專利名稱：一種在恒溫?zé)嵩聪逻M(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚合酶鏈反應(yīng)方法及裝置。更具體地，本發(fā)明涉及基于熱對(duì)流建立液體自下而上的溫度梯度的原理，在液體受熱自發(fā)進(jìn)行對(duì)流，并在流經(jīng)不同溫度區(qū)域時(shí)發(fā)生相應(yīng)PCR擴(kuò)增的方法，以及相應(yīng)的裝置。
背景技術(shù)：
:聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(以下簡(jiǎn)稱PCR技術(shù))，是一種體外快速擴(kuò)增DNA的技術(shù)，每個(gè)循環(huán)包括變性、退火和延伸三個(gè)過程，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，目的核酸分子的數(shù)目擴(kuò)增一倍，經(jīng)過30-40個(gè)循環(huán)，目的核酸分子數(shù)目擴(kuò)增到原來的近IO9倍，PCR是體外大量獲得目的DNA片段的方法，便于對(duì)核酸分子做進(jìn)一步的分析和檢驗(yàn)。目前，PCR技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。PCR作為一個(gè)“無細(xì)胞基因擴(kuò)增系統(tǒng)”，在基礎(chǔ)研究中可用于克隆基因，并在此基礎(chǔ)上對(duì)基因組DNA進(jìn) 行直接序列分析，檢測(cè)突變位點(diǎn)，分析染色體重組等。在應(yīng)用研究中，則可以用于傳染病的診斷、遺傳疾病的檢測(cè)及產(chǎn)前診斷、法醫(yī)研究等。美國(guó)專利4，683，202 ;4，683，159 ;4，800，159 ;4，965，188 號(hào)對(duì) PCR 技術(shù)做出了描述。DNA的擴(kuò)增在體內(nèi)是由細(xì)胞內(nèi)有關(guān)因子的參與下，雙螺旋的DNA分子被解鏈成2條單鏈，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物與單鏈DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成引物單鏈DNA復(fù)合物；在DNA聚合酶作用下，沿著5’ -3’方向，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在引物3’端開始，逐一將互補(bǔ)的三磷酸脫氧核苷酸接上，最終形成一條新的雙鏈DNA分子。而DNA分子在體外的PCR擴(kuò)增模擬了體內(nèi)的三個(gè)步驟:首先，在大約95 °C的高溫下加熱雙鏈DNA樣品，雙鏈間的氫鍵會(huì)斷裂，使得DNA熱分解成兩條互補(bǔ)的單鏈DNA分子，這一過程稱為高溫解鏈反應(yīng)；然后，溫度迅速降到大約50-65°C的范圍內(nèi)，在這個(gè)溫度下單鏈DNA與引物按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合，這一過程稱為低溫退火反應(yīng)；退火反應(yīng)結(jié)束后，溫度要迅速升高到72°C左右進(jìn)行延伸反應(yīng)，在DNA聚合酶以及適當(dāng)鎂離子濃度的條件下，從引物的3’端開始結(jié)合單核苷酸，從而形成一條新的DNA。經(jīng)過一個(gè)這樣的過程，原來的一個(gè)DNA雙鏈分子就形成了兩個(gè)DNA分子，增加了一倍。反復(fù)進(jìn)行高溫解鏈-低溫退火-中溫延伸三個(gè)過程， 就可以獲得數(shù)量更多的復(fù)制雙鏈，并且這些新形成的雙鏈又可以作為下次循環(huán)的模板。目前，主流的PCR擴(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)裝置一般以溫控金屬塊加熱塑料制成的PCR反應(yīng)管，通過金屬塊的加熱、冷卻，達(dá)到平衡溫度后將熱通過反應(yīng)管傳遞至PCR反應(yīng)液。這種裝置的缺陷是:反應(yīng)體積較大，即系統(tǒng)通常具有較大的體積和熱容，常規(guī)PCR完成30個(gè)循環(huán)一般需要2-3小時(shí)，其中大部分時(shí)間消耗于加熱和冷卻過程，即將金屬塊達(dá)到平衡溫度并將熱通過反應(yīng)管傳遞至PCR反應(yīng)液，因此，PCR難以實(shí)現(xiàn)高效和高通量。而為了加快升降溫的速度，也使得PCR儀器制造的困難加大，儀器成本大幅度提高。在此基礎(chǔ)上，20世紀(jì)九十年代，研究者們開始將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于PCR擴(kuò)增。微流控芯片技術(shù)是近十年來迅速發(fā)展起來的一種新的微型分析系統(tǒng)，它采用微加工技術(shù)在厘米尺寸的玻璃、塑料及硅橡膠材料上蝕刻出微米尺寸的反應(yīng)管道及分析組件，由于各種分析過程可在微米尺寸的結(jié)構(gòu)中完成，一方面可使珍貴的生物試樣與試劑消耗降低到微升生至納升級(jí)，另一方面使分析速度成十倍、百倍的提高，實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)。PCR裝置的微型化不僅降低了 PCR樣品的消耗量，而且較低的熱容量顯著提高了系統(tǒng)的熱傳導(dǎo)效率，使PCR反應(yīng)速度大大加快。目前，PCR微流控芯片系統(tǒng)主要有兩種形式:微室靜態(tài)型PCR芯片和連續(xù)流動(dòng)型PCR芯片。前者是傳統(tǒng)PCR的微型化，即將反應(yīng)混合物固定在反應(yīng)池中，依賴于溫度控制裝置的溫度循環(huán)變化進(jìn)行熱循環(huán)擴(kuò)增，由于是傳統(tǒng)PCR的微型化，體積和熱容減少，因此反應(yīng)時(shí)間大大減少，能量消耗也大幅度的降低；而后者通過微加工形成逶迤形流路，在一定推動(dòng)力的作用下，使PCR反應(yīng)液連續(xù)流經(jīng)三個(gè)不同的溫區(qū)，完成變性、退火和延伸過程，其優(yōu)點(diǎn)是其反應(yīng)溫度無需來回反復(fù)地快速升降。雖然這兩種PCR微流控芯片系統(tǒng)能夠快速、高效擴(kuò)增目的DNA片段，并已成功的實(shí)現(xiàn)了與毛細(xì)管電泳分離，實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)以及數(shù)組芯片雜交等過程的集成化。但前者其實(shí)只是傳統(tǒng)PCR的微型化，仍沒有突破依靠加熱、冷卻模塊來反復(fù)升降溫的模式，沒有徹底解決升降溫的耗時(shí)長(zhǎng)問題；而后者雖然解決了反復(fù)升降溫的耗時(shí)問題，卻帶來新的問題，即系統(tǒng)通常包含復(fù)雜的液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，一方面增加了儀器及反應(yīng)容器制作的復(fù)雜性和成本，另一方面操作比較復(fù)雜，限制了其廣泛應(yīng)用。21世紀(jì)初，出現(xiàn)了一種新型的PCR擴(kuò)增方法，利用自然對(duì)流即雷諾-本納德對(duì)流原理進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。該技術(shù)是將PCR反應(yīng)液置于一個(gè)封閉的柱形反應(yīng)腔內(nèi)，反應(yīng)腔的上下表面分別進(jìn)行恒溫控制，通常上端溫度為60°C，下端溫度為97°C，通過上下表面的溫差驅(qū)動(dòng)液體經(jīng)過不同的溫區(qū)，實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增。這種方法不需要改變器件的溫度，也不需要外加驅(qū)動(dòng)來實(shí)現(xiàn)樣品的流動(dòng)，只需要一個(gè)反應(yīng)腔，并控制控制其上下兩端的溫度為恒溫，就可以實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增。但該方法依然存在缺陷:首先，試劑需填滿整個(gè)反應(yīng)腔，需密封，存在潛在的泄漏問題；其次，試劑直接注入反應(yīng)腔內(nèi)，導(dǎo)致加熱器與試劑直接接觸，存在潛在的污染問題。因此，現(xiàn)有技術(shù)中迫切需要一種新的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增方法以及相應(yīng)的裝置，以解決其中存在的易污染、反應(yīng)不穩(wěn)定的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明一方面提供了一種通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增核酸的方法，其中包括:(I)提供一端開口的反應(yīng)容器，在其中加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)物；(2)在該開口容器內(nèi)部或外部提供一個(gè)或多個(gè)可控制溫度的恒溫裝置，所述恒溫裝置被構(gòu)造成用于提供高于變性的溫度，和供給或移走熱量控制退火與延伸的溫度，并且通過接觸在反應(yīng)容器的不同部位，建立管壁和管內(nèi)空間的上下溫度梯度分布以使管內(nèi)液體產(chǎn)生穩(wěn)定的對(duì)流；(3)利用管內(nèi)液體對(duì)流進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，例如進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。優(yōu)選地，所述聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物中包含熒光染料或探針，從而能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本發(fā)明在另一方面提供了一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置，其中包含:(a)擴(kuò)增反應(yīng)容器，其中含有核酸擴(kuò)增試劑；(b) —個(gè)或多個(gè)可控制溫度的恒溫裝置；和(c)擴(kuò)增反應(yīng)容器間的隔熱裝置；其中通過不同的恒溫?zé)嵩唇佑|在擴(kuò)增反應(yīng)容器的上下部位，建立管壁和管內(nèi)垂直空間的溫度梯度分布。任選地，本發(fā)明的裝置還包含:(d)實(shí)時(shí)檢測(cè)裝置，例如熒光檢測(cè)
>J-U ρ α裝直。
本發(fā)明的出現(xiàn)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中各種方法的缺陷，它反應(yīng)速度快；儀器與反應(yīng)容器制作工藝簡(jiǎn)單、成本低廉；操作方便，無須密封，不與加熱器直接接觸，沒有潛在的泄露與污染問題。在本發(fā)明的方法和裝置內(nèi)，依據(jù)熱對(duì)流原理，管內(nèi)的PCR試劑會(huì)建立穩(wěn)定的自下而上的溫度梯度，進(jìn)而自發(fā)驅(qū)動(dòng)試劑產(chǎn)生對(duì)流運(yùn)動(dòng)，試劑在流動(dòng)過程中會(huì)經(jīng)過不同的溫度區(qū)域，從而達(dá)到PCR擴(kuò)增的目的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在擴(kuò)增的同時(shí)，本發(fā)明的特殊裝置可以采集擴(kuò)增時(shí)及擴(kuò)增后的熒光信號(hào)，可取代瓊脂糖凝膠電泳的鑒定步驟，達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的目的。首先，因不需反復(fù)升降溫，本發(fā)明最終將提供一種在機(jī)構(gòu)設(shè)計(jì)上更為簡(jiǎn)單，硬件裝置上更為便宜的方法與裝置，無需傳統(tǒng)PCR儀的諸多復(fù)雜機(jī)構(gòu)和電控，如精密溫控的電路板、通過消耗電能來改變溫度的裝置等。因此，基于本發(fā)明，我們可提供一種相比現(xiàn)有擴(kuò)增技術(shù)，更容易將核酸擴(kuò)增與檢測(cè)相整合的方法及裝置，本方法架構(gòu)簡(jiǎn)單，易于微型化并且整合為更多功能的復(fù)合微型化設(shè)備，如芯片上的全系統(tǒng)分析。其次，因不需反復(fù)升降溫，應(yīng)用本發(fā)明裝置進(jìn)行核酸擴(kuò)增，相較傳統(tǒng)PCR，本發(fā)明不僅省時(shí)，且能耗大大降低。第三，不僅可以進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，本發(fā)明也可對(duì)核糖核酸(RNA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。當(dāng)上下溫控設(shè)置相同溫度時(shí)，管內(nèi)試劑因熱傳遞而達(dá)設(shè)定的均溫，此時(shí)反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，重新設(shè)置上下溫控，使試管內(nèi)形成溫度梯度，即可發(fā)生熱對(duì)流，進(jìn)行PCR擴(kuò)增步驟。因此，僅需一次溫度的變化，即可使RNA在一管內(nèi)發(fā)生反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增兩個(gè)過程。這個(gè)方法的重要之處在于可實(shí)現(xiàn)以RNA為遺傳物質(zhì)的病原體的檢測(cè)，先前熱對(duì)流核酸擴(kuò)增技術(shù)尚無此類描述。綜上所述，本發(fā)明提供了一種比現(xiàn)有技術(shù)更加省時(shí)且更高效的核酸擴(kuò)增與檢測(cè)技術(shù)，克服現(xiàn)有方法因反復(fù)變溫而導(dǎo)致的高耗時(shí)高耗能的缺點(diǎn)。本發(fā)明可解決的問題及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，將在下文和附圖中詳細(xì)闡述。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增核酸的方法，其中包括:(I)提供一端開口的反應(yīng)容器，在其中加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)物，任選地所述聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物中包含熒光染料或探針；(2)在該開口容器內(nèi)部或外部提供一個(gè)或多個(gè)可控制溫度的恒溫裝置，所述恒溫裝置被構(gòu)造成用于提供高于變性的溫度，和供給或移走熱量控制退火與延伸的溫度，并且通過接觸在反應(yīng)容器的不同部位，建立管壁和管內(nèi)空間的上下溫度梯度分布以使管內(nèi)液體產(chǎn)生穩(wěn)定的對(duì)流；(3)利用管內(nèi)液體對(duì)流進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；以及；(4)任選地對(duì)熱對(duì)流聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，例如實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。在聚合酶鏈反應(yīng)管內(nèi)含有:待檢 樣本核酸、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、反應(yīng)緩沖液、二價(jià)鎂離子、非主要成分的PCR添加劑(如:NP-40，tween-20, DMSO等)和至少兩條與待檢核酸序列特異互補(bǔ)的寡核苷酸引物，以及任選地與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料或特異性熒光探針等。其后，用低密度的不易揮發(fā)物質(zhì)(如石蠟油或是各種低熔點(diǎn)的蠟)或采用高透明度的塑料蓋，覆蓋于試劑表面以防止蒸發(fā)并使光源穿透。在擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，在試劑與待測(cè)樣本中建立并維持穩(wěn)定的空間溫度分布，這是通過下述實(shí)現(xiàn)的:使不同熱源與反應(yīng)管緊密接觸進(jìn)行熱交換，對(duì)特定的區(qū)域供給熱量或是移走熱量，低溫度的區(qū)域在垂直高度上低于高溫度的區(qū)域；在反應(yīng)試管中特定空間溫度分布包含不同的特定空間區(qū)域，每個(gè)特定空間區(qū)域各自發(fā)生不同的PCR反應(yīng)的步驟，所述的特定空間區(qū)域具有一定的溫度范圍，其溫度條件適合于:1.變性反應(yīng)，其中雙鏈DNA解旋成為單鏈DNA;2.退火反應(yīng)，引物與單鏈DNA的互補(bǔ)區(qū)域配對(duì)，形成引物-單鏈DNA復(fù)合物；3.延伸反應(yīng)，聚合酶從引物-單鏈DNA配對(duì)區(qū)域開始逐個(gè)將三磷酸脫氧核糖核苷酸摻入，最終形成雙鏈產(chǎn)物。因反應(yīng)管內(nèi)建立穩(wěn)定的溫度梯度分布會(huì)導(dǎo)致持續(xù)性的熱對(duì)流，反應(yīng)試劑因此反復(fù)循環(huán)流動(dòng)進(jìn)行變性退火及延伸步驟，30分鐘內(nèi)即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中還包括與反應(yīng)同步的熒光監(jiān)測(cè)步驟。對(duì)聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。理論上PCR擴(kuò)增的每一個(gè)循環(huán)可使新生成的雙 鏈DNA拷貝數(shù)增加一倍，經(jīng)過20-30個(gè)循環(huán)可產(chǎn)生數(shù)目很大的雙鏈DNA。然而，PCR擴(kuò)增反應(yīng)受引物、三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)的消耗以及酶活性等條件影響，細(xì)微的條件變化都會(huì)影響其擴(kuò)增產(chǎn)量，反應(yīng)到一定程度會(huì)進(jìn)入平臺(tái)期。用終點(diǎn)法從擴(kuò)增產(chǎn)物的量來推算PCR反應(yīng)體系中范本的初始量很難得到可靠的結(jié)果。因此，最好的途徑是PCR實(shí)時(shí)定量，從擴(kuò)增曲線上升的斜率以及臨界循環(huán)數(shù)來估計(jì)范本的初始量。上世紀(jì)90年代初首先出現(xiàn)了 5’核酸酶PCR技術(shù)(即TaqMan技術(shù))來實(shí)時(shí)定量檢測(cè)特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；之后，又出現(xiàn)了用溴化乙錠染料實(shí)時(shí)測(cè)定雙鏈DNA的生成量。同時(shí)，研究人員開發(fā)了熒光探針或TaqMan探針來改善檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)定量方法。上世紀(jì)末，出現(xiàn)了在芯片上對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量的、均相的、特異性序列檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR是在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，采用針對(duì)擴(kuò)增DNA的熒光染料，使擴(kuò)增的DNA數(shù)量與檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，大致得到DNA的擴(kuò)增曲線。目前基于DNA和熒光染料的實(shí)時(shí)定量PCR通常有3種方法:TaqMan探針、SYBR Green I/EtBr染料檢測(cè)雙鏈DNA的生成量以及分子信標(biāo)。TaqMan探針是以一段與擴(kuò)增范本中部序列完全互補(bǔ)的探針的兩端，5’端與產(chǎn)熒光基團(tuán)(熒光染料)相連，而3’端與熒光猝滅基團(tuán)(猝滅劑)相連。由于熒光能量轉(zhuǎn)移，熒光染料的熒光受猝滅劑的影響被猝滅。在PCR過程中，由于DNA聚合酶的5’ -3’外切酶作用，使探針5’端的熒光染料被切斷而脫落至溶液中，熒光染料與猝滅劑之間的距離增大，擺脫了猝滅劑的作用而產(chǎn)生熒光。隨著PCR擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，越來越多的5’端熒光染料被切下，熒光也隨之增強(qiáng)。此方法適用:1、具有高適應(yīng)性和可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高；2、適用于擴(kuò)增序列專一的體系的檢測(cè)；3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測(cè)；
4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計(jì)條件都不能解決；5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，對(duì)特異性要求較高的定量；6、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量，在動(dòng)物病原體基因的檢測(cè)，畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫，生物制品的鑒定。SYBR Green I/Etfc染料則可用于檢測(cè)雙鏈DNA的生成量。Etfc是實(shí)時(shí)定量PCR中較常用的熒光染料，它含有一個(gè)可嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)，與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。當(dāng)染料分子插入后，其平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。SYBR Green I染料與DNA結(jié)合后熒光增強(qiáng)千倍，超過EtBr50倍，是目前最靈敏的雙鏈DNA熒光染料，它對(duì)光穩(wěn)定性好，不易發(fā)生光漂白(即熒光基團(tuán)在激發(fā)態(tài)受到光的不可逆破壞)，激發(fā)波長(zhǎng)494nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm附近。由于PCR反應(yīng)不斷產(chǎn)生新的雙鏈DNA，故可用SYBR Green I熒光的增強(qiáng)來實(shí)時(shí)定量檢測(cè)雙鏈DNA的生成量。此方法適用:1、靈敏度高:使用SYBR可使熒光效果增強(qiáng)到1000倍以上；2、通用性好，不需要設(shè)計(jì)探針，方法簡(jiǎn)便，省時(shí)，價(jià)格低廉；3、通用型方法，在國(guó)內(nèi)外科研中普遍使用；4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測(cè)；5、專一性要求不高的定量PCR檢測(cè)。分子信標(biāo)實(shí)質(zhì)上是一個(gè)首尾序列互補(bǔ)且分別標(biāo)記熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)的環(huán)狀探針。在PCR擴(kuò)增過程，每個(gè)循環(huán)的退火階段檢測(cè)到PCR反應(yīng)體系中的熒光信號(hào)。在退火階段，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與分子信標(biāo)結(jié)合產(chǎn)生熒光，而沒有結(jié)合的分子信標(biāo)仍然保持閉合環(huán)狀態(tài)不發(fā)生熒光。隨著PCR循環(huán)數(shù)目的增加，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度成正比關(guān)系。而熒光信號(hào)的激發(fā)與采集裝置是由光開關(guān)數(shù)組、自聚焦透鏡和尾纖準(zhǔn)直器及變?cè)鲆嫖⒐?/E裝置組成的有機(jī)整體，在以16位單片機(jī)為核心的電控裝置管理下，能在毫秒級(jí)時(shí)間內(nèi)完成多個(gè)標(biāo)本快速均衡掃描檢測(cè)，避免了機(jī)械掃描方式或CCD掃描方式引起的時(shí)間滯后或漸暈誤差。實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)樣本的高通量實(shí)時(shí)熒光激發(fā)和定量檢測(cè)。在本發(fā)明中，通過特別設(shè)計(jì)的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增方法和裝置，可以實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的效果。在聚合酶鏈反應(yīng)過程中，當(dāng)反應(yīng)管內(nèi)建立穩(wěn)定的溫度梯度分布時(shí)，試劑會(huì)因熱對(duì)流物理現(xiàn)象產(chǎn)生持續(xù)性與自發(fā)性 的循環(huán)流動(dòng)，進(jìn)行變性退火及延伸步驟。而試劑中的熒光染料含有一個(gè)可嵌入DNA堆積堿基之間的三環(huán)平面基團(tuán)，當(dāng)染料分子插入后，其平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用，這種行為幾乎沒有堿基序列特異性，會(huì)隨擴(kuò)增的進(jìn)行而不斷嵌入新生成的雙鏈DNA分子中。嵌入基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加，因此通過對(duì)熒光信號(hào)的采集即可反應(yīng)擴(kuò)增狀態(tài)。除熒光插入染料，本發(fā)明也可借熒光探針來實(shí)現(xiàn)熒光檢測(cè)的目的，熒光探針是一段與待檢序列完全互補(bǔ)的寡核苷酸，首尾分別標(biāo)記熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)，受引物的限制，熒光信號(hào)被猝滅基團(tuán)阻擋，因此檢測(cè)不到熒光信號(hào)。在熱對(duì)流循環(huán)過程中，試劑會(huì)持續(xù)性與自發(fā)性地進(jìn)行變性退火及延伸步驟，探針會(huì)黏合在序列上后被DNA聚合酶水解，探針斷裂后熒光基團(tuán)不再受猝滅基團(tuán)阻擋，發(fā)出熒光信號(hào)，此時(shí)采集器可以接受到熒光訊號(hào)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)。隨著試劑熱對(duì)流循環(huán)數(shù)增加，探針不斷被水解，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度成正比關(guān)系。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法還可以應(yīng)用于擴(kuò)增單鏈核糖核酸(RNA)。眾所周知，許多病原體其遺傳物質(zhì)為RNA (如HIV、HCV、流感等)，利用常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)無法實(shí)現(xiàn)一步法快速對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。本發(fā)明由于特殊設(shè)計(jì)的程序和設(shè)備，可以實(shí)現(xiàn)RNA模板的聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，解決非DNA樣本的問題，而先前熱對(duì)流核酸擴(kuò)增技術(shù)皆無此類描述。該步驟包括:將RT-PCR —步法試劑與待測(cè)樣本注入反應(yīng)試管，反應(yīng)管內(nèi)含有:樣本RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、無RNA酶的緩沖液、DNA聚合酶、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘧啶脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸、二價(jià)鎂離子、非主要成分的PCR添加劑(如:NP-40, tween-20, DMSO等)和至少兩條與標(biāo)本核酸序列特異性互補(bǔ)的寡核苷酸引物，以及任選地與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料或特異性熒光探針。最后用低密度的不易揮發(fā)物質(zhì)(如石蠟油或是各種低熔點(diǎn)的蠟)或采用高透明度的塑料蓋，覆蓋試劑表面以防止蒸發(fā)并使光源穿透。以上的試劑注入反應(yīng)管后，插入本發(fā)明的裝置的空洞中，第一步先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，設(shè)置上下溫控器使其具有相同溫度(35 70°C )，因熱傳遞整管試劑內(nèi)溫度均一，此條件下可發(fā)生反轉(zhuǎn)錄過程；反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，調(diào)節(jié)下方的溫度，使其增加至變性溫度(90 99°C )，并因此而形成溫度梯度，發(fā)生持續(xù)性的熱對(duì)流，試劑內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄酶流經(jīng)底部會(huì)因高溫變性而不再具有轉(zhuǎn)錄活性，而DNA聚合酶在自發(fā)循環(huán)流動(dòng)將以反轉(zhuǎn)錄出來的DNA作為模板，進(jìn)行變性退火及延伸的PCR步驟。為實(shí)踐上述擴(kuò)增方法，本發(fā)明提供一種應(yīng)用于熱對(duì)流PCR的核酸序列擴(kuò)增裝置，該裝置提供:不同溫度的熱源，可針對(duì)反應(yīng)管內(nèi)不同特定區(qū)域供給熱量或移走熱量。其中加熱裝置可以保持試管內(nèi)樣品的穩(wěn)定溫度分布，而低溫度的區(qū)域在垂直高度上低于高溫度的區(qū)域；反應(yīng)試管中空間溫度分布包含不同的特定區(qū)域，每個(gè)特定空間區(qū)域各自執(zhí)行不同的PCR反應(yīng)，所述的特定空間區(qū)域具有一定的溫度范圍，其溫度條件適合于:
1.變性反應(yīng)，其中雙鏈DNA解旋成為單鏈DNA ;2.退火反應(yīng)，引物與單鏈DNA的互補(bǔ)區(qū)域配對(duì)，形成引物-單鏈DNA 復(fù)合物；3.延伸反應(yīng)，聚合酶從引物-單鏈DNA配對(duì)區(qū)域開始逐個(gè)將三磷酸脫氧核糖核苷酸摻入，最終形成雙鏈產(chǎn)物。因反應(yīng)管內(nèi)建立穩(wěn)定的溫度梯度分布會(huì)導(dǎo)致持續(xù)性的熱對(duì)流，反應(yīng)試劑因此反復(fù)循環(huán)流動(dòng)進(jìn)行變性退火及延伸步驟，30分鐘內(nèi)即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。在本發(fā)明技術(shù)中，反應(yīng)容器內(nèi)的樣品試劑進(jìn)行循環(huán)流動(dòng)進(jìn)行變性退火及延伸步驟，此過程序自動(dòng)化且自發(fā)重復(fù)發(fā)生，與復(fù)雜電子和程控溫度、時(shí)間的循環(huán)PCR機(jī)臺(tái)比較，本發(fā)明在設(shè)計(jì)上和成本上有明顯的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明還提供一種溫控?zé)釋?duì)流聚合酶鏈反應(yīng)裝置，其中包含:(a)擴(kuò)增反應(yīng)容器，例如反應(yīng)試管，其中可以容納核酸擴(kuò)增試劑；(b) —個(gè)或多個(gè)可控制溫度的恒溫裝置，其形狀優(yōu)選為環(huán)狀的，套在反應(yīng)容器的外面并與之接觸；(C)位于擴(kuò)增反應(yīng)容器間的隔熱裝置；以及(d)任選地，實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)裝置；通過不同的恒溫?zé)嵩唇佑|在擴(kuò)增反應(yīng)容器的上下部位，建立管壁和管內(nèi)垂直空間的溫度梯度分布。1.擴(kuò)增反應(yīng)容器先前熱對(duì)流PCR反應(yīng)腔有兩大主流，一個(gè)是將細(xì)管(I 0.5mm)兩端接起后形成液體對(duì)流腔，另一個(gè)是在兩端開口的圓柱體中的空間進(jìn)行反應(yīng)。它們的缺點(diǎn)在于細(xì)管銜接困難且在試劑裝載時(shí)容易產(chǎn)生氣泡，進(jìn)而影響試劑的正常對(duì)流；而兩端開口的圓柱體，為了不讓試劑外漏，其加熱片必須緊貼于開口處，與試劑直接接觸，容易造成污染問題。本發(fā)明的反應(yīng)容器為一端開口另一端閉口的管狀或柱狀容器，便于試劑加入與吸出，且容易制造，生產(chǎn)成本低可達(dá)拋棄式的目的。本發(fā)明的容器可以是反應(yīng)試管的形式，并且可以用任何適當(dāng)?shù)牟牧现圃?，如玻?glass)、聚丙烯(PE)、聚醚砜(PES)、丙烯(PP)、聚丙酸酯(PC)、聚砜(PSF)等。2.環(huán)狀加熱裝置:先前熱對(duì)流PCR皆使用加熱塊平貼在試管上做單面的加熱，即有可能造成受熱不均勻的問題。在本發(fā)明則采用環(huán)狀加熱的方式，即在一定厚度的加熱片上鉆孔，將反應(yīng)管套入使其緊密接觸，加熱片熱量通過接觸面?zhèn)鲗?dǎo)至內(nèi)部試劑，從而達(dá)到均勻的溫度。本發(fā)明中有兩個(gè)環(huán)狀加熱裝置，下方環(huán)狀裝置提供較高的溫度加熱于試管底部周圍，試劑受熱上浮，同時(shí)發(fā)生PCR反應(yīng)中的變性步驟；上浮至上液面時(shí)，部分熱量通過上方的環(huán)狀加熱片導(dǎo)出，并維持一定的溫度，在該溫度下發(fā)生PCR中的退火與延伸的步驟；此時(shí)試劑因冷卻而再次下沉，到達(dá)底部后重新受熱再次上浮，開始PCR反應(yīng)的下一個(gè)循環(huán)。傳統(tǒng)PCR反應(yīng)時(shí)間通常需要2 3小時(shí)，為了縮短時(shí)間，PCR儀采用熱傳導(dǎo)率高的鍍金/銀塊和致冷芯片，雖達(dá)到了目的，但大大增加了儀器成本。本發(fā)明使得PCR步驟無須反復(fù)升溫、冷卻，省卻了升降溫步驟的耗時(shí)，從而達(dá)到快速擴(kuò)增的目的。針對(duì)于具有不同退火溫度的引物，可調(diào)整上方環(huán)狀加熱裝置的溫度控制熱對(duì)流PCR的最佳反應(yīng)條件。3.隔熱裝置:本發(fā)明采用環(huán)狀加熱的方式，在一定厚度的加熱片上鉆孔，將反應(yīng)管分別套入試管上方與底部，使其緊密接觸。本發(fā)明中采用絕熱材料將兩塊加熱片中間填滿，其優(yōu)點(diǎn)為:
a.室溫的變化會(huì)影響管內(nèi)液體對(duì)流的流場(chǎng)與速度，本發(fā)明的隔熱裝置可以降低外界環(huán)境溫度變化對(duì)管內(nèi)流場(chǎng)的影響，維持管內(nèi)試劑在不同外界條件下一致的反應(yīng)；b.上下兩個(gè)加熱片本身的溫度不同，也會(huì)因空氣對(duì)流與熱傳導(dǎo)而相互影響，從而導(dǎo)致溫控上的波動(dòng)，本發(fā)明的隔熱裝置可以降低兩塊加熱片間的溫度干擾，從而維持管內(nèi)試劑一致的反應(yīng)；c.試管在加熱過程中也會(huì)散發(fā)熱量，進(jìn)而影響相鄰管的溫度分布，本發(fā)明隔熱裝置可以阻隔相鄰管間的熱傳導(dǎo)，降低互相的溫度影響，維持管內(nèi)試劑一致的反應(yīng)。本發(fā)明的隔熱裝置可以使用任何熱傳導(dǎo)系數(shù)低的材料，如:玻璃纖維棉、木頭、耐熱泡棉、云母片、耐熱塑料等等。4.熒光檢測(cè)裝置利用熒光染料或探針，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量可通過熒光強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，隨PCR產(chǎn)物增力口，熒光強(qiáng)度增加，以此達(dá)到實(shí)時(shí)與終點(diǎn)檢測(cè)的目的。以往PCR為了讓試管完全加熱,用整塊金屬將試管周圍完全包裹，因而熒光的光路配置只能采用上打光與上收光的方式，故大部分的實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)只能把光學(xué)系統(tǒng)架于試管上方，限制了硬件的設(shè)計(jì)。本發(fā)明則采用底部環(huán)狀加熱的方式，除了可控制接觸試管表面與內(nèi)部試劑均勻溫度外，激發(fā)光源也因此可以安置于試管下方。因此激發(fā)光束可以從試管底部中間垂直穿透試劑，當(dāng)試劑擴(kuò)增時(shí)，激發(fā)光與發(fā)射光在經(jīng)過光路中的窄頻濾光盤時(shí)，激發(fā)光會(huì)被屏蔽，從而使上方光學(xué)接收受器接收到專一的產(chǎn)物熒光信號(hào)；窄頻濾光盤可放置多種濾光片，以便進(jìn)行多重產(chǎn)物的檢測(cè)。本發(fā)明的熒光檢測(cè)裝置的優(yōu)點(diǎn)為:以往實(shí)時(shí)PCR熒光信號(hào)采集裝置和激發(fā)光發(fā)射裝置必須設(shè)計(jì)在一起，因此需要使用復(fù)雜且昂貴的分光濾鏡組將不同的熒光訊號(hào)分開。本發(fā)明中熒光信號(hào)采集裝置和激發(fā)光發(fā)射裝置可以分開，一方面使得光學(xué)路徑上可采用多重方式，如:上打光下收光、下打光上收光、下打光試管側(cè)面收光與上打光試管側(cè)面收光等，另一方面無需昂貴的分光濾鏡組。
配合本方法的熒光檢測(cè)裝置，可以配合擴(kuò)增設(shè)備在擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)核酸量的變化。通過擴(kuò)增和檢測(cè)設(shè)備，可以從含有DNA和/或RNA的待檢測(cè)標(biāo)本中高效擴(kuò)增靶序列并實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。上述方法、目的、優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)將在下面附圖做詳細(xì)的闡述，在描述本發(fā)明時(shí)，當(dāng)相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)不會(huì)造成本技術(shù)要點(diǎn)含混不清時(shí)，將不再對(duì)相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步說明與解釋。


圖1:基于熱對(duì)流的核酸序列擴(kuò)增方法的原理示意圖。圖2:本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的核酸擴(kuò)增裝置與熒光檢測(cè)裝置橫截面圖。圖3:實(shí)施例2的溫度量測(cè)，無絕熱裝置時(shí)的管內(nèi)油水接口(Ti)。圖4:實(shí)施例2的溫度量測(cè)，有絕熱裝置時(shí)的管內(nèi)油水接口(Ti)。圖5:單一溫控(A)，雙溫控⑶與具絕熱方式的雙溫控(C)的管內(nèi)油水界面(Ti)溫度量測(cè)。圖6:電泳結(jié)果照片，說明實(shí)施例2擴(kuò)增的結(jié)果(與傳統(tǒng)PCR儀比較)。圖7:電泳結(jié)果照片，說明不同試劑體積和擴(kuò)增長(zhǎng)度的結(jié)果。圖8:電泳結(jié)果照片，說明上方不同溫度時(shí)的RNA擴(kuò)增結(jié)果。

圖9:電泳結(jié)果照片，說明底部不同溫度時(shí)的DNA擴(kuò)增結(jié)果。圖10:電泳結(jié)果照片，說明實(shí)施例2在不同反應(yīng)時(shí)間的結(jié)果。圖11:實(shí)時(shí)熒光紀(jì)錄圖，說明實(shí)施例2在不同濃度下的熒光擴(kuò)增曲線圖。(請(qǐng)?jiān)敿?xì)說明圖11中幾條曲線表示的含義)對(duì)圖中重要部分的數(shù)字的解釋101:反應(yīng)管102:片狀加熱器103:上方環(huán)狀加熱裝置104:溫度傳感器105:支架106:棒狀加熱器107:激發(fā)光源108:底部環(huán)狀加熱裝置109:絕熱材料I110:絕熱材料2111:濾光玻璃片112:感光檢測(cè)器以下參考附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案:圖1顯示基于熱對(duì)流物理現(xiàn)象所發(fā)明的核酸序列擴(kuò)增方法的操作示意圖。所描述的實(shí)施方案驗(yàn)證了整個(gè)原理的運(yùn)行，一端開口和一端封閉的反應(yīng)容器g加入試劑后，插進(jìn)加熱裝置內(nèi)，短暫時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生環(huán)流C，進(jìn)而形成兩個(gè)特定的溫度區(qū)域a與b，在圖一的實(shí)施方案中，試管與兩個(gè)加熱裝置f與d緊密接觸，通過試管壁向樣品特定區(qū)域a與b提供或是帶走熱量，此時(shí)因試管內(nèi)建立起了溫度梯度而驅(qū)動(dòng)試劑的流動(dòng)；絕熱材質(zhì)e的包埋避免了外界環(huán)境溫度和氣流的干擾，也阻止了管與管之間通過空氣進(jìn)行熱傳遞而相互影響的問題，提供了一個(gè)穩(wěn)定的熱條件幫助試劑形成穩(wěn)定且持續(xù)的環(huán)流，從而執(zhí)行不同的PCR反應(yīng)步驟，上述的特定空間區(qū)域(a，b)具有一定的溫度范圍，其溫度條件適合于:1.變性反應(yīng)，其中雙鏈DNA解旋成為單鏈DNA ；2.退火反應(yīng)，引物與單鏈DNA的互補(bǔ)區(qū)域配對(duì)，形成引物-單鏈DNA復(fù)合物；3.延伸反應(yīng)，聚合酶從引物-單鏈DNA配對(duì)區(qū)域開始逐個(gè)將三磷酸脫氧核糖核苷酸摻入，最終形成雙鏈產(chǎn)物。因反應(yīng)管內(nèi)建立穩(wěn)定的溫度梯度分布會(huì)導(dǎo)致持續(xù)性的熱對(duì)流，反應(yīng)試劑因此反復(fù)循環(huán)流動(dòng)進(jìn)行變性退火及延伸步驟。下面舉例以說明更詳盡的操作。例如，在合適的管狀或柱狀反應(yīng)容器中注入反應(yīng)試劑，包括待測(cè)標(biāo)本、DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸、特異性引物、熒光染料、特異性熒光探針、二價(jià)鎂離子和其他PCR添加劑。實(shí)驗(yàn)前先設(shè)定本裝置的兩個(gè)環(huán)狀加熱塊的溫度，底部加熱塊溫度設(shè)定90 99°C ;上方加熱塊溫度設(shè)定45 65°C，此溫度可依照不同退火溫度的引物調(diào)整，短暫時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到設(shè)定的穩(wěn)定溫度。整根試管插入本發(fā)明的加熱設(shè)備(見圖2)，下方環(huán)狀裝置提供較高的溫度加熱于試管底部周圍，試劑受熱上浮，同時(shí)發(fā)生PCR反應(yīng)中的變性步驟；上浮至上液面時(shí)，部分熱量通過上方的環(huán)狀加熱片導(dǎo)出，并維持一定的溫度，在該溫度下發(fā)生PCR中的退火與延伸的步驟；此時(shí)試劑因冷卻而再次下沉，到達(dá)底部后重新受熱再次上浮，開始PCR反應(yīng)的下一個(gè)循環(huán)。試劑在一分鐘內(nèi)即可達(dá)到穩(wěn)定循環(huán)，25 30分鐘后即可反應(yīng)完全。
圖2顯示的是本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用熱對(duì)流物理現(xiàn)象的PCR核酸序列擴(kuò)增與檢測(cè)裝置，其橫截面圖所示為反應(yīng)試管、環(huán)狀加熱裝置、隔熱裝置、熒光檢測(cè)裝置四大構(gòu)件的相關(guān)位置和功用，圖二所示的裝置含有維持不同溫度的熱源裝置，此裝置在絕熱材質(zhì)的包埋下，避免外界環(huán)境溫度和氣流的干擾，也阻止了管與管之間通過空氣進(jìn)行熱傳遞而相互影響的問題，提供了一個(gè)穩(wěn)定的熱條件幫助試劑形成穩(wěn)定且持續(xù)的環(huán)流，在本具體實(shí)施方案，加熱棒106將環(huán)狀加熱片108加溫至DNA變性溫度，109為隔熱材料，阻隔熱量的上傳，制冷芯片102可加熱或是冷卻上方環(huán)狀加熱片103，利用熱電偶104的溫度回饋，可以讓上方溫度調(diào)整以滿足RNA或是不同引物的擴(kuò)增溫度條件。在加熱過程中，為避免受環(huán)境溫度和氣流影響，用絕熱材料(本實(shí)施例采用壓克力)將兩塊加熱片中間填滿，降低外界環(huán)境溫度變化對(duì)管內(nèi)流場(chǎng)的影響，維持管內(nèi)試劑在不同外界條件下一致的反應(yīng)；也降低兩塊加熱片間的溫度干擾，從而維持管內(nèi)試劑一致的反應(yīng)；并阻隔相鄰管間的熱傳導(dǎo)，降低互相的溫度影響，維持管內(nèi)試劑一致的反應(yīng)。架子105支撐整個(gè)結(jié)構(gòu)，熱對(duì)流反應(yīng)過程中，特異性探針被DNA聚合酶水解或熒光插入染料嵌入雙鏈而發(fā)出熒光，通過熒光強(qiáng)度信號(hào)的采集來對(duì)擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。本裝置采用底部環(huán)狀加熱的方式，激發(fā)光束從試管底部中間垂直穿透試劑，當(dāng)試劑擴(kuò)增時(shí)，激發(fā)光與發(fā)射光在經(jīng)過光路中的窄頻濾光盤時(shí)，激發(fā)光會(huì)被屏蔽(111)，從而使上方光學(xué)接收受器(112)接收到專一的產(chǎn)物熒光信號(hào)；窄頻濾光盤可放置多種濾光片，以便進(jìn)行多重產(chǎn)物的檢測(cè)。本發(fā)明的熒光檢測(cè)裝置的優(yōu)點(diǎn)為:以往real-timePCR熒光信號(hào)采集裝置和激發(fā)光發(fā)射裝置必須設(shè)計(jì)在一起，因此需要使用復(fù)雜且昂貴的分光濾鏡組將不同的熒光訊號(hào)分開。本發(fā)明中熒光信號(hào)采集裝置和激發(fā)光發(fā)射裝置可以分開，一方面使得光學(xué)路徑上可采用多重方式，如:上打光下收光、下打光上收光、下打光試管側(cè)面收光與上打光試管側(cè)面收光等，另一方面無需昂貴的分光濾鏡組。
本發(fā)明不局限于圖1與圖2所描述的核酸序列擴(kuò)增與檢測(cè)裝置，加熱方式的改變與容器形狀的改變皆屬于本發(fā)明的范疇。圖3是實(shí)施例2的溫度量測(cè)；在無絕熱裝置時(shí)的管內(nèi)油水接口(Ti)的溫度記錄，在試管中試劑最低溫度位于最高的上液面處，即礦物油和試劑接口的位置，這里的溫度提供設(shè)計(jì)引物時(shí)退火溫度的一個(gè)指針。本發(fā)明將T-type的熱電偶極插入此接口上,計(jì)算機(jī)紀(jì)錄 15 分鐘的溫度變化(PC-Based Data Acquisition Unit MX100, Yokogawa, Japan)。當(dāng)室溫24°C，無隔熱裝置，反應(yīng)管曝露在空氣中時(shí)，其結(jié)果顯示該接口平均溫度65.2V，最大溫差2.7°C。圖4是實(shí)施例2的溫度量測(cè)；在有絕熱裝置時(shí)的管內(nèi)油水接口(Ti)的溫度記錄，在試管中試劑最低溫度位于最高的上液面處，即礦物油和試劑接口的位置，這里的溫度提供設(shè)計(jì)引物時(shí)退火溫度時(shí)的一個(gè)指針。本發(fā)明將T-type的熱電偶極插入此接口上，用計(jì)算機(jī)紀(jì)錄 15 分鐘的溫度變化(PC-Based Data Acquisition Unit MX100, Yokogawa, Japan)。當(dāng)反應(yīng)管處于室溫24°C的環(huán)境，有隔熱裝置(本實(shí)施例采用壓克力)時(shí)，測(cè)定結(jié)果顯示其平均溫度為64.3°C，最大溫差0.6°C，相比無絕熱裝置的Ti溫差(2.7V )穩(wěn)定。圖5是實(shí)施例2的溫度量測(cè)；A組采用單一溫控，只有一環(huán)狀加熱片(95°C ) 口熱試管底部組分別有上下兩組環(huán)狀加熱片(95°C /65°C )，但兩加熱片中間沒有隔熱裝置；C組有上下兩組環(huán)狀加熱片(95°C/65°C )，加熱的同時(shí)以隔熱材質(zhì)將試管包覆。將T-type的熱電偶極插入此接口上，用計(jì)算機(jī)紀(jì)錄15分鐘的溫度變化(PC-Based Data AcquisitionUnit MX100, Yokogawa, Japan)。其結(jié)果顯示a.當(dāng)室溫24°C,只有單一溫控，Ti無法達(dá)到65°C且溫差波動(dòng)大(5.3°C ) ；b.采用上下兩個(gè)溫控(95°C /65°C )，當(dāng)室溫24°C，無隔熱設(shè)置時(shí)，其結(jié)果顯示平均溫度65.2°C，溫差2.7°C ；c.采用上下兩個(gè)溫控(95°C/65°C)，當(dāng)室溫24°C，且有隔熱裝置(本實(shí)施例采用壓克力)時(shí)，其結(jié)果顯示平均溫度64.3°C，溫差0.6°C。經(jīng)比較，本發(fā)明的雙溫控及隔熱裝置可以達(dá)到最理想的擴(kuò)增條件。圖6說明實(shí)施例2擴(kuò)增的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)前設(shè)定兩個(gè)環(huán)狀加熱裝置的溫度，底部溫度設(shè)定95°C ;上方溫度設(shè)定65°C。試管內(nèi)形成相對(duì)的高溫區(qū)、低溫區(qū)與對(duì)流區(qū)，試劑受熱上浮，同時(shí)發(fā)生PCR反應(yīng)中的變性步驟；上浮至上液面時(shí)，部分熱量通過上方的環(huán)狀加熱片導(dǎo)出，并維持一定的溫度，在該溫度下發(fā)生PCR中的退火與延伸的步驟；此時(shí)試劑因冷卻而再次下沉，到達(dá)底部后重新受熱再次上浮，開始PCR反應(yīng)的下一個(gè)循環(huán)。本實(shí)例將陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組(樣品用水替代)的試劑分別注入反應(yīng)管內(nèi)，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應(yīng)管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置30分鐘。而傳統(tǒng)機(jī)臺(tái)設(shè)定參數(shù)如下:95°C 10分鐘；95°C 20秒，65°C 20秒和72°C 30秒，循環(huán)35次；最后72°C 7分鐘。總耗時(shí)I小時(shí)50分鐘。最后分別從管內(nèi)取2μ I產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。從電泳圖可以看出，本發(fā)明裝置與傳統(tǒng)PCR儀擴(kuò)增片段(169bps)的亮度(P2)相當(dāng)(Pl);陰性對(duì)照組兩種方法(N1、N2)的結(jié)果均為陰性，但本發(fā)明的引物二聚體弱于傳統(tǒng)PCR儀。在反應(yīng)時(shí)間上本發(fā)明比起傳統(tǒng)PCR機(jī)臺(tái)節(jié)省近四倍的時(shí)間。圖7說明不同試劑體積與可擴(kuò)增長(zhǎng)度之間的相關(guān)性結(jié)果，本發(fā)明原理是在一反應(yīng)試管內(nèi)建立熱對(duì)流，即由 溫度梯度差導(dǎo)致液體的密度變化進(jìn)而引起流體的運(yùn)動(dòng)，稱為“自然對(duì)流”，這種自發(fā)性對(duì)流的現(xiàn)象和由驅(qū)動(dòng)設(shè)備強(qiáng)制推動(dòng)的流動(dòng)是完全不同的。當(dāng)流場(chǎng)穩(wěn)定后試劑會(huì)形成相似的流動(dòng)路徑，當(dāng)路徑越長(zhǎng)時(shí)，代表反應(yīng)時(shí)間會(huì)越長(zhǎng)，相當(dāng)于增加PCR每一步驟(變性、退火、延伸)的反應(yīng)時(shí)間。在本圖中采用2 5mm之間的長(zhǎng)度當(dāng)作反應(yīng)試管的直徑，當(dāng)試劑體積為75微升時(shí),試劑完成一個(gè)循環(huán)需約18 25秒；當(dāng)試劑體積增加致100微升時(shí)，試劑一個(gè)循環(huán)時(shí)間增加至28 33秒。瓊脂糖凝膠電泳圖的結(jié)果顯示，當(dāng)試劑體積只有75微升(1，2)時(shí)，產(chǎn)物并不明顯；增加試劑體積到100微升后(3，4)，可以保證長(zhǎng)度為300個(gè)堿基對(duì)的產(chǎn)物擴(kuò)增成功。圖8說明實(shí)施例2的擴(kuò)增結(jié)果，應(yīng)用本發(fā)明不僅可以對(duì)不同長(zhǎng)度的DNA擴(kuò)增，也可對(duì)不同長(zhǎng)度的RNA擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)前設(shè)定兩個(gè)環(huán)狀加熱裝置的溫度，底部溫度設(shè)定48°C ;上方溫度也設(shè)定48°C，此溫度可依不同的需要而調(diào)整(42°C 55°C)，五分鐘后即可達(dá)到設(shè)定的穩(wěn)定溫度。將陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組(樣本用水替代)的試劑分別注射入反應(yīng)管內(nèi)，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應(yīng)管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置20分鐘即完成反轉(zhuǎn)錄步驟。之后底部溫度調(diào)整至95°C，上方溫度調(diào)至65°C，開始進(jìn)行熱對(duì)流PCR反應(yīng)，20分鐘后完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。圖中所示3個(gè)片段分別為對(duì)3個(gè)長(zhǎng)度的RNA進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果，三個(gè)片段長(zhǎng)度分別為858bp，371bp，175bp。圖9說明底部不同溫度時(shí)DNA擴(kuò)增結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定裝置的兩個(gè)環(huán)狀加熱塊的溫度，底部分別為90、95與99°C ;上方固定設(shè)定65°C，短暫時(shí)間內(nèi)達(dá)到設(shè)定的穩(wěn)定溫度后，將整根試管插入本發(fā)明的加熱設(shè)備，下方環(huán)狀裝置提供較高的溫度加熱于試管底部周圍，試劑受熱上浮，同時(shí)發(fā)生PCR反應(yīng)中的變性步驟；上浮至上液面時(shí)，部分熱量通過上方的環(huán)狀加熱片導(dǎo)出，并維持一定的溫度，在該溫度下發(fā)生PCR中的退火與延伸的步驟；此時(shí)試劑因冷卻而再次下沉，到達(dá)底部后重新受熱再次上浮，開始PCR反應(yīng)的下一個(gè)循環(huán)。試劑在一分鐘內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定循環(huán)，25 30分鐘后反應(yīng)完全。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，本發(fā)明在底部溫度設(shè)定90(2)、95(3)與99°C⑷時(shí)，皆可以擴(kuò)增成功，其亮度與傳統(tǒng)機(jī)臺(tái)相當(dāng)(I)。圖10說明實(shí)施例2在不同反應(yīng)時(shí)間的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)標(biāo)本使用乙肝病毒質(zhì)粒(pHBV-48，GenBank編號(hào)NC003977)，濃度為每管10000拷貝，相同試劑和質(zhì)粒濃度條件下，配置13管。將這13管同時(shí)插入本發(fā)明的裝置加熱，每隔一定時(shí)間點(diǎn)將管子取出插入冰中以停止循環(huán)反應(yīng)，時(shí)間點(diǎn)分別為10分鐘(I)、11分鐘⑵、12分鐘(3)、13分鐘(4)、14分鐘
(5),15 分鐘(6),16 分鐘(7),17 分鐘(8),18 分鐘(9),19 分鐘(10)、20 分鐘(11)、25 分鐘
(12)、30分鐘(13)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，本裝置在反應(yīng)后第12分鐘即可檢測(cè)到明顯的擴(kuò)增條帶，14分鐘后每個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異性不大，說明20分鐘內(nèi)即可完成反應(yīng)，與傳統(tǒng)PCR相t匕，耗時(shí)明顯減少。圖11說明實(shí)施例3對(duì)DNA進(jìn)行C-PCR擴(kuò)增并同時(shí)進(jìn)行實(shí)施熒光檢測(cè)的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)前設(shè)定兩個(gè)環(huán)狀加熱裝置的溫度，底部溫度設(shè)定95°C;上方溫度設(shè)定65 °C，此溫度可依不同的引物而調(diào)整，五分鐘后即可達(dá)到設(shè)定的穩(wěn)定溫度。將陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組(范本用水替代)的試劑分別注射入反應(yīng)管內(nèi)，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應(yīng)管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置30分鐘。每隔五分鐘激發(fā)光源(480nm LED)打開并持續(xù)三秒，收光裝置(cool (XD)鏡頭前裝有530nm濾光玻璃片阻擋藍(lán)光通過，以曝光時(shí)間200毫秒的參數(shù)擷取圖片。30分鐘后反應(yīng)結(jié)束。結(jié)果顯示本發(fā)明裝置可用于DNA的擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析顯示本發(fā)明裝置用于核酸的定量檢測(cè)有很好的線性。
實(shí)施例
實(shí)施例1:1.材料與方法1.1反應(yīng)試管一端開口一端封閉的硼玻璃管，直徑范圍在2 5mm,整體長(zhǎng)度在10 45mm,夕卜徑在3 6mm,經(jīng)清洗滅菌后使用。1.2 樣本PCR試劑包含以下成分:2.1pg的HBV DNA樣品、2pmol的169F引物(5，-GCA CGGGAC CAT GCA GAA CCT GCA CGA T-3’，SEQ ID N0:l)、3pmol 特異性探針(FAM5'-TGCTGTACMAACCTTCGGACGGAMCTGCACT-'3BHQ，SEQ ID NO:2)、2pmol 的 169R引物(5’_GCA AGC CAGGAG AMCGG ACT GAG GCC CAC T_3’，SEQ ID NO:3),8 μ I 的 PCR 聚合酶混合液 LightCyclerFastStart DNA Master Hybridization Mixture (Roche, Germany)、4mM 二價(jià)續(xù)離子，總體積為55 μ 11.3 裝置本發(fā)明中熱對(duì)流聚合酶鏈反應(yīng)的擴(kuò)增與熒光檢測(cè)裝置由下列組件構(gòu)成:數(shù)個(gè)一端開口一端封口的反應(yīng)試管、環(huán)狀加熱裝置、隔熱裝置、熒光檢測(cè)裝置及支撐架，如圖2所示。1.4 流程實(shí)驗(yàn)前設(shè)定兩個(gè)環(huán)狀加熱裝置的溫度，底部溫度設(shè)定95°C;上方溫度設(shè)定65°C，此溫度可依不同的引物而調(diào)整，五分鐘后即可達(dá)到設(shè)定的穩(wěn)定溫度。將陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組(范本用水替代)的試劑分別注射入反應(yīng)管內(nèi)，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應(yīng)管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置30分鐘。2.結(jié)果2.1溫度測(cè)量與比較為了驗(yàn)證兩個(gè)環(huán)狀加熱裝置和絕熱裝置對(duì)管內(nèi)溫度穩(wěn)定度的影響，我們采用電偶極的方法來測(cè)量管內(nèi)試劑液面頂端的溫度(Tl)，此溫度的穩(wěn)定可確保引物的退火與延伸步驟順利進(jìn)行。當(dāng)?shù)撞繙囟仍O(shè)定95°c時(shí)，分別在三種不同條件下量測(cè)Tl溫度30分鐘:(i)單一溫控，只有底部環(huán)狀加熱；(ii)雙溫控，上方環(huán)狀加熱(65°C )雙溫控，上方環(huán)狀加熱(65°C)，管間用絕熱材料(壓克力)填滿。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有單一溫控溫度差異達(dá)5.3°C，而加入上方環(huán)狀溫控后溫度穩(wěn)定度提高(溫度差異2.7°C )，而加入隔熱裝置的實(shí)驗(yàn)，30分鐘內(nèi)溫度變化只有0.60C，證明本發(fā)明的有效性。2.2擴(kuò)增結(jié)果在電泳條件(1.5%瓊脂糖、150伏特、40分鐘)下，分析熱對(duì)流PCR和傳統(tǒng)PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果如圖6。圖上標(biāo)示P為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組，N為陰性對(duì)照組；1為傳統(tǒng)PCR儀擴(kuò)增結(jié)果,2為本發(fā)明裝置擴(kuò)增結(jié)果。傳統(tǒng)機(jī)臺(tái)(T3gradient, Biometra, Germany)溫度設(shè)定條件為:95°C十分鐘；95°C 20秒，65°C 20秒與72°C 30秒(45循環(huán));72°C 7分鐘；總耗時(shí)2小時(shí)15分鐘。本發(fā)明裝置無需溫度變化，總耗時(shí)只需30分鐘。結(jié)果顯示本發(fā)明裝置與傳統(tǒng)PCR儀擴(kuò)增片段(169bps)的亮度(P2)相當(dāng)(Pl);陰性對(duì)照組兩種方法(N1、N2)的結(jié)果均為陰性，但本發(fā)明的引物二聚體弱于傳統(tǒng)PCR儀。

實(shí)施例2
1.方法
1.材料與方法1.1 試劑RT-PCR 一步法試劑包括以下成分:RNA樣品5ul，上游引物IOpmol，下游引物IOpmol, AccessQuick Master Mix(promega)40ul, AMV Reverse Transcriptase 8u, DEPC水，其他非必要的PCR反應(yīng)添加劑，總體積80ul。本實(shí)施例中擴(kuò)增了 3套不同產(chǎn)物長(zhǎng)度片段(858bp，371bp，175bp)的引物為:CA16-VP1F2:TCCCATTGCAGATATGATT(SEQ ID NO:4)；CA16-VP1R2:GTTGTTATCTTGTCTCTACTAGTG(SEQ IDNO:5)；153Fa:CAAGCACTTCTGTTTCCC(SEQ ID NO:6)；541R:CCCAAAGTAGTCGGTTCC(SEQ ID NO:7)；CAF3:TGTGTTGAACCAYCACTCC(SEQ ID NO:8)；CAR3b:TAGGTAAACAACTCGCATTT(SEQ ID NO:9)。1.2 裝置本發(fā)明中熱對(duì)流聚合酶鏈反應(yīng)的擴(kuò)增裝置由下列組件構(gòu)成:數(shù)個(gè)一端開口一端封口的反應(yīng)試管、環(huán)狀加熱裝置、隔熱裝置、支撐架。1.3 流程實(shí)驗(yàn)前設(shè)定兩個(gè)環(huán)狀加熱裝置的溫度，底部溫度設(shè)定48°C;上方溫度也設(shè)定48°C，此溫度可依不同的需要而調(diào)整(42°C 55°C )，五分鐘后即可達(dá)到設(shè)定的穩(wěn)定溫度。將陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組(樣本用水替代)的試劑分別注射入反應(yīng)管內(nèi)，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應(yīng)管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置20分鐘即完成反轉(zhuǎn)錄步驟。之后底部溫度調(diào)整置95°C，上方溫度調(diào)至65°C，開始進(jìn)行熱對(duì)流PCR反應(yīng)，20分鐘后完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，總反應(yīng)共70分鐘，反應(yīng)結(jié)束后從管內(nèi)取2 μ I產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。電泳條件:1.5%瓊脂糖、150伏特、40分鐘。2.結(jié)果結(jié)果如圖8。圖上標(biāo)示P為陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組，N為陰性對(duì)照組；結(jié)果顯示本發(fā)明裝置可用于不同產(chǎn)物長(zhǎng)度的RNA擴(kuò)增，陰性對(duì)照結(jié)果為陰性。實(shí)施例31.材料與方法1.1 試劑PCR試劑包含以下成分:以10倍梯度稀釋的HBV全長(zhǎng)質(zhì)粒、2pmol的169F引物(5，-GCA CGG GAC CAT GCA GAA CCT GCACGA T-3，，SEQ ID NO:1)、2pmol 的 169R 引物(5，-GCA AGC CAGGAG AAA CGG ACT GAG GCC CAC T_3，，SEQ ID NO:3)、8μ I 的 PCR 聚合酶混合液 LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Mixture (Roche, Germany) >4mM 二價(jià)鎂離子，8ul的Sybr-Gold熒光染料，總體積為80 μ I。1.2 裝置本發(fā)明中熱對(duì)流聚合酶鏈反應(yīng)的擴(kuò)增與熒光檢測(cè)裝置由下列組件構(gòu)成:數(shù)個(gè)一端開口一端封口的反應(yīng)試管、環(huán)狀加熱裝置、隔熱裝置、熒光檢測(cè)裝置及支撐架。1.3 流程實(shí)驗(yàn)前設(shè)定兩個(gè)環(huán)狀加熱裝置的溫度，底部溫度設(shè)定95°C;上方溫度設(shè)定65°C，此溫度可依不同的引物而調(diào)整，五分鐘后即可達(dá)到設(shè)定的穩(wěn)定溫度。將陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組(范本用水替代)的試劑分別注射入反應(yīng)管內(nèi)，以少量石蠟油覆蓋試劑表面。將反應(yīng)管垂直插入加熱裝置的孔洞中，靜置30分鐘。每隔五分鐘激發(fā)光源(480nm LED)打開并持續(xù)三秒，收光裝置(cool (XD)鏡頭前裝有530nm濾光玻璃片阻擋藍(lán)光通過，以曝光時(shí)間200暈秒的參數(shù)掘取圖片。30分鐘后反應(yīng)結(jié)束。2.結(jié)果結(jié)果如圖11。結(jié)果顯示本發(fā)明裝置可用于DNA的擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析顯示本發(fā)明裝置用于核酸的定量檢測(cè)有很好的線性。以上實(shí)施例1、2和3中的結(jié)果證實(shí):第一、依據(jù)本發(fā)明的熱對(duì)流核酸擴(kuò)增與檢測(cè)裝置可以成功的完成PCR反應(yīng)。第二、針對(duì)RNA的樣本，本發(fā)明也可成功的擴(kuò)增和檢測(cè)，并且轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增可在同一管內(nèi)的進(jìn)行，便與整體的操作，增加實(shí)用性，此法重要之處在于許多病原體是以RNA為遺傳物質(zhì)的，采用本發(fā)明可以解決非DNA樣本的問題。對(duì)于本領(lǐng)域的研究和操作人員，本發(fā)明并不被限制在所述實(shí)施案例和附圖，凡圍繞本發(fā)明的中心技術(shù)思想，可作出多種替代和變化，因此少數(shù)的附圖和實(shí)施例僅用于舉例說明，不成為限制本發(fā)明的依 據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種通過熱對(duì)流進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法，該方法包括: (1)提供一端開口的反應(yīng)容器，在其中加入核酸擴(kuò)增反應(yīng)物，任選地所述聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物中包含熒光染料或探針； (2)在該開口容器內(nèi)部或外部提供一個(gè)或多個(gè)可控制溫度的恒溫裝置，所述恒溫裝置被構(gòu)造成用于提供高于變性的溫度，和供給或移走熱量控制退火與延伸的溫度，并且通過接觸在反應(yīng)容器的不同部位，建立管壁和管內(nèi)空間的上下溫度梯度分布以使管內(nèi)液體產(chǎn)生穩(wěn)定的對(duì)流； (3)利用管內(nèi)液體對(duì)流進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；以及； (4)任選地對(duì)熱對(duì)流聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，例如實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述恒溫裝置是一個(gè)或多個(gè)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在反應(yīng)容器內(nèi)，位于擴(kuò)增反應(yīng)物上方加入低密度的不易揮發(fā)物質(zhì)，防止試劑蒸發(fā)并使光源穿透。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)管具有高透明度的密閉蓋，用于防止試劑蒸發(fā)并使光源穿透。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)物內(nèi)包含有利建立熱對(duì)流且不影響反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中增加擴(kuò)增反應(yīng)物體積以增加縱向的試劑反應(yīng)空間。
7.權(quán)利要求1的方法，其中溫度控制方法利用固體、液體、氣體、光線或是微波加熱或冷卻反應(yīng)混合物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中還包括進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)物在熱對(duì)流循環(huán)中會(huì)有熒光物質(zhì)插入到的雙鏈DNA中用于監(jiān)測(cè)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中在熱對(duì)流循環(huán)中，特異的熒光探針被水解而產(chǎn)生熒光用于監(jiān)測(cè)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中在熱對(duì)流循環(huán)中，特異的熒光探針雜交于靶序列上，可用于監(jiān)測(cè)。
12.—種溫控?zé)釋?duì)流聚合酶鏈反應(yīng)裝置，其中包含: (a)擴(kuò)增反應(yīng)容器，其中可以容納核酸擴(kuò)增試劑； (b)一個(gè)或多個(gè)可控制溫度的恒溫裝置； (c)擴(kuò)增反應(yīng)容器間的隔熱裝置；以及 (d)任選地，實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)裝置；其中 通過不同的恒溫?zé)?源接觸在擴(kuò)增反應(yīng)容器的上下部位，能夠建立管壁和管內(nèi)垂直空間的溫度梯度分布。
13.權(quán)利要求12的核酸擴(kuò)增裝置，擴(kuò)增反應(yīng)容器為管狀或柱狀，一端開口，另一端封口，優(yōu)選所述反應(yīng)容器由選自玻璃、聚丙烯(PE)、聚醚砜(PES)、丙烯(PP)、聚丙酸酯(PC)和聚砜(PSF)等的材料制成。
14.權(quán)利要求12的核酸擴(kuò)增裝置，其中所述隔熱裝置是絕熱材料，優(yōu)選為任何熱傳導(dǎo)系數(shù)低的材料，更優(yōu)選選自玻璃纖維棉、木頭、耐熱泡棉、云母片、耐熱塑料等或其組合。
15.權(quán)利要求12的核酸擴(kuò)增裝置，其適用于由反應(yīng)管下方射入激發(fā)光束，在反應(yīng)管上方由檢測(cè)器收光。
16.權(quán)利要求12的核酸擴(kuò)增裝置，其適用于由反應(yīng)管上方射入激發(fā)光束，在反應(yīng)管下方由檢測(cè)器收光。
17.權(quán)利要求12的核酸擴(kuò)增裝置，其適用于由反應(yīng)管上方射入激發(fā)光束，在反應(yīng)管側(cè)面由檢測(cè)器收光。
18.權(quán)利要求12的核酸擴(kuò)增裝置，其適用于由反應(yīng)管下方射入激發(fā)光束，在反應(yīng)管側(cè)面由檢測(cè)器收光。
19.權(quán)利要求12的核酸擴(kuò)增裝置，其適用于由反應(yīng)管上方射入激發(fā)光束，在反應(yīng)管上方由檢測(cè)器收光。
20.權(quán)利要求12的核酸擴(kuò)增裝置，其適用于由反應(yīng)管下方射入激發(fā)光束，在反應(yīng)管下方由檢測(cè)器收光。
21.權(quán)利要求12的核酸擴(kuò)增裝置，其適用于由反應(yīng)管側(cè)面射入激發(fā)光束，在反應(yīng)管側(cè)面由檢測(cè)器 收光。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在恒溫?zé)嵩聪逻M(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及裝置。更具體地，首先，本發(fā)明涉及基于Rayleigh-Benard(雷諾本納德)原理，對(duì)反應(yīng)試管特定區(qū)域提供或移走熱量，以建立反應(yīng)管內(nèi)試劑自下而上的溫度梯度，在反應(yīng)試劑不均勻受熱下自發(fā)進(jìn)行對(duì)流，并在流經(jīng)不同溫度區(qū)域時(shí)發(fā)生相應(yīng)PCR擴(kuò)增的方法。本發(fā)明提供一種實(shí)現(xiàn)上述方法的反應(yīng)及實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)裝置。
文檔編號(hào)C12M1/00GK103173434SQ20111045681
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者葛勝祥, 周文彬, 張師音, 陳清瑞, 夏寧邵 申請(qǐng)人:廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司, 廈門大學(xué)