專利名稱：抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種抗重組堿性成纖維細胞生長因子(或稱為成纖維細胞生長因子2，FGF-2)人源性scFv抗體及其應用。
背景技術：
堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，又名成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，FGF-2)，是成纖維細胞生長因子 (fibroblast growth factor, FGF)家族目前已知的23個成員中發現最早、研究最多的因子。bFGF有多種生物學作用，包括促生長、分裂、分化功能；對成纖維細胞具有強烈的促增殖作用。bFGF是一個多功能分子，分子表面具有多種結合表位，像受體結合位點，肝素結合位點，整合素結合位點等多個表位。針對不同表位的抗體具有不同的功能。而且，針對同一抗原的單克隆抗體具有非常大的多樣性，可變區序列不同，也代表了單抗的親和力的功能的差異。bFGF是繼VEGF之后的最重要的刺激血管新生的細胞因子之一。與腫瘤的發生、發展關系密切，促進腫瘤的生長，有相當部分的腫瘤會出現bFGF和bFGF受體的高表達。bFGF 能促進腫瘤血管的新生，因而增加腫瘤的血液供應、為腫瘤生長提供氧和營養物質；促進多種生長因子的分泌，如VEGF，TGF，aFGF等，這些因子相互調節，共同促進腫瘤的發生。到目前為止，還沒有見到國內外其他關于抗bFGF人源性單鏈抗體(ScFv)的報道。

發明內容
為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體。該抗體能特異性中和人bFGF(或FGF-幻的生物學活性。本發明的另一目的在于提供所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性 scFv抗體，包括重鏈可變區和輕鏈可變區；所述的重鏈可變區的氨基酸序列如下所示QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYEMNff VRQACDRlP GKGLEffVSY I S S S G S T I Y YCDR2ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARELTGDffGAFDIff GQGTMVTVSS；CDR3
3
所述的輕鏈可變區的氨基酸序列如下所示QSVLTQPASVSGSPGQSITIS C TGTSSDVGGYNYVSff YQQCDRlHPGKAPKLMIY DVSNRPSG VCDR2SNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC SSYTSSSTVVCDR3F GG GTK L T V LG編碼所述的重鏈可變區的基因序列如下所示CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTC ATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACG CCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCTA ACTGGGGATTGGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA ；編碼所述的輕鏈可變區的基因序列如下所示CAGTCTGTGTTGACGCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACT GGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCAT GATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCC TGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTGTGGTA TTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG ；編碼所述的重鏈可變區的基因由360個堿基組成，編碼120個氨基酸，可變區含有 3個⑶R(互補決定簇)區⑶Rl編碼10個氨基酸，⑶R2編碼8個氨基酸，⑶R3編碼13個氨基酸；可變區的框架區與其他人源性抗體的同源性高達94%，而3個CDR區則是特異性序列，與其他人源性抗體Fd鏈有較大差異。編碼所述的輕鏈可變區的基因由333個堿基組成，編碼111個氨基酸，可變區含有 3個⑶R(互補決定簇)區⑶Rl編碼14個氨基酸，⑶R2編碼8個氨基酸，⑶R3編碼10個氨基酸；可變區的框架區與其他人源性抗體的同源性為98%，而3個CDR區則為特異性序列，與其他人源性抗體λ鏈有較大差異。抗重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)或成纖維細胞生長因子2(FGF_2)人源性scFv抗體蛋白的功能存在于抗體輕重鏈可變區抗原互補決定族(complementarity determing regions CDRs) CDR1、CDR2、CDR3 (是本發明的功能活性區)中特異性核苷酸序列決定的，其相應的氨基酸序列構成了抗體特異性bFGF或(FGF-2)抗原結合區。上述的抗重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)或成纖維細胞生長因子2 (FGF-2) 人源性抗體的用途由于抗體的生物活性是由抗體輕鏈和重鏈可變區中的高變區(CDRs) 特異性的基因序列決定的，因此可采用基因工程方法，將編碼所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體的基因構建、表達，得到多種形式的小分子基因工程抗體(如Fab 抗體、F (ab) 2、單鏈抗體(scFv)、納米抗體(Nanobody)、抗體融合蛋白)和IgG全抗體。
在原核細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和真核細胞獲得該抗體基因表達或以此基因為基礎改建后的含有該抗體基因可變區的任何其他基因。獲得具有中和人bFGF的抗體產物， 可在臨床上進行如下應用(1)用于腫瘤的診斷，(2)抑制腫瘤血管新生和抑制腫瘤的生長和轉移，(3)抑制肝、肺、腎纖維化的進程。上述的抗重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)或成纖維細胞生長因子2 (FGF-2) 人源性scFv抗體在制備用于診斷和治療腫瘤以及抑制內臟(如腎、肝或肺等)纖維化的抗體藥物中的應用。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果本發明獲得的抗bFGF或FGF-2 人源性scFv抗體，該抗體是全人源的，是從人噬菌體抗體庫中篩選到的抗體，具有高親和力和特異性，因為是全人源性的抗體，可以直接開發為人用的抗體藥物。篩選到的人源性抗bFGF抗體具有特異性結合bFGF的特點，可有效中和腫瘤和纖維化患者體內過渡表達的 bFGF，能有效抑制腫瘤的生長和轉移，還可用于抑制肝、肺或腎等纖維化的形成。


圖1是不同scFv噬菌體抗體克隆的ELISA結果圖。圖2是scFv抗體克隆表達產物的SDS-PAGE和^festern blot檢測結果圖；泳道1為分子量標準；泳道2 4分別為三個不同克隆44，49，85的表達上清的 SDS-PAGE結果圖；泳道5 7分別為對應的Western-blot結果圖。圖3是純化后的單鏈抗體scFv44對bFGF誘導的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs) 增殖的抑制試驗結果圖。圖4是純化后的單鏈抗體scFv44抑制人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)成管的抑制試驗結果圖。圖5是純化的單鏈抗體scFv44抑制神經膠質瘤細胞細胞增殖作用的結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1抗重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)或成纖維細胞生長因子2 (FGF-2)人源性 scFv抗體的篩選方法(1)噬菌體抗體庫的篩選首先將bFGF(北京啟維益成公司)用0. 05mol/L、pH8. 7的碳酸鹽緩沖液稀釋至 50 100yg/ml，用Iml包被免疫管(Immunotube，NUNC公司)，4°C過夜，次日以質量體積比2. 5%的脫脂奶粉加滿免疫管37°C封閉2h，倒去封閉液，加入Iml噬菌體抗體庫(約 IO13CFU) (Enprobiotech公司)，37°C孵育2h，吸去噬菌體抗體液，以含體積百分比0. 05%吐溫20的PBS (0. 01M、pH7. 2)洗2次(第二輪洗10次，以后洗滌20次以上)，蒸餾水洗滌1 次。然后用2種方法回收結合于固相的噬菌體抗體①先加入Iml新鮮XLl-Blue菌 (北京鼎國昌盛生物技術有限公司)，37°C孵育15min后轉入IOml含20 μ g/ml Amp (氨芐青霉素)、10yg/ml Tet(四環素)的SB培養基(每升培養基含細菌培養用胰化蛋白陳309g， 酵母提取物209g，19gMoPs,pH7. 0)；②再將細菌感染回收后的免疫管用蒸餾水洗滌2次，力口入Iml洗脫液(0. Iml HCl、以甘氨酸調至pH = 2. 2后加入BSA至質量體積比為0. 1 % )， 于37°C靜置15min，進行洗脫回收，將洗脫液吸出后，立即加入40 μ 1 2mol/L Tris溶液中和，再加入 IOml XLl-Blue 細胞(0D600 = 0. 8) 37°C靜置 15min,接著加入 IOml 含 20 μ g/ml AmpUO μ g/ml Tet的SB培養基。從2次回收的菌液分別取出適量鋪盤測定CFU，其余細菌 37°C培養池，擴大體積到50ml，加入1. 7 X IO12PFU輔助病毒VCSM13 (廣州英韋創津生物科技有限公司)，30°C振蕩培養過夜。次日回收上清，常規PEG沉淀，所得的次級噬菌體抗體庫可進行下一輪的篩選。按相同方法進行3輪淘選，得到陽性噬菌體scFv抗體克隆。(2)噬菌體抗體的制備及抗bFGF特異性的檢測從篩選第4輪的培養盤隨機挑取集落在含有50 μ g/mL Amp的2YT培養液中37°C 過夜培養，第二天取30 μ 1細菌到Iml LB培養基中，37°C培養至對數生長期，加入輔助病毒VCSM13，30°C培養過夜，收取上清。按以下程序進行ELISA檢測將抗原(SPbFGF)稀釋至10 μ g/ml，用50 μ 1稀釋后的抗原包被ELISA板，2h后棄去孔內液體，用質量體積比3% 脫脂奶-PBS溶液(即用0. 01M、pH7. 2的PBS配制的脫脂奶溶液)封閉后加入噬菌體抗體液(即第三輪篩選獲得的陽性噬菌體)，37°C孵育lh，用質量體積比0. 05% Tween20-PBS 溶液(即用0.01M pH7. 2的PBS配制的脫脂奶溶液)洗滌3次，加入HRP-抗M13鼠單抗 (Promega公司)進行反應，洗滌后加入TMB底物顯色，讀取A450值。篩選到的具有與bFGF 特異性結合的噬菌體抗體克隆的ELISA結果如圖1所示，圖1的結果表明，通過三輪噬菌體展示篩選，篩選到了抗bFGF陽性的噬菌體&FV抗體克隆。用2號噬菌體測序，得到編碼抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體的基因。編碼重鏈可變區的基因序列如下所示CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATGAAATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTC ATACATTAGTAGTAGTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACG CCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCTA ACTGGGGATTGGGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACTGTCTCCTCA ；編碼輕鏈可變區的基因序列如下所示CAGTCTGTGTTGACGCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACT GGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCAT GATTTATGATGTCAGTAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCC TGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTGTGGTA TTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGG。實施例2(1)單鏈抗體的原核表達將測序正確的陽性克隆，通過下述引物擴增之后，連接到原核表達載體 pET32a (Promega 公司)中。PCR的反應條件為反應體系為50μ1:
擴增ScFv 的上游引物 5，-GGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGA-3，；下游引物5，-AAGCTTGCTGACCGTCCTAGGG-3，10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ 1, dNTP Mixture (2mM) 5 μ 1,上下游引物各 1μ l(10ymol/L)，Blendtaq-plus(Promega 公司)0. 5 μ 1，陽性噬菌體抗體克隆 1μ 1，滅菌去離子水補充至50 μ 1。PCR擴增程序為94°C預變性^iin，94°C變性45s，M°C退火40s，72°C延伸60s，沘個循環后，72°C延伸lOmin。反應產物經1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收并純化，得到PCR擴增的kFv片段。酶切反應通過BamHI (Takara公司)和HindIII (Takara公司)雙酶切pET3 i載體，通過酶切產物回收試劑盒回收載體；通過BamHI (Takara公司)和HindIII (Takara公司)雙酶切PCR擴增的kFv片段，通過酶切產物回收試劑盒回收kFv片段。連接反應體系(10 μ 1) :pET32a酶切產物(50ng/ μ 1) 1 μ 1，ScFv酶切產物 5uL(50ng)，連接緩沖液2 μ 1，T4DNA連接酶(Promega公司)luL。加去離子水至終體積為 20μ L· 16°C連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌HB2151 (Promega公司)，挑取單克隆，提取質粒酶切鑒定，將陽性克隆送生工測序，重組載體命名為pET3h-ScFv重組載體。將測序正確的2號克隆接種2mL SB培養基(上海華壹生物科技有限公司)，37°C、200rmp的速度振蕩培養8 9小時，接著將培養得到的Iml菌液接種至50ml含有50 μ g/mL Amp的SB培養基振蕩培養至0D600 ^ 0. 8，加入IPTG至終濃度0. 5mmol/L, 30°C培養2 8小時，誘導表達之后將菌體離心，棄去上清，0. OlM, pH7. 2的PBS重懸菌體，超聲破碎。12000g/min離心之后取上清，根據分子克隆操作，SDS-PAGE和Western-blot鑒定結果如圖2所示，圖2的結果表明，ScFv抗體在原核細胞中獲得表達，并經Wfestern-blot鑒定正確。(2)kFv抗體的純化①收集原核表達的菌液1L，5000rpm離心5min收集菌體沉淀，0. 01M、pH7. 2的PBS 洗滌兩次，重懸于200mL PBS中。②設置MIS0NIX超聲乳化儀的振幅為50，超聲時間為5s，間隔時間為10s，總共超聲時間為20min，超聲溫度上限為30°C，冰浴超聲裂解菌體。③將裂解上清最大離心力離心30min，0. 45 μ m濾膜過濾，上清上樣于含SOmM咪唑的PBS緩沖液(0. 01M、pH7. 2)平衡的Ni-NTA親和層析柱，上樣速度為0. 5mL/min、以含80mM 咪唑的PBS緩沖液(0. 01M、pH7. 2)洗滌至基線，再用含130mM咪唑的PBS緩沖液(0. 01M、 PH7. 2)洗滌雜蛋白峰，洗滌至A280值不再降低，洗滌速度為1. 5mL/min，最后用含500mM咪唑的PBS緩沖液(0. 01M、pH7. 2)緩沖液洗脫目的蛋白，純化的kFv抗體的純度達94%。實施例3(1)人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)增殖抑制試驗用2 X IO3/孔的細胞胞密度接種HUVEC細胞(廣州雅吉生物科技有限公司)到96 孔板中，用M199培養基(廣州雅吉生物科技有限公司)添加10%胎牛血清(FBS，Gibico公司)于37°C培養16小時。將培養基換為含0.5%FBS的M199培養基，加入20ng/mL bFGF和不同濃度的實施例1制備得到的人源性&FV抗體，對照組同樣換為含0. 5%牛血清(FBS) 的M199培養基，加入20ng/mL bFGF和與抗體等體積的0. 01M、pH7. 2的PBS)，37°C培養4天后，利用CCK-8試劑盒測定活細胞數量。結果見圖3，圖3的結果表明，抗bFGF kFv抗體能夠有效抑制血管內皮細胞HUVEC的增殖，說明kFv能夠中和培養體系中的bFGF的作用，進而抑制血管內皮細胞的增殖。(2) HUVECs的成管實驗將基質膠(Metrigel)從_20°C取出，置冰上融化，將基質膠與置冰上預冷的M199 培養基按體積比1 1混勻。將稀釋好的基質膠以50 μ L/孔加入到96孔孔板中。37°C孵育30min使基質膠凝固形成均一的膠層。用質量體積比為0. 25%的胰酶溶液消化HUVECs 細胞，用含體積百分比5% FBS的M199培養基重懸細胞調整細胞密度為IX IO5細胞/mL， 接著按150 μ L/孔的細胞到凝固的基質膠上，混勻細胞，37°C細胞培養箱孵育4小時。倒置顯微鏡下觀察細胞成管情況，并計數成管數。結果見圖4，圖4的結果表明，抗bFGF kFv抗體組的血管內皮細胞成管數明顯少于對照組，說明抗bFGF kFv抗體能夠抑制血管內皮細胞的成管作用。實施例4腫瘤細胞增殖抑制試驗將對數生長期的神經膠質瘤細胞U87MG(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司) 用DMEM培養基調整細胞密度為104/mL。在96孔板中，每孔加入1000個細胞，37°C培養過夜，使細胞貼壁。加入不同濃度的實施例2制備得到的人源性kFv抗體，對照組加入0.01M、 PH7. 2的PBS，37°C培養4天。4天后加入10 μ L CCK-8, 37°C孵育30min。酶標儀測定光吸收值0D405nm的讀數。細胞增值抑制結果見圖5，圖5的結果表明，抗bFGF ScFv抗體能夠抑制腫瘤細胞的增殖作用，其增殖抑制率達達到50%以上。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
8
權利要求
1.一種抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體，其特征在于所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2.根據權利要求1所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體，其特征在于編碼所述的重鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.根據權利要求1所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體，其特征在于編碼所述的輕鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。
4.權利要求1 3任一項所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體的應用，其特征在于所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體用于制備診斷和治療腫瘤和/或抑制內臟纖維化的抗體藥物。
5.根據權利要求4所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體的應用，其特征在于所述的內臟為腎、肝或肺。
6.根據權利要求4所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體的應用，其特征在于所述的抗體藥物為將編碼所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體的基因構建、表達，得到多種形式的小分子基因工程抗體。
7.根據權利要求6所述的抗人堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體的應用，其特征在于所述的小分子基因工程抗體為Fab抗體、F(ab)2、單鏈抗體、納米抗體、抗體融合蛋白或IgG全抗體。
全文摘要
本發明公開了一種抗重組堿性成纖維細胞生長因子人源性scFv抗體及其應用。該人源性scFv抗體的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。編碼重鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO.3所示。編碼輕鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO.4所示。該人源性scFv抗體具有高親和力和特異性，由于是全人源性的抗體，可以直接開發為人用的抗體藥物。將編碼該人源性scFv抗體的基因構建、表達，得到多種形式的小分子基因工程抗體，如Fab抗體、F(ab)2、單鏈抗體、納米抗體、抗體融合蛋白和IgG全抗體等，可用于制備診斷和治療腫瘤和/或抑制內臟纖維化的抗體藥物。
文檔編號C12N15/13GK102558351SQ201110449568
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月28日 優先權日2011年12月28日
發明者呂衛東, 宋其芳, 王宏, 鄧寧, 黃靜怡 申請人:暨南大學