專利名稱：一種三角帆蚌幼蚌dna活體取樣方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三角帆蛘幼蛘DNA的取樣方法。
背景技術(shù)：
三角帆蛘是中國特有的淡水育珠母蛘，選育出品質(zhì)優(yōu)良的三角帆蛘是當前需要解決的關(guān)鍵問題之一。利用分子生物學手段(如分子標記技術(shù)等)能有效對三角帆蛘進行遺傳育種和種質(zhì)改良。提取一定質(zhì)量的高濃度基因組DNA是進行分子生物學研究的基礎和前提，成體三角帆蛘活體提取DNA比較簡便，但小規(guī)格三角帆蛘幼蛘活體提取DNA操作非常困難，目前均采用處死幼蛘，收集組織，進而提取DNA的方式，但這樣會導致大量含有足夠遺傳信息的優(yōu)良個體損失，所獲得的個體遺傳信息在選種上來說已經(jīng)沒有實際意義。因此，亟待建立一種提取三角帆蛘幼蛘活體DNA的方法。三角帆蛘繁殖存在一雌多雄受精的現(xiàn)象，在對親本的遺傳背景缺乏了解的情況下，可以利用幼蛘活體提取DNA技術(shù)鑒定幼蛘的遺傳多態(tài)性及個體間的親緣關(guān)系，進而選留優(yōu)良個體單獨培育，可以節(jié)省大量財力物力；利用幼蛘活體提取DNA技術(shù)可以進行目標經(jīng)濟性狀的早期預選、基因篩選、養(yǎng)殖狀況監(jiān)測等多項研究工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種獲取三角帆蛘幼蛘活體微量組織提取DNA的方法。為了解決上述問題本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的一種三角帆蛘幼蛘DNA活體取樣方法，包括以下步驟1)幼蛘外套膜組織的剝離選取脫苗后50天的幼蛘20只，分成實驗組和對照組，每組各10只，對幼蛘進行標記，并記錄每只幼蛘的體長和體重；用刀片輕輕撬開實驗組幼蛘蛘殼2 3mm，沿邊緣劃取外套膜組織，取樣ang，用鑷子夾取至離心管中；2)剝離組織基因組DNA的提取a.在上述離心管中加入200μ 1裂解液，55°C水浴消化至澄清，輕輕搖勻數(shù)次；b.之后加入200μ 1苯酚，輕微翻轉(zhuǎn)混合IOmin后，12000r/min離心20min，用前端剪掉Icm的粗口槍頭吸取上清液至新的離心管；c.重復步驟b，之后加入200 μ 1苯酚-氯仿-異丙醇混合液，其中苯酚、氯仿和異丙醇的體積比為25 24 1，輕微翻轉(zhuǎn)混合10min，12000r/min離心20min，吸取上清液至新的離心管；d.之后加入200μ1氯仿-異丙醇混合液，其中氯仿和異丙醇的體積比為M 1， 輕微翻轉(zhuǎn)混合lOmin，12000r/min離心20min，吸取上清液至新的離心管；e.之后加入兩倍于離心管中溶液體積的無水乙醇，其中無水乙醇的溫度為-20°C，然后于_20°C冰箱中靜置至少30min，12000r/min離心20min，倒掉溶液；f.在離心管中加入70%乙醇200μ 1，洗滌兩次，之后倒掉離心管中的液體，室溫晾干；g.待酒精揮發(fā)完全后，加入80μ 1無菌水，4°C冰箱中溶解至少4小時；3)提取DNA的檢測用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小，DNA大分子條帶清晰明亮；分光光度計檢測DNA的濃度和純度，DNA的濃度在42 130ng/ μ 1, DNA含量在3360ng以上，OD260/ OD280值在1. 8以上；4)幼蛘培育將取樣后的幼蛘放入IL濃度為0. 01mg/L的金霉素消毒液中，浸泡30分鐘后與對照組幼蛘均勻灑在底部鋪有2cm細泥沙的培育池中，將富含浮游生物的水注入培育池中對幼蛘進行流水培育，并保持水流平穩(wěn)以減少刺激，直至幼蛘達到穩(wěn)定生長狀態(tài)，一個月后， 對實驗組和對照組幼蛘生長數(shù)據(jù)進行T檢驗和SNK檢驗，結(jié)果均顯示實驗組和對照組幼蛘的生長無顯著差異。步驟1)中所述幼蛘的體長為1. 7 2. Icm,體重M3 391mg。步驟a中所述裂解液的成分如下Imol/L Tris-HCL10 μ 1,0. 5mol/L EDTA40 μ 1,10% SDS20 μ 1，10mg/ml ProteinaseK2 μ 1。所述lmol/L Tris-HCL 的 pH 為 8. 0。步驟2)中抽提DNA時均采用粗口槍頭。有益效果如下1>現(xiàn)有技術(shù)中提取DNA的組織材料用量一般為20 50mg，本發(fā)明中用量為2mg 左右，用量極少；2>提取的DNA質(zhì)量好，能滿足生物學研究需求，且剝離微量組織對幼蛘的生長無影響；3>研究對象規(guī)格小，有利于科研工作提前開展，可以縮短研究周期；4>研究對象無需處死，有利于收集優(yōu)良個體；5>早期選育目標經(jīng)濟性狀，鑒定小規(guī)格幼蛘的遺傳多態(tài)性及個體間的親緣關(guān)系， 選留優(yōu)良個體，提高育種效率。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
來詳細說明本發(fā)明；圖1為本發(fā)明提取DNA的電泳圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明。
本實施例中三角帆蛘幼蛘DNA活體取樣方法，包括以下步驟1>幼蛘外套膜組織的剝離選取脫苗后50天左右，體長為1. 7 2. Icm,體重為243 391mg的幼蛘20只，分為實驗組和對照組，每組各10只，用油性記號筆對幼蛘一一對應標記，用游標卡尺測量記錄體長，并測量記錄體重；用寬度為5mm左右且有一定韌度的刀片輕輕撬開實驗組幼蛘蛘殼2 3mm，沿著邊緣劃割外套膜組織2mg左右，將割離的外套膜組織劃出，用鑷子夾取至離心管中用于提取基因組DNA。2>采用酚氯仿法提取上述剝離組織的基因組DNA a.加入 200 μ 1 裂解液(lmol/L Tris_HCL，pH 8.0，10 μ 1 ；0. 5mol/L EDTA,40y 1 ； 10% SDS,20y 1 ；lOmg/ml Proteinase K，2 μ 1)，55°C水浴消化至澄清，輕輕搖勻數(shù)次；b.加入200 μ 1苯酚，輕微翻轉(zhuǎn)混合lOmin，12000r/min離心20min，用前端剪掉 Icm左右的粗口槍頭吸取上清液至新的離心管；C.重復步驟b，之后加入200 μ 1苯酚-氯仿-異丙醇(苯酚-氯仿-異丙醇的體積比為25 24 1)混合液，輕微翻轉(zhuǎn)混合10min，12000r/min離心20min，吸取上清液至新的離心管；d.加入200 μ 1氯仿-異丙醇(氯仿-異丙醇的體積比為M 1)混合液，輕微翻轉(zhuǎn)混合lOmin，12000r/min離心20min，吸取上清液至新的離心管；e.加入兩倍于離心管中溶液體積的無水乙醇(_20°C )，_20°C冰箱中靜置至少 30min, 12000r/min 離心 20min，倒掉溶液；f.用70 %乙醇洗滌兩次，每次用200 μ 1，倒掉溶液，室溫晾干；g.待酒精揮發(fā)完全后加入80 μ 1無菌水，4°C冰箱中溶解至少4小時；h.如圖1，用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小，得到的DNA大分子條帶清晰明亮；如表1，分光光度計檢測DNA濃度和純度，得到其濃度在42 130ng/y 1，DNA含量在3360ng以上，0D26Q/0D28Q值在1. 8以上，結(jié)果表明所提取的基因組DNA總量能滿足親子鑒定研究至少10對多態(tài)微衛(wèi)星分子標記的需求。 表1分光光度計檢測DNA結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種三角帆蛘幼蛘DNA活體取樣方法，其特征在于，包括以下步驟1)幼蛘外套膜組織的剝離選取脫苗后50天的幼蛘20只，分成實驗組和對照組，每組各10只，對幼蛘進行標記， 并記錄每只幼蛘的體長和體重；用刀片輕輕撬開實驗組幼蛘蛘殼2 3mm，沿邊緣劃取外套膜組織，取樣ang，用鑷子夾取至離心管中；2)剝離組織基因組DNA的提取a.在上述離心管中加入200μ 1裂解液，55°C水浴消化至澄清，輕輕搖勻數(shù)次；b.之后加入200μ1苯酚，輕微翻轉(zhuǎn)混合IOmin后，12000r/min離心20min，用前端剪掉 Icm的粗口槍頭吸取上清液至新的離心管；c.重復步驟b，之后加入200μ 1苯酚-氯仿-異丙醇混合液，其中苯酚、氯仿和異丙醇的體積比為25 24 1，輕微翻轉(zhuǎn)混合10min，12000r/min離心20min，吸取上清液至新的離心管；d.之后加入200μ1氯仿-異丙醇混合液，其中氯仿和異丙醇的體積比為M 1，輕微翻轉(zhuǎn)混合lOmin，12000r/min離心20min，吸取上清液至新的離心管；e.之后加入兩倍于離心管中溶液體積的無水乙醇，其中無水乙醇的溫度為-20°C，然后于-20°C冰箱中靜置至少30min，12000r/min離心20min，倒掉溶液；f.在離心管中加入70%乙醇200μ 1，洗滌兩次，之后倒掉離心管中的液體，室溫晾干；g.待酒精揮發(fā)完全后，加入80μ 1無菌水，4°C冰箱中溶解至少4小時；3)提取DNA的檢測用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小，DNA大分子條帶清晰明亮；分光光度計檢測DNA的濃度和純度，DNA的濃度在42 130ng/y 1，DNA含量在3360ng以上，OD260/OD280 值在1.8以上；4)幼蛘培育將取樣后的幼蛘放入IL濃度為0. Olmg/L的金霉素消毒液中，浸泡30分鐘后與對照組幼蛘均勻灑在底部鋪有2cm細泥沙的培育池中，將富含浮游生物的水注入培育池中對幼蛘進行流水培育，并保持水流平穩(wěn)以減少刺激，直至幼蛘達到穩(wěn)定生長狀態(tài)，一個月后，對實驗組和對照組幼蛘生長數(shù)據(jù)進行T檢驗和SNK檢驗，結(jié)果均顯示實驗組和對照組幼蛘的生長無顯著差異。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三角帆蛘幼蛘DNA活體取樣方法，其特征在于，步驟1) 中所述幼蛘的體長為1. 7 2. 1cm，體重為243 391mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三角帆蛘幼蛘DNA活體取樣方法，其特征在于，步驟a中所述裂解液的成分如下Imol/L Tris-HCL10 μ 1,0. 5mol/L EDTA40 μ 1,10% SDS20 μ 1，10mg/ml Proteinase K2 μ 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種三角帆蛘幼蛘DNA活體取樣方法，其特征在于，所述 lmol/L Tris-HCL 的 pH 為 8. 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三角帆蛘幼蛘DNA活體取樣方法，其特征在于，步驟2)中抽提DNA時均采用粗口槍頭。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三角帆蚌幼蚌DNA活體取樣方法，這種方法的研究對象規(guī)格小，研究對象無需處死，可早期選育目標經(jīng)濟性狀，提高育種效率，且提取DNA的組織材料的用量極少，提取的DNA質(zhì)量好，能滿足生物學研究需求；其技術(shù)要點是這種三角帆蚌幼蚌DNA活體取樣方法包括以下步驟1)幼蚌外套膜組織的剝離；2)剝離組織基因組DNA的提取；3)提取DNA的檢測；4)幼蚌培育。
文檔編號C12N15/10GK102424824SQ20111045565
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者李家樂, 白志毅, 羅明, 郭詩照 申請人:上海海洋大學