專利名稱：干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及荒漠鹽堿地的生物改良處理，具體涉及ー種干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑及其制備方法與應用。
背景技術：
土地鹽堿化問題與人類活動，特別是農業灌溉密切相關。當今世界人ロ膨脹、土地退化、可利用淡水資源匱乏，這些問題促使人們將注意力轉向大片分布的鹽堿荒地的開發利用。這樣不僅可以擴大可耕地面積，增加單位產量，緩解糧食危機，還可改善生態環境。嗜鹽堿細菌長期在鹽堿生境下生存和進化，形成了一些極為特殊的結構和生理機制，并可產生ー些獨特的代謝產物。其產生的相關酶類和特殊的生物活性物質，在エ業上有重要利用價值，為人類做出了巨大的貢獻。嗜鹽堿菌的研究起步較晩，上世紀70年代后期，人們從非洲堿湖中分離出極端嗜鹽嗜堿菌，其研究才真正開展起來，目前研究正日益深入。我國西北干旱綠洲地區，鹽堿地、鹽堿灘占全部土地面積的40%，該地區地下水位高，土壤鹽堿較重且鹽堿地分布廣泛，是我國西北干旱地區生物多祥性保護的關鍵區域，同時具有豐富的嗜鹽堿細菌資源。在鹽堿地改良方面，利用微生物提高土壌肥力，改善植物根際環境，提高植物的耐鹽堿性越來越受到重視。本發明是基于干旱荒漠重鹽堿地具有的土著嗜鹽堿細菌資源為基礎，經過大量的試驗篩選，研發出了干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑。

發明內容
本發明的目的是提供ー種利用微生物提高土壌肥力，改善植物根際環境，提高植物的耐鹽性的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑及其制備方法與應用。本發明的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑，是由17種微生物菌株組成；所述17種微生物菌株(個/毫升)分別為:1. IXlO8-L 7X IO8產堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes) CGMCC 1. 1827、7·2Χ107-8·5Χ107 乙酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus) CGMCC 1. 2004、2. IX 108-2. 7X IO8 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)CGMCC 1.459、 4. 7X 107-6. 2X 107 短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC 1. 1625、7. 4X 107_8. 7X IO7 地衣芽孢桿菌(Bacillus 1 ichen if ormis) CGMCC 1· 91、3· 3X 108_4· 2X IO8 嗜鹽鹽單胞菌(Halomonas halophila) CGMCC 1. 2316、8. 1 X IO7-L 5 X IO8 棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii)CGMCC 1. 1007、1. 2X IO8-L 9X IO8 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) CGMCC 1· 1414、5· 3 X 106_6· 1 X IO6 稻黃桿菌(Flavobacterium oryzae) CGMCC 1. 1585、7· 4Χ106-8· 6X106 近平滑假絲酵母(Candida parapsi Ios is) CGMCC 2. 1768、4. 7X 107-6. 4X 107 彎曲高溫單孢菌(Thermomonospora curvata)ACCC 41067、 8. 2X IO7-L 4X IO8 木霉菌(Trichoderma sp. )ACCC 31526、3· 5X 107_6· 8X IO7 土壤芽孢桿菌(Bacillus edaphicus)ACCC 03232、3. 4X 108_6. 1 X IO8 褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC 01077、2· 2X 108_3· 9X IO8 排硫桿菌(Thiobacillus thioparus)ACCC 1(^88、9·7Χ107-2·5Χ108 膠凍樣芽胞桿菌(Bacillus mucilaginosus)ACCC 10095 和7·8Χ10 -9·3Χ107 熒光假單胞桿菌(Pseudomonas f luorescens) ACCC 10040。本發明所述的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑的制備方法，包括將產堿假單胞胃(Pseudomonas alcaligenes)CGMCC 1.1827、乙 丐ホ云カホ干胃(Acinetobacter calcoaceticus) CGMCC 1. 2004、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) CGMCC1. 459、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC 1. 1625、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) CGMCC 1.91、嗜鹽鹽單胞菌(Halomonas halophila)CGMCC1. 2316、棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii) CGMCC 1. 1007、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) CGMCC 1.1414、稻黃桿菌(Flavobacterium oryzae)CGMCC 1· 1585、近平滑假絲酵母(Candida parapsiIosis)CGMCC 2. 1768>^ffi, ^(Thermomonospora curvata)ACCC 41067、 8· 2Χ107-1· 4X108 木霉菌(Trichoderma sp. )ACCC 31526、土壤芽孢桿菌(Bacillus edaphicus)ACCC03232、褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC 01077 排硫桿菌 (Thiobacillus thioparus)ACCC 1(^88、膠凍樣芽胞桿菌(Bacillus mucilaginosus)ACCC 10095和熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens) ACCC 10040在無菌條件下分別接種于各自的基礎培養基中，接種量為2 % -5 %，振蕩培養，100-120r/min,溫度觀_32°C， 18-24h培養后，分別獲得17種菌株的菌液，所述17種菌液等比例混合，經觀_32で、18_24h 的通氣攪拌發酵培養，形成了干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑；所述發酵培養的培養基包含 (NH4)2S04l-2g, H3PO4O. 5-lml 質量百分量為 2% 的淀粉水 1L，pH 至 7. 5-9. O。其中，所述各自的基礎培養基分別為(1)產堿假單胞菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、彎曲高溫單孢菌、土壌芽孢桿菌、排硫桿菌、熒光假單胞桿菌的基礎培養基包含蛋白胨10g，牛肉提取物 3g，NaCl 5g，瓊脂 15g，蒸餾水 1L，pH 7. O ；(2)乙酸鈣不動桿菌的基礎培養基包含酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，瓊脂 15g，蒸餾水 lL，pH 7.0 ；(3)棕色固氮菌、褐球固氮菌的基礎培養基包含KH2PO4 0. 2g, K2HPO4 0. 8g, MgSO4 ·7Η20 0. 2g, CaSO4 ·2Η20 0. lg，FeCl3 0. 005g, Na2MoO4 ·2Η20 0. 02g，酵母提取物 0. 5g, 甘露醇20g,瓊脂15g，蒸餾水1L，pH 7. 2 ；(4)枯草芽孢桿菌的基礎培養基包含牛肉提取物5g，蛋白胨10g，酵母提取物5g， 葡萄糖5g, NaCl 5g，瓊脂15g，蒸餾水1L，pH 7. O ；(5)稻黃桿菌的基礎培養基包含蔗糖 15g，K2HPO4 0. 8g，KH2PO4 0. 2g，MgSO4 · 7H20 0. 2g, NaCl 0. 2g, CaCl2 0. 05g, MnSO4 0. 0005g, FeSO4 0. 025g,鎢酸鈉 0. 0005g,鉬酸鈉 0. 0005g，瓊脂15g，蒸餾水IL ；(6)近平滑假絲酵母的基礎培養基包含麥芽汁1L，瓊脂15g ；(7)木霉菌的基礎培養基包含馬鈴薯提取液1L，葡萄糖20g，瓊脂15g ；(8)膠凍樣芽胞桿菌的基礎培養基包含蔗糖5g，豆粕粉0.5g，Na2HPO4 2g， MgSO4 · 7H20 0. lg, FeCl3 0. 005g, K2HPO4 0. 05g, CaCO3 0. lg,瓊脂 15g,蒸餾水 1L, pH 7. 5 ；(9)嗜鹽鹽單胞菌的基礎培養基包含NaCl 80g，酵母提取物lg，蛋白胨5g，牛肉膏 lg, FePO4 0. Olg,瓊脂 16g，蒸餾水 1L，pH 7. 4-7. 6。本發明干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑中的菌種能更好的適應鹽堿土壌；本發明的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑是一種多菌群復合菌劑，經大量試驗優選的17種菌種不僅沒有菌種間的拮抗效應，而且互相協同，菌種穩定；本發明的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑能很好地適應來源不同、批次不同的發酵原料，且質量穩定，適合于商品化生產；本發明的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑產酸，可以降低根際土壤的堿度，從而減少土壤堿度對植物的抑制作用，促進植物良好生長；本發明的菌劑在土壌內的生命活動過程中產生生物激素刺激作物生長，產生大量的赤霉素和細胞激素類等物質，這些物質在與植物根系接觸后，能調節作物的新陳代謝，刺激植物的生長；本發明的有益活菌在土壌中大量繁殖，溶解土壌中被固定的元素，達到解鉀、釋磷、固氮的目的，使土壌得到迅速改良。
具體實施例方式一、干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑的制備產堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)CGMCC 1. 1827、乙酸鈣不動桿菌 (Acinetobacter calcoaceticus)CGMCC 1. 2004、巨大牙;r包桿囷(Bacillus megaterium) CGMCC 1.459、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC 1. 1625、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) CGMCC 1.91、嗜鹽鹽單胞菌(Halomonas halophila) CGMCC 1. 2316、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii) CGMCC1. 1007、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) CGMCC 1.1414、稻黃桿菌(Flavobacterium oryzae)CGMCC 1· 1585、近平滑假絲酵母(Candida parapsiIosis)CGMCC 2· 1768、彎曲高溫單孢菌(Thermomonospora curvata)ACCC 41067、 8· 2Χ107-1· 4X108 木霉菌(Trichoderma sp. )ACCC 31526、土壤芽孢桿菌(Bacillus edaphicus)ACCC 03232、褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC 01077、排硫桿菌 (Thiobacillus thioparus)ACCC 1(^88、膠凍樣芽胞桿菌(Bacillus mucilaginosus)ACCC 10095和熒光假單胞桿菌(Pseudomonas，fluorescens) ACCC 10040在無菌條件下分別接種于各自的培養基上，接種量為2% _5%，上搖床振蕩培養，經振幅100-120r/min、溫度 28-320C、18-24h培養后，利用血小板計數器在顯微鏡下計數，數量達到IO7個/毫升即可。上述培養基為(1)產堿假單胞菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、彎曲高溫單孢菌、土壌芽孢桿菌、排硫桿菌、熒光假單胞桿菌采用蛋白胨10g，牛肉提取物3g，NaCl 5g，瓊脂 15g，蒸餾水 lL，pH 7.0 ；(2)乙酸鈣不動桿菌采用酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl IOg,瓊脂15g，蒸餾水 1L, pH 7. O ；(3)棕色固氮菌、褐球固氮菌采用 KH2PO4 0. 2g，K2HPO4 0. 8g，MgSO4 · 7H20 0. 2g， CaSO4 · 2H2O 0. lg，FeCl3 0. 005g, Na2MoO4 · 2H20 0. 02g,酵母提取物 0. 5g,甘露醇 20g,瓊脂 15g，蒸餾水 lL，pH 7. 2 ；(4)枯草芽孢桿菌采用牛肉提取物5g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，瓊脂 15g，蒸餾水 1L，pH 7. O ；(5)稻黃桿菌采用蔗糖 15g，K2HPO4 0. 8g，KH2PO4 0. 2g，MgSO4 · 7Η200· 2g，NaCl 0. 2g, CaCl2 0. 05g, MnSO4 0. 0005g, FeSO4 0. 025g，鎢酸鈉 0. 0005g，鉬酸鈉 0. 0005g，瓊脂 15g，蒸餾水IL ；(6)近平滑假絲酵母采用麥芽汁1L，瓊脂15g ；(7)木霉菌采用馬鈴薯提取液1L，葡萄糖20g，瓊脂15g ；
(8)膠凍樣芽胞桿菌的基礎培養基包含蔗糖5g，豆粕粉0.5g，Na2HPO4 2g， MgSO4 · 7H20 0. lg, FeCl3 0. 005g, K2HPO4 0. 05g, CaCO3 0. lg,瓊脂 15g,蒸餾水 1L, pH 7. 5 ；(9)嗜鹽鹽單胞菌的基礎培養基包含NaCl 80g，酵母提取物lg，蛋白胨5g，牛肉膏 lg, FePO4 0. Olg,瓊脂 16g，蒸餾水 1L，pH 7. 4-7. 6。分別將這17種菌液按等比例混合，并置于同一個發酵罐，經觀_32で、18-24h的通氣攪拌發酵培養，形成了干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑。 發酵培養基的制備(NH4)2S04lg,H3PO4O. 5ml加入IL含量為2%的淀粉水中，用1 % 的石灰水調節PH至7. 5，以瓶子容量的1/4裝入500ml錐形瓶中，密封后在121°C高壓滅菌 15min，冷卻備用；或(NH4)2S042g，H3PO4Iml加入IL質量百分含量為2%的淀粉水中，用的石灰水調節PH至9. 0，以瓶子容量的1/4裝入500ml錐形瓶中，密封后在121°C高壓滅菌15min，冷
卻備用。ニ、干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑質量穩定性測試取不同生產批次的微生物菌劑，對其中各菌種進行培養鑒定，結果見表1，表明微生物菌劑中每種菌種均有存活，沒有不同菌種間的拮抗效應，而且批次間各菌種數量基本 fe、/b。
權利要求
1.ー種干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑，按每毫升所述菌劑計，由如下17種微生物菌株組成1. IXlO8-L 7 X IO8 個產堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes) CGMCC 1. 1827、7. 2X107-8. 5X107 個乙酸·丐不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus) CGMCC 1. 2004、2· 1Χ108-2· 7X108 個巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) CGMCC 1· 459、4· 7Χ107-6· 2X107 個短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC 1.1625、 7· 4Χ107-8· 7X107 個地衣芽孢桿菌(Bacillus 1 ichen if ormis) CGMCC 1. 91, 3· 3Χ108-4· 2X108 個嗜鹽鹽單胞菌(Halomonas halophila)CGMCC1. 2316、 8. IXlO7-L 5 X IO8 個棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii) CGMCC 1.1007、 1. 2 X IO8-L 9 X IO8 個枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) CGMCC 1.1414、 5· 3X 106-6· IX IO6 個稻黃桿菌(Flavobacterium oryzae) CGMCC 1.1585、 7· 4Χ106-8· 6X106 個近平滑假絲酵母(Candida parapsi Ios is) CGMCC 2.1768、 4. 7X 107-6. 4X 107 個彎曲高溫單孢菌(Thermomonospora curvata)ACCC 41067、 8· 2Χ107-1· 4X108 個木霉菌(Trichoderma sp.)ACCC 31526、3· 5X 107_6· 8X IO7 個土壤芽孢桿菌(Bacillus edaphicus) ACCC 03232、3. 4X 108_6. 1 X IO8 個褐球固氮菌 (Azotobacter chroococcum) ACCC 01077、2· 2 X 108_3· 9X IO8 個排硫桿菌(Thiobacillus thioparus)ACCC 10 2 88 , 9 . 7X 107_2· 5X IO8個膠凍樣芽胞桿菌(Bacillus mucilaginosus) ACCC 10095 和 7· 8X 107-9· 3X IO7 個熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens) ACCC 10040。
2.權利要求1所述的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑在鹽堿地改良方面的應用。
3.權利要求1所述的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑在提高土壌肥力方面的應用。
4.權利要求1所述的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑在改善植物根際環境方面的應用。
5.權利要求1所述的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑在促進植物生長方面的應用。
6.權利要求1所述的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑的制備方法，包括將產堿假單胞菌(Pseudomonas alcaligenes)CGMCC 1. 1827、乙酸 丐不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus) CGMCC 1. 2004、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) CGMCC 1. 459、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC 1. 1625、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) CGMCC 1.91、嗜鹽鹽單胞菌(Halomonas halophila)CGMCC 1.2316、棕色固氮菌 (Azotobacter vinelandii) CGMCC 1· 1007、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) CGMCC 1.1414、稻黃桿菌(Flavobacterium oryzae)CGMCC 1· 1585、近平滑假絲酵母(Candida parapsiIosis)CGMCC 2. 1768>^ffi, ^(Thermomonospora curvata)ACCC 41067、 8· 2Χ107-1· 4X108 木霉菌(Trichoderma sp. )ACCC 31526、土壤芽孢桿菌(Bacillus edaphicus)ACCC 03232、褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC 01077、排硫桿菌 (Thiobacillus thioparus)ACCC 1(^88、膠凍樣芽胞桿菌(Bacillus mucilaginosus)ACCC 10095和熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens) ACCC 10040在無菌條件下分別接種于各自的基礎培養基中，接種量為2% -5%，振蕩培養，100-120r/min，溫度觀-32で， 18-24h培養后，分別獲得17種菌株的菌液，所述17種菌液等比例混合，經觀_32で、18_24h 的通氣攪拌發酵培養，形成了干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑；所述發酵培養的培養基包含 (NH4)2SO4 l-2g，H3PO4 0. 5_lml、質量百分含量為 2%的淀粉水 1L，pH 至 7. 5-9. O。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在干所述各自的基礎培養基分別為(1)產堿假單胞菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、彎曲高溫單孢菌、 土壌芽孢桿菌、排硫桿菌、熒光假單胞桿菌的基礎培養基包含蛋白胨10g，牛肉提取物3g， NaCl 5g，瓊脂 15g，蒸餾水 1L，pH 7. 0 ；(2)乙酸鈣不動桿菌的基礎培養基包含酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl10g，瓊脂 15g，蒸餾水 lL，pH 7. 0 ；(3)棕色固氮菌、褐球固氮菌的基礎培養基包含KH2PO40. 2g, K2HPO4 0. 8g，MgSO4 · 7H20 0. 2g, CaSO4 ·2Η20 0. lg，FeCl3 0. 005g, Na2MoO4 ·2Η20 0. 02g，酵母提取物 0. 5g，甘露醇 20g, 瓊脂15g，蒸餾水lL，pH 7. 2 ；(4)枯草芽孢桿菌的基礎培養基包含牛肉提取物5g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖 5g, NaCl 5g，瓊脂 15g,蒸餾水 1L，pH 7. 0 ；(5)稻黃桿菌的基礎培養基包含蔗糖15g，K2HPO4 0. 8g, KH2PO4 0. 2g，MgSO4 ·7Η20 0. 2g, NaCl 0. 2g, CaCl2 0. 05g, MnSO4 0. 0005g, FeSO4 0. 025g，鎢酸鈉 0. 0005g，鉬酸鈉 0. 0005g， 瓊脂15g，蒸餾水1L;(6)近平滑假絲酵母的基礎培養基包含麥芽汁1L，瓊脂15g；(7)木霉菌的基礎培養基包含馬鈴薯提取液1L，葡萄糖20g，瓊脂15g；(8)膠凍樣芽胞桿菌的基礎培養基包含蔗糖5g，豆粕粉0.5g，Na2HPO4 2g，MgSO4 · 7H20 0. lg, FeCl3 0. 005g，K2HPO4 0. 05g，CaCO3 0. lg，瓊脂 15g，蒸餾水 1L，pH 7. 5 ；(9)嗜鹽鹽單胞菌的基礎培養基包含NaCl80g，酵母提取物lg，蛋白胨5g，牛肉膏lg， FePO4 0. Olg,瓊脂 16g，蒸餾水 1L，pH 7. 4-7. 6。
全文摘要
本發明公開了一種干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑及其制備方法與應用，是由17種微生物菌株組成；分別為產堿假單胞菌、乙酸鈣不動桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜鹽鹽單胞菌、棕色固氮菌、枯草芽孢桿菌、稻黃桿菌、近平滑假絲酵母、彎曲高溫單孢菌、木霉菌、土壤芽孢桿菌、褐球固氮菌、排硫桿菌、膠凍樣芽胞桿菌和熒光假單胞桿菌。本發明還公開了該菌劑的制備方法。本發明的干旱荒漠嗜鹽堿微生物菌劑產酸，可以降低根際土壤的堿度，從而減少土壤堿度對植物的抑制作用，促進植物良好生長。
文檔編號C12R1/38GK102559549SQ20111044332
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者劉照輝, 劉金榮, 張小虎, 張旭, 李春杰, 楊有俊, 柴琦, 謝曉蓉, 達軍山, 鄭明珠, 陳瓊 申請人:蘭州大學