑒于此，本試驗建立了⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II的多重 PCR檢測方法，為臨床檢測提供保障

發明內容
本發明所要解決的結束問題是克服現有技術的不足，提供一套可用于檢測犬瘟熱病毒野毒株的RT-LAMP引物。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的本發明的一套用于檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR 檢測引物，其特征在于所述引物包括三對引物，其中，所述的用于犬瘟熱病毒檢測的引物序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示；所述的用于犬細小病毒檢測的引物序列分別為 SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4所示；所述的用于I型和II型犬腺病毒檢測的引物序列為 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 所示。本發明還提供了一種檢測犬瘟熱病毒(⑶V)、犬細小病毒(CPV)、1型和II型犬腺病毒(CAV-I、CAV-II)的方法，其特征在于包括以下步驟配制25 ii L PCR 反應體系10X Ex Buffer 2. 5 U L, dNTPs 2 U L, Ex Taq DNA 聚合酶 0. 25 u L、CDV-Nl 和 CDV-N2 各 0. 35 y L、CPV-NSl 和 CPV-NS2 各 0. 35 y L、CAV-E31 和 CAV-E32 各 0. 65 ii L、CDV 模板 0. 75 u L、CPV 模板 0. 75 u L、CAV-1 模板 0. 75 u L、CAV-II 模板 I. 5 u L、滅菌 ddH20 13. 5 u L ；其中，引物⑶V-Nl和⑶V-N2用于犬瘟熱病毒的檢測，其序列分別為SEQ IDNO : I 和SEQ ID NO :2所示；引物CPV-NSl和CPV-NS2用于犬細小病毒的檢測，其序列分別為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示；引物CAV-E31和CAV-E32用于I型和II型犬腺病毒的檢測，其序列分別為SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示；
PCR 反應程序94°C預變性 5min ;94°C變性 30S，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 30個循環；72°C延伸IOmin ；觀察取L PCR產物，經I %瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統觀察結果。進一步的，本發明還提供了一種用于檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的試劑盒，其特征在于包含本發明所述的引物。更進一步的，本發明還提供了所述的引物在制備檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I 型和II型犬腺病毒單一感染或混合感染試劑中的應用。及所述的試劑盒在制備檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒單一感染或混合感染試劑中的應用。以本發明所設計的引物采用多重PCR檢測方法對⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II進行檢測，檢測結果均為陽性，而對其他常見犬源性病毒檢測結果均為陰性。應用本發明引物序列采用多重PCR方法，可以同時檢測⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等優點。本發明所設計的引物序列在發病犬早期檢測和快速診斷中具有重要意義。


圖I為多重PCR擴增結果；I :陰性對照；2 CDV ；3 CPV ；4 CAV-I ；5 =CAV-II ；6 CDV+CPV+CAV-I+CAV-II ；M DL 2000 DNA Marker圖2為多重PCR特異性試驗結果；I CDV ；2 CPV ；3 CAV-I ；4 =CAV-II ；5 :CDV+CPV+CAV-I+CAV_II ；6 RV ；7 陰性對照；M DL 2000DNA Marker圖3為多重PCR敏感性試驗結果。M DL 2000DNA Marker ;1 :陰性對照；2 10_1 ；3 :1(T2 ；4 :1(T3 ；5 :1(T4 ；6 :1(T5 ；7 1(T具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例II材料和方法I. I病毒株⑶V株、CPV株、CAV-I、CAV-II株及狂犬病毒(RV)株均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所保存。I. 2主要試劑Ex Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL 2000DNA Marker、M-MLV 酶和 RNA 酶抑制劑購自購自寶生物工程(大連)公司；DNA提取試劑盒購自Omega公司；RNA提取試劑盒購自Qiagen 公司。
I. 3引物設計分別根據GenBank中CBVN基因序列、CPVNS基因序列和CAV E3基因序列，設計3 對特異引物，引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。序列見表I。表I多重PCR引物序列
引物_序列(5'-3')._長度(bp)
TGCGGTCTTACATTTGCATC ( SEQ ID NO. I )
CDV507
ACTCCAGAGCAATGGGTAGGG ( SEQ ID N0.2 )
CPVATGGTTGGTGACTCTTTGTTT ( SEQ ID N0.3 )287
ACATTTGATTGACACTTCCC ( SEQ ID N0.4 )
CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC ( SEQ ID N0.5 )
CAV-I/II 590/1027 _CCTAGAGCACTTCGTGTCCGCTT ( SEQ ID N0.6 )_I. 4RNA 和 DNA 的提取按RNA提取試劑盒和DNA抽提試劑盒說明書分別提取病毒RNA和病毒DNA。I. 5多重PCR方法建立以CDV的cDNA和CPV、CAV-I, CAV-II的DNA混合物作為多重PCR的模板，建立 PCR 反應。采用 25 ii L 反應體系10 X Ex Buffer 2. 5 u L, dNTPs 2 u L, Ex Taq DNA 聚合 SI 0. 25 u L、CDV-Nl 和 CDV-N2 各 0. 35 y L、CPV-NS I 和 CPV-NS2 各 0. 35 y L、CAV-E31 和 CAV-E32 各 0. 65 ii L、CDV 模板 0. 75 u L、CPV 模板 0. 75 u L、CAV-1 模板 0. 75 u L、CAV-II 模板 I. L、滅菌 ddH20 13. 5 u L0 反應程序:94°C預變性 5min ;94°C變性 30S，55°C退火 30s， 72°C延伸lmin，共30個循環；72°C延伸lOmin。取5 y L PCR產物，經I %瓊脂糖凝膠電泳， 于凝膠成像系統觀察結果。I. 6多重PCR方法的特異性試驗以優化的多重PCR條件對CDV、CPV、CAV_I、CAV-II和RV進行PCR擴增，以檢測該
方法的特異性。I. 7多重PCR方法的敏感性試驗分別測定⑶V、CPV、CAV_I和CAV-II的模板濃度，稀釋成相同濃度后，再10倍梯度稀釋，測定該雙重PCR方法的敏感性。2 結果2. I多重PCR的擴增采用優化的PCR方法，對⑶V、CPV、CAV-I和CAV-II的核酸模板及混合模板進行 PCR擴增，結果獲得大小約為500bp、300bp、600bp和IOOObp的片段，與測序結果507bp、 287bp、598bp和1 027bp 一致，結果如圖I所示。2. 2多重PCR的特異性試驗用建立的多重PCR 方法，對 CDV、CDV+CPV+CAV-I+CAV-II、CPV、CAV-I, CAV-II, RV和健康犬的核酸提取物進行擴增，結果顯示，只有CDV、CDV+CPV+CAV-I+CAV-II、CPV、CAV-I、 CAV-II有特異性的擴增產物，而RV未見擴增，表明該方法具良好特異性(圖2所示。)。2. 3多重PCR的敏感性試驗 在優化的PCR反應條件下，CDV的最高檢測敏感度為10_7 (IOh9TCID5tl)，CPV的最高檢測敏感度為IO^7 (IOl7TCID50), CAV-I的最高檢測敏感度為IO^7 (IOl7TCID50), CAV-II的最高檢測敏感度為IO^(IO2-2TCID50)(圖3所示。)。
權利要求
1.一套用于檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR檢測引物，其特征在于所述引物包括三對引物，其中，所述的用于犬瘟熱病毒檢測的引物序列為SEQID NO :1和SEQ ID NO :2所示；所述的用于犬細小病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4所示；所述的用于I型和II型犬腺病毒檢測的引物序列為SEQ ID NO :5和 SEQ ID NO 6 所示。
2.一種檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的方法，其特征在于包括以下步驟 配制 25 ii LPCR 反應體系IOX Ex Buffer 2. 5 u L, dNTPs 2 u L, Ex Taq DNA 聚合酶0.25 u UCDV-Nl 和 CDV-N2 各 0. 35 y L,CPV-NSI 和 CPV-NS2 各 0. 35 y L、CAV_E31 和 CAV-E32各 0. 65 ii L、CDV 模板 0. 75 u L、CPV 模板 0. 75 u L、CAV_I 模板 0. 75 u L,CAV-II 模板 I. 5 y L、滅菌 ddH20 13. 5 u L ； 其中，引物⑶V-Nl和⑶V-N2用于犬瘟熱病毒的檢測，其序列分別為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2所示；引物CPV-NS I和CPV-NS2用于犬細小病毒的檢測，其序列分別為SEQID NO :3和SEQ ID NO :4所示；引物CAV-E31和CAV-E32用于I型和II型犬腺病毒的檢測，其序列分別為SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所示； PCR反應程序94°C預變性5min ;94°C變性30S，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個循環；72°C延伸IOmin ； 觀察取L PCR產物，經I %瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統觀察結果。
3.一種用于檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的試劑盒，其特征在于包含權利要求I所述的引物。
4.權利要求I所述的引物在制備檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒單一感染或混合感染試劑中的應用。
5.權利要求2所述的試劑盒在制備檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒單一感染或混合感染試劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一套用于檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒的多重PCR檢測引物，所述引物包括三對引物，其中，用于犬瘟熱病毒檢測的引物序列為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示；用于犬細小病毒檢測的引物序列分別為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示；用于I型和II型犬腺病毒檢測的引物序列為SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示。采用本發明引物通過多重PCR的方法可以同時檢測犬瘟熱病毒、犬細小病毒、I型和II型犬腺病毒，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102618666SQ20121006346
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月12日 優先權日2012年3月12日
發明者劉大飛, 姜騫, 張洪英, 曲連東, 林歡 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所