專利名稱：肝癌前期JAGGED1的mRNA水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與癌前變的mRNA表達改變(病理演變過程)的相關檢測技術。
背景技術：
根據國內外權威機構提供的資料，我國每年癌癥的新增人數260萬，死亡人數近 210萬，患者700多萬，全球每年新增癌癥患者800萬，死亡人數接近800萬，患者約有8400 多萬人，到2020年以上人數將翻一番，這是一組可怕的數字。癌癥診治成本越來越高，按癌癥患者的年治療費用20萬(貧窮地區可能偏高，發達地區可能遠遠高出20萬)，700多萬患者，每年的花費是I. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有I萬億人民幣白白消耗了。而且，癌癥患者大部分會在治療后不久死亡。因此，現有的臨床癌癥診治模式一定要改變，本發明的創新點是提前做到預防性篩查，然后及時介入預防性調控和預防性治療，做到基因水平癌癥的治未病。2005年美國衛生研究院、癌癥研究院、疾控中心等八家單位做了一個年度報告，對 1972年發起的抗癌大戰進行回顧，報告認為人類在抗癌大戰中是失敗，結論是癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰失敗的幾個因素是1.腫瘤細胞異質性(多態性);2.腫瘤細胞耐藥性；3.抗癌藥物設計思路不完善(動物模型設計不科學)等。同時，該報告中亦提出應重新審視現有診治癌癥的措施。本發明人在長期研究中發現，導致癌癥死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現有的臨床醫學影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖類激素、細胞膜因子、細胞核因子、細胞流式技術)指標來診斷癌癥，都是腫瘤形成后診斷，前者要有組織學變化或已有占位性病變，后者大部分是腫瘤形成后所分泌、釋放、或腫瘤的標記物。傳統臨床觀念認為占位性癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷，這一概念值得認真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學性是不夠嚴謹的，從細胞學角度來分析，I公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數遠不止 2億個腫瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當長，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實的是在這個病理演變過程中，腫塊是癌癥唯一的發生地和單獨的病灶，可能癌細胞早已遷移到其它組織或器官生長。臨床研究早已證實，一旦形成腫塊的同時，其它癌細胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長，一旦切除原發灶后，其它器官復發灶或多發癌塊灶先后形成。因此，在臨床上以 2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹(有些病例，在發現原發病灶時，同時發現轉移病灶，不在我們表述的內容中)，其實這時已經是晚期診斷和晚期治療，這是導致癌癥死亡率不降的真正原因。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌癥基因組學等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌癥、治療癌癥、以及預防癌癥，已取得長足進步。至今，我們已有可能在基因的一級轉錄功能產物(mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預測和篩查。本發明采用核酸原位雜交技術，選擇多組臨床標本(肝癌病人、高危人群、正常對照)，對JAGGED1基因與肝癌的早期預警進行檢測分析。發性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是常見的惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤死亡率中居第三位，每年引起數十萬人死亡。我國是肝細胞癌高發區，發病率已上升到惡性腫瘤的第二位,年死亡率位于惡性腫瘤死亡率的第2 3位，近年來其發病率有增高的趨勢。肝細胞癌現已成為嚴重危害人民生命安全的惡性腫瘤之一。目前肝癌的治療主要有手術切除、化療、放療等。由于病人就診時已多屬晚期，上述治療方法雖已取得很大的進展， 但晚期肝癌病人的預后仍然極差。因此，闡明腫瘤的發生機制對于從源頭上防止腫瘤的發生，進而最終戰勝腫瘤是非常重要的，為此，全球的科學家正在進行不懈的努力。Jaggedl 基因發現于1919年，編碼一個由2753個氨基酸組成的跨膜受體。近年來，從哺乳類動物中克隆了一系列Jaggedl受體的同源分子包括Jaggedll 4和5種配體,分別是DLL1、DLL3、 DLL4、Jaggedl和Jagged2。當Jaggedl受體與配體結合后，受體釋放其胞內域NICD( Jaggedl Intracellular Domain), NIO)轉運到核內后,誘導祀基因的轉錄。Jaggedl信號通路不但與細胞的增殖、分化密切相關，與腫瘤的發生發展都有密切的聯系。1991年，Jaggedl在人類T淋巴母細胞白血病中被鑒定出來，提示其與腫瘤相關，隨后的研究發現，染色體易位t (7 ；9) (q34 ；q34. 3)導致位于9號染色體上的Jaggedll基因斷裂,Jaggedl胞外區丟失,其胞內區獲得組成性活性而具有致痛作用。但是，Jaggedl在腫瘤發生發展的過程中，究竟是扮演癌基因還是抑癌基因角色。它在腫瘤發生的那個(些)環節起作用。目前均仍無定論。 β —catenin在Wnt通路起核心分子作用，對腫瘤形成、分化、浸潤及轉移起重要作用。目 ill認為，Jaggedl和Wnt/[目號通路是相互聯系并協調平衡的，它們之間存在著串話(cross— talking)。因此,研究人員通過組織芯片技術,對大樣本的肝癌標本進行Jaggedl, Jaggedl 和β—catenin的檢測,觀察并分析它們的表達差異,探討Jaggedl信號通路在肝癌中的作用，探討肝癌的發生機制。研究采用免疫組化方法檢測Jaggedl/Notchl和β—catenin 的表達情況，初步探討Jaggedl/Notchl在肝細胞癌中的作用。同時對其陽性表達與肝細胞癌的臨床病理特征進行分析，以期發現更多的信息。收集新鮮肝細胞癌及癌旁組織手術標本和培養肝細胞癌株H印G2和肝正常細胞株L02，運用免疫組化和RT — PCR的方法，進一步檢Jaggedl/Notchl和β—catenin mRNA的表達，同時通過研究β—catenin表達與 Jaggedl/Notchl表達的相關性,初步探討肝細胞癌中Jaggedl信號通路和Wnt信號通路之間的聯系，旨在為進一步闡明肝癌的發生機制提供相關的理論依據。共收集711例手術切除病例的石蠟包埋標本，其中包括339例肝細胞癌、22例肝膽管細胞癌、82例轉移性癌、174 例癌旁肝組織、94例正常肝組織。運用組織芯片技術將上述標本制作成13個組織芯片蠟塊，通過免疫組織化學技術檢測Jaggedl/Notchl和β —catenin抗體在各種病例的表達情況，分析抗體的陽性表達與肝細胞癌的臨床病理特征之間的聯系。同時提取37例新鮮肝細胞癌、37例癌旁肝組織和肝細胞癌株H印G2、肝正常細胞株L02的RNA進行RT—PCR，進一步檢測 Jaggedl/Notchl 和 β 一catenin mRNA 的表達。研究結果表明(I) Jaggedl/Notchl 在肝細胞癌中低表達，在非腫瘤組織中高表達。Jaggedl/Notchl表達水平顯著性正相關。 提示Jaggedl/Notchl在肝細胞癌中可能相互作用，起著抑癌作用。(2) Jaggedl在肝細胞癌中的表達與年齡、血清AFP濃度、腫瘤細胞分化程度顯著相關Jaggedl的表達與腫瘤細胞分化程度顯著相關。肝細胞癌中Jaggedl/Notchl在分化好的細胞高表達，分化差的細胞低表達；提示Jaggedl/Notchl信號通路可能對腫瘤細胞的分化起著重要的調控作用。(3) Jaggedl/Notchl的表達與門靜脈癌栓形成顯著相關,提示JaggedlΙ/Jaggedl與肝癌肝內播散有關。(4) β 一catenin的胞質/核表達在肝細胞癌中高表達,在非腫瘤組織中低表達；β —catenin的胞質/核表達在分化好的細胞表達低，分化差的細胞表達高。提示β — catenin在肝細胞癌的發生發展過程中起著促癌的作用。(5)Jaggedll與β—catenin的表達水平存在顯著性負相關，提示它們在肝細胞癌中相互拮抗，互為對方的調控者。(6)半定量RT—PCR結果顯示肝細胞癌中Jaggedl/Notchl表達低，β —catenin表達高,與它們的蛋白表達情況同步，提示Jaggedl/Notchl在肝細胞癌中的表達下降,可能不是發生轉錄水平，而是由其它原因引起。將JAGGED1的mRNA作為早期篩查肝癌變前期有非常重要的臨床診斷意義。 JAGGED1的mRNA在肝癌變前期及癌變過程中低表達。他作于肝癌癌變前期篩查、及肝癌術的復發、轉移預警也有非常重要的臨床意義。發明人在長期的研究中，得出了一種新理念，癌癥和其它臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現在治已病(發病后診治)，要做到預防性診治，做到治已病,只有這樣才能降低重大疾病的發病率和死亡率，降低社會成本和醫療成本。因此,發明人在開發和生產重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了創新。特別是篩選臨床標本(正常人群、癌癥高危人群、腫瘤患者)，突破了正常組織與腫瘤組織比較的一貫性研發思路，來尋找和開發癌前變的mRNA水平，與癌癥早期基因病理生理學演變密切相關，而且臨床意義非常重要靶標，將臨床上腫瘤形成后診治模式變成腫瘤的預防性診治，爭取了腫瘤診治的時間和空間，達到預防癌癥。目前對JAGGED1基因的研究都采用高通量基因芯片技術，而這些方法多用于科研方面，不適應臨床應用，而檢測mRNA比基因分析更科學(DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是功能性東西)，比蛋白分析更可靠(mRNA與蛋白轉錄有時候不同步)。根據現有的文獻資料Jaggedl基因mRNA水平的檢測技術及試劑盒未見報道。本發明人在針對創新性發明的要求，設計了(肝癌患者、高危人群、正常對照人)不同數據例組，用原位雜交技術進行檢測，結果表明以上肝癌病人JAGGED1基因低表達，高危人群有不同程度低表達15-25%，正常人都是高表達。表明JAGGED1基因肝癌癌變前期篩查的重要標志物。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位素標記物有3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優點，但是由于放射性同位素對人和環境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。根據所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA, RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、沖洗和顯示。本發明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(mRNA)和檢測的靶mRNA是采用堿基互補(雜交互補)的原理，同時經過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結果沒有影響(因為，發明人采用的mRNA序列都超過600bp以上)。鑒于目前臨床上癌癥的診斷(影像醫學和生化指標物都是腫瘤形成后的診斷)是晚期診斷，治療也是晚期治療，導致死亡率不降的醫治模式。本發明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預防性治未病，達到預防性診治，將目前影像醫學手段和眾多生化標記物無法檢測到癌前變mRNA水平量化改變技術，做了創新性的技術突破，提供癌前變mRNA水平篩查技術。使臨床上有了一項新的癌前變mRNA水平真正早期篩查的技術，為臨床癌癥的診治爭取時間和空間。

發明內容
本發明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標記物。其次，本發明還要提供上述試劑盒用于與肝癌癌變前期篩查及術復發、轉移早期預警相關的原位雜交檢測方法。為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下
本發明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所述的雜交探針如SEQ ID NO. I所示序列，是JAGGED1基因序列中間一段堿基序列，從1500到 2300bp, JAGGED I基因序列號NM_000214，如SEQ ID NO. 2所示序列，JAGGED1基因的核苷酸序列長度是5988bp，CDS是517. .4173bp，位于染色體20pl2. l-pll.23”上。(在探針標記過程中如果基因序列太長，超過IOOObp以上，我們會用CDS的序列來設計探針，如果CDS 的序列也超過IOOObp以上，會采用基因的中間一段堿基序列來合成探針，堿基序列不少于 500bp，探針合成后要做序列檢測，并對功能進行臨床意義的分析)。本發明試劑盒的一個優選方案是，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括雜交液。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括增強劑。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括顯色劑。本發明的癌變前期JAGGED1基因篩查試劑盒應用價值在于，能在mRNA水平，對肝癌變前期篩查，及癌變后或術后復發、轉移、擴散發生預警，進一步配合臨床治療。本發明還提供一種JAGGED1基因原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(I)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物中待測 RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的可形成穩定雜交復合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的底物選用人的血液白細胞標本或其它器官組織細胞標本。更優選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自肝癌患者、肝癌高危人群、健康人。本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的癌癥高危人群、癌癥好發家族、肝癌患者、及亞健康人群。本發明的檢測試劑盒是采用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合，以JAGGED1基因的一級轉錄功能產物mRNA為檢測對象，合成探針是JAGGED1基因的RNA序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA的表達量。原位雜交技術的顯示方法能提供 JAGGEDI基因的半定量或定量表達程度判定。根據雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達量，正常人JAGGED1基因高表達，即大量顯色，JAGGEDI基因在癌癥病人和正常人有顯著差異，該基因的表達量比正常人表達量都低。本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標本放入反應槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗,顯色；
10).取出封片鏡檢。本發明的一個優選實施例的方案是以JAGGED1基因為目的基因合成的核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的基因的表達量。本發明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的 JAGGEDI基因表達量，用來確定癌變前期的mRNA變化量，預警肝癌變是否發生及肝癌患者術后是否復發、轉移的預測。因為JAGGED1基因在正常人中高表達，如果JAGGED1基因表達量低，說明有患癌的風險，說明癌變已發生，或癌癥病人術后已經復發、轉移，從而獲得癌癥的診斷信息。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。如上所述，當檢測到JAGGED1基因的表達量低于正常對照時，則可預測受試者為肝癌變病理過程已發生。
本發明具有如下有益效果
本發明的臨床意義是更早期跟蹤檢測肝癌變發生和病理演變過程中JAGGED1基因 mRNA表達量的變化，預警肝癌發生、發展趨勢。本發明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測與癌癥標志物，以及影像醫學檢查有顯著不同。本發明可以在基因轉錄的一級功能產物mRNA水平檢測JAGGED1基因異常表達，在影像醫學檢查未發現占位性癌病灶復發之前，癌癥生化指標未產生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上基因表達異常的信息采集，給臨床癌癥病患一個真正的早期診斷以及治療后轉移復發及早預測。這樣才有可能實施癌癥的早期篩查、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治肝癌惡疾。此外，本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。


圖I是本發明JAGGED1基因原位雜交技術流程圖。圖2是本發明實施例中肝癌病人JAGGED1表達降低圖片。圖3是高位人群(肝硬化)圖片。圖4是本發明實施例中正常人JAGGEDI表達圖片。
具體實施例方式下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應該理解，下面的實施例用于說明而非限定本發明內容，任何形式上的改變或變通將落入本發明的保護范圍。實施例I
按照常規方法制備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以JAGGED1基因為檢測目的基因設計的雜交探針、標記物、說明書，其中
本實施例的探針標記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成
消化液100 μ L/管I管/盒無色透明液體保護液100 μ L/管I管/盒無色透明液體預雜交液1300 μ L/ 管2管/盒無色透明液體正義雜交液10 μ L/ 管I管/盒無色透明液體反義雜交液10 μ L/ 管I管/盒無色透明液體封閉液1000 μ L/ 管I管/盒無色透明液體堿性磷酸酶抗體I U L/ 管I管/盒無色透明液體顯色劑A175 μ L/ 管I管/盒黃色液體顯色劑B320 μ L/ 管I管/盒無色透明液體緩沖液I90mL/ 瓶I瓶/盒淺黃色或無色透明液體緩沖液II80mL/ 瓶I瓶/盒淺黃色或無色透明液體緩沖液III2OmL/ 瓶3瓶/盒淺黃色或無色透明液體緩沖液IV90mL/ 瓶I瓶/盒淺黃色或無色透明液體固定液90mL/ 瓶I瓶/盒無色透明液體陽性對照標本6片/盒
配制試劑使用濃度
1).將IOX緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成IX緩沖液I;
2).將20X緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2X緩沖液II；
按1:100稀釋成O. 2 X緩沖液II ;按1:200稀釋成O. IX緩沖液IICN 102605049 A
3).將IOX緩沖液III用三蒸水按1:10稀釋成IX緩沖液III；
4).IOX緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10mL，加水至IOOmL既可)ο實施例2
應用核酸原位雜交檢測方法對各組血液標本JAGGEDI基因表達量的實施過程
1).取待測標本兩張；
2).在玻璃缸里加入消化液(消化液ΙΟΟμL加IX緩沖液I 99. 9ml,即為使用濃度)50 ml，37°C水浴預熱lOmin，放進16張玻片，37°C處理12 min，再用IX緩沖液I洗5min ；
3)·用O. 2%的保護液(保護液Iml加I X緩沖液I，99ml即為使用濃度)洗lOmin，三蒸水洗5min (以上過程都在玻璃缸進行)，取出玻片，讓其自然干燥；
4).將玻片放入保濕盒內，加預雜交液25μ L/片(加在有細胞的地方)，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中3h以上；
5).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內，用70%、90%、95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；
6).將玻片放入保濕盒內，一張加正義雜交液25μ L/片，另一張加反義雜交液25 μ L/ 片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；
7).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內
在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min ；
在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min ；
在42°C恒溫水浴箱中用0. IX緩沖液II洗兩次，每次15min ；
8).用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；
9).將玻片放入保濕盒內，加O.5%封閉液(Iml封閉液加5ml IX緩沖液III) 100 μ L/ 片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。(此步驟不需加蓋玻片)；
10).取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；
11).將玻片放入保濕盒內，加X-AP抗體(取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入I.8ml IX緩沖液III) 100 μ L/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min，時間不能過長，否則會產生假陽性(此步驟不需加蓋玻片)；
12).取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;
13).用IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73.3 μ L，顯色劑B157. 5 μ L加到 30mL I X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光16h到18h以上；
14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。本發明的核酸原位雜交檢測方法將目的基因用地高辛標記，成為RNA核酸探針， 將探針與人體白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的基因的表達量。肝癌病人20名，高危和家屬史20名，正常對照組20名。抽所有待檢人的外周血 3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結果表示，所有癌癥患者JAGGED1基因表達降低，細胞染色淺或無染色；肝硬化人群表達降低，小數染色；正常對照組JAGGED1基因表達高，細胞多數染色具體結果見圖2、圖3、圖4。
權利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. I所不的序列。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種JAGGED1基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)在權利要求I所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。
7.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的可形成穩定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ;核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細胞標本。
9.如權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述的血液白細胞標本選自癌癥、乙肝肝硬化的高危人群、正常人標本。
10.JAGGEDI基因在制備檢測肝癌原位雜交試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與肝癌早期病理演變有密切相關的信號通道(Jagged1)基因的mRNA方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。本發明的試劑盒和檢測方法可在mRNA水平上檢測JAGGED1基因的表達量，比影像醫學和現有的臨床生化檢測指標更早期，能實現真正的癌變前期mRNA水平篩查，同時，本發明的檢測方法簡單方便，成本低,便于縣區級醫院推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102605049SQ20111044284
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者張云福, 張玉麗, 裘建英, 裘霖 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司