專利名稱：β-葡萄糖苷酶Cel1b及其表達基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及葡萄糖苷酶Cellb及其表達基因與應用，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
地球上存在豐富的木質纖維素資源，其在可循環替代能源及基礎化合物生產方面具有巨大的應用潛力。自然界存在許多可有效降解轉化木質纖維素的微生物，其對木質纖維素的降解過程構成了地球碳循環的一個重要方面，如瑞氏木霉(Trichoderma reesei)是最重要的代表菌株。它主要通過分泌纖維素酶來降解纖維素，主要包括外切葡聚糖苷酶、 內切葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶等。真菌所產生的纖維素酶大部分都是誘導酶，通過添加誘導物及對纖維素酶合成途徑進行調控是提高纖維素酶活性的有效方法。現在人們普遍認可的一個觀點是從不溶性纖維素底物中釋放的某些可溶性寡糖是誘導纖維素酶表達的真正誘導因子，這主要是因為某些二糖如纖維二糖(cellobiose)、δ-纖維二糖內酯 (δ-cellobiono-l，5-lactone)、乳糖(lactose)及槐糖(sophorose，由 2 個葡萄糖通過 β -1，2糖苷鍵連結的雙糖分子)等均具有較強的纖維素酶誘導能力。纖維寡糖常用于纖維素酶水解機理和動力學的研究(Guimaraes等，J MolBiol, 320 C3)，587-96，2002)；纖維寡糖還用于研究微生物對纖維素的利用過程，包括纖維素酶合成調控、細胞生長和生物產能。另外纖維寡糖具有腸道調節作用，可作為功能性食品或食品添加劑，也可作為糖尿病患者的甜味劑(如纖維二糖)；纖維寡糖還可以應用于化妝品工業和制藥工業，其應用前景非常廣闊。纖維寡糖制備應用最廣泛的方法是發煙鹽酸法(Miller，G. L等，Archives of Biochemistryand Biophysics, 1960,91 (1)，1-26.)，也可以采用采用混合酸法水解結晶纖維素法(Zhang，Y. H.等，Anal Biochem，2003，322 (2)，225-32.)。但這些方法需要消耗大量的鹽酸或者硫酸，成本很高，并且也給環境造成很大污染。近年來，β-葡萄糖苷酶被應用于合成生物寡糖以代替化學合成法(Saloheimo， Μ.等，ApplEnviron Microbiol. 2002,68 :4546-4553.)。目前普遍認為存在 2 種反應類型 水解反應的逆反應和轉糖苷反應。在高濃度葡萄糖存在的條件下，兩個葡萄糖單元能綁定到葡萄糖苷酶的活性位點上，在這兩個葡萄糖之間形成一個糖苷鍵。至少一個葡萄糖可以綁定到酶上，在這些葡萄糖單元之間，β-1-2和β-1-4-糖苷鍵都能形成。但現有明確轉糖基作用的葡萄糖苷酶種類少，應用條件受限較大。因此尋找新的具有轉糖基作用的纖維素酶對于利用纖維素具有重要的意義。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供葡萄糖苷酶Cellb及其表達基因與應用。一種表達β -葡萄糖苷酶Cellb的基因eel lb，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所
7J\ ο上述β -葡萄糖苷酶Cellb，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
本發明所涉及的基因cellb來自瑞氏木霉QM9414，在本發明的實施例1中提供了該基因cellb及β -葡萄糖苷酶Cellb的制備方法。該方法是以瑞氏木霉QM9414的總RNA 為模版，經反轉錄PCR方法得到cDNA，用特異性寡核苷酸引物通過PCR方法得到β -葡萄糖苷酶Cellb的cDNA。該序列由1452個核苷酸組成，編碼484個氨基酸。然后通過異源表達基因cellb獲得β -葡萄糖苷酶Cellb。β -葡萄糖苷酶Cellb具有轉糖基活性，HPLC分析表明Cellb可以將部分葡萄糖轉化為纖維二糖，將部分纖維二糖轉化為纖維三糖和纖維四糖。一種重組載體，該載體包含有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的功能片斷。一種重組細胞，該宿主菌包含有上述重組載體或表達上述β -葡萄糖苷酶Cellb。上述基因cellb，β -葡萄糖苷酶Cellb、重組載體或重組細胞在合成纖維寡糖中的應用。有益效果本發明中的葡萄糖苷酶Cellb可以用于工業上合成價格昂貴的纖維寡糖，進而應用于研究纖維素酶水解機理、微生物對纖維素的利用過程等。另外這種體外生物法合成的纖維寡糖可作為功能性食品或食品添加劑，也可作為糖尿病患者的甜味劑(如纖維二糖)，還可以應用于化妝品工業和制藥工業，其應用前景廣闊。


圖1純化后的β -葡萄糖苷酶Cellb的電泳圖；圖2β-葡萄糖苷酶Cellb以40%葡萄糖為底物的轉糖基產物分析(HPLC)，G1代表葡萄糖，G2代表纖維二糖；圖3 β -葡萄糖苷酶Cellb以20%纖維二糖為底物的轉糖基產物分析(HPLC)，Gl 代表葡萄糖，G2代表纖維二糖，G3代表纖維三糖，G4代表纖維四糖；圖4 β -葡萄糖苷酶Cellb分別作用于不同濃度的葡萄糖和纖維二糖后的轉糖基產物的產量分析。
具體實施例方式下面結合說明書附圖和實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域內的技術人員了解本發明，但本發明所保護范圍不限于此。實施例中的瑞氏木霉購自美國典型微生物菌種保藏中心，菌種保藏號為ATCC NO. 26921。實施例1 β -葡萄糖苷酶Cellb的基因分離、定點突變、異源表達和純化(1)在瑞氏木霉MM培養基中接種瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的孢子IO6個， 30°C培養2 3天，收集菌絲，提取RNA，反轉錄得到cDNA ；瑞氏木霉匪培養基組分蛋白胨，2g；葡萄糖，20g ;(NH4)2804，5g ;K2HP04，15g 用 IM NaOH 調 pH 至 5. 5，定容值 IL后，分裝每瓶 200ml，滅菌后每瓶加 200 XMgSO4 (120g/l) Iml ；200 X CaCl2 (120g/l) Iml ； 100X 尿苷(IM) ,2ml ； 1000 X 微量元素(FeSO4.7H20，5g/l ；MnSO4 ·Η20，1. 6g/l ；ZnSO4,1. 4g/ 1 ；CoCl2,2g/l) ,200μ 1。
RNA的提取采用Trizol法，Trizol試劑購自hvitrogen公司，步驟參見產品說明書。反轉錄采用購自Takara公司的RNA PCR Kit試劑盒，步驟參見產品說明書。(2)以步驟(1)獲得的總cDNA為模板，以32a_cellb F和32a_cellb R為引物，采用PCR的方法，得到eelIb的cDNA，引物序列如下32a-cellb F:CCGGAATTCCCCGAGTCGCTAGCTCTGCCC ； SEQ ID NO. 332a-cellb R :CCCAAGCTTTGCCGCCACTTTAACCCTCTGC ； SEQ ID NO. 4反應體系(25 μ L)為
cDNA1 μL
IOx擴增緩沖液2.5 μL
dNTP (各 2.5mM)1 μ
32a-cellbF (ΙΟμΜ)1 μ
I174CupR (ΙΟμΜ)1 μ
Pfu 酶(5υ/μ )0.5 μ
ddH2018 μL
總體積將反應組分混勻后離心，置于PCR儀中反應。反應程序為94°C預變性5min ；然后進行以下循環94°C變性lmin，6(TC退火30s，72°C延伸3min，共進行30個循環；最后72°C 延伸lOmin。PCR產物經過純化后，獲得完整基因。(3)用EcoRI和HindIII酶切步驟(2)制得的完整基因和載體pET_32a，然后將酶切后的完整基因連入PET3M，得Cellb表達質粒，利用pET-3h載體的測序通用引物，測序后，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。(4)將Cellb表達質粒利用熱激法轉化大腸桿菌Origami B (DE3)，在LB培養基中培養到OD600大約為0. 6時加入IPTG(終濃度為100 μ Μ)，20°C誘導過夜。IlOOOrpm,離心 2min，收集菌體后重懸于 Lysis Buffer (50mM NaH2P04, 300mM NaCl, ImM PMSF, pH8. 0)；將上述菌體超聲破碎，離心得到上清，對上清進行SDS-PAGE(以未誘導的菌體進行同樣操作為對照)，發現上清中有明顯的表達條帶；該上清經過鎳離子親和層析柱(Ni-NTA)純化，得到β -葡萄糖苷酶Cel lb，通過超濾離心更換緩沖液為pH7. O的50mM NaH2PO4緩沖液，分子量大約為68. 31kD，電泳驗證如圖2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。實施例2 β-葡萄糖苷酶Cellb的轉糖基活性分析在300 μ 1反應體系中加入IOOyg實施例1制得的β -葡萄糖苷酶Cellb，20% 40% (w/v)的葡萄糖或10% 20% (w/v)的cellobiose，反應緩沖液為50mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)，不加酶的反應產物作為對照，45°C反應Mh。產物煮沸IOmin后離心取上清， 與bed resinTMD-8 (Sigma, USA)漩渦振蕩混勻lmin，離心取上清，得到除去鹽離子的上清， 使用帶有RID-10A refractive index detector禾PBio-Rad Aminex HPX-42A carbohydrate column 的 LC-10AD HPLC (Shimadzu, Japan)分析產物。糖柱溫度為 75°C，使用 ddH20 以 0. 4ml/min的流速洗脫。產物通過HPLC分析，如圖2和圖3，在以葡萄糖為底物時產生了纖維二糖)以纖維二糖為底物時產生了纖維三糖和纖維四糖。產量如圖4，在上述反應體系中，以20% (w/v)葡萄糖和40% (w/v)葡萄糖為底物時，分別產生4. 6和56. 7mg/l的纖維二糖；以10% (w/v)纖維二糖為底物時，產生85. 8mg/l的纖維三糖和3. 2mg/l的纖維四糖； 以20% (w/v)纖維二糖為底物時，產生189. 6mg/l的纖維三糖和8. 6mg/l的纖維四糖。
權利要求
1.一種表達β-葡萄糖苷酶Cellb的基因cellb，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種β-葡萄糖苷酶Cellb，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—種重組載體，該載體包含有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的功能片斷。
4.一種重組細胞，該宿主菌包含有權利要求3所述重組載體或表達權利要求2所述 β-葡萄糖苷酶Cellb。
5.權利要求1所述基因eellb、權利要求2所述β -葡萄糖苷酶Cel lb、權利要求3所述重組載體或權利要求4所述重組細胞在合成纖維寡糖中的應用。
全文摘要
本發明涉及β-葡萄糖苷酶Cel1b及其表達基因與應用，屬于生物工程技術領域。本發明提供一種表達β-葡萄糖苷酶Cel1b的基因cel1b，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本發明還提供一種β-葡萄糖苷酶Cel1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明中的β-葡萄糖苷酶Cel1b可以用于工業上合成價格昂貴的纖維寡糖，進而應用于研究纖維素酶水解機理、微生物對纖維素的利用過程等。另外這種體外生物法合成的纖維寡糖可作為功能性食品或食品添加劑，也可作為糖尿病患者的甜味劑，還可以應用于化妝品工業和制藥工業，其應用前景廣闊。
文檔編號C12N15/56GK102492710SQ201110450999
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者劉巍峰, 呂新星, 周慶新, 徐金濤, 陳冠軍 申請人:山東大學