專利名稱：ERα36缺陷型SMMC-7721穩定轉染細胞株及其構建方法
技術領域：
本發明涉及到醫學分子生物學技術，具體是采用shRNA干擾技術構建ER α 36缺陷型SMMC-7721穩定轉染細胞株的方法，研究細胞模型。
背景技術：
Short Hairpin RNA (shRNA，翻譯為“短發夾RNA”)，包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環(loop)序列分隔的，組成發夾結構，由pol III啟動子控制，連上5-6個胸腺嘧啶T作為RNA聚合酶III的轉錄終止子。在活體中輸送“小干擾RNA” (siRNA)的一種辦法是，將siRNA序列作為“短發夾”克隆進質粒載體中。當送入動物體內時，該發夾序列被表達出來，形成一個“雙鏈RNA”(shRNA)，并被RNAi通道處理，之后結合到RNA誘導沉默復合物 (RNA-induced silencing complex, RISC)，這種復合物能夠結合并切割與siRNA序列相匹配的mRNA上，導致mRNA無法翻譯成相應蛋白質，最終沉默細胞中相應蛋白的表達。shRNA 整合入真核生物載體，利用U6或Hl啟動子確保其在宿主細胞內高效表達。這種載體能夠整合入宿主細胞基因組中，并隨著細胞增殖能夠傳遞到子細胞中，因此，其基因沉默的能力得以延續。RNAi技術是近年來快速發展起來的一項基因沉默技術，即在生物體細胞內，外源性或內源性的雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引起同源mRNA特異性降解，從而抑制目的基因表達的技術。它的出現為分析基因功能和信號傳導通路以及基因治療方面都提供了一種新的研究手段。與傳統的反義核酸、基因剔除等技術相比，具有特異性強、針對性強、級聯放大等優點。

發明內容
鑒于國內外缺乏ERa 36缺陷型的人腫瘤細胞株及其相關研究的報道，本申請應用shRNA系統沉默人肝癌SMMC-7721細胞內源性ERa 36的表達，構建了 ERa 36缺陷型 SMMC-7721穩定轉染細胞株SMMC-7721/Sh36，并對其功能進行了研究。這一細胞模型可用于研究ERa 36與肝癌的相關性及其機理；也可以用于研究雌激素在肝癌細胞中的信號傳導通路；還可以作為研究雌激素的膜受體信號通路的細胞模型。本發明所述的的SMMC-7721細胞株購于中科院上海細胞所，它是人類原發性肝癌細胞，貼壁生長。本發明所述的ER a 36缺陷型SMMC-7721穩定轉染細胞株SMMC_7721/ai36的獲得過程包括，將SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核苷酸序列片段，插入攜帶GFP綠色熒光表達基因的pRNAT-U6. Ι/Neo表達載體，再將重組質粒轉入SMMC-7721細胞株，在SMMC-7721細胞中表達shRNA，經陽性細胞克隆篩選到SMMC-7721/ai36細胞株，使得siRNA靶向沉默了內源性ERa 36的表達量30%以上，且95%以上的細胞表達綠色熒光蛋白的穩定轉染細胞。本發明所述的ERa 36缺陷型SMMC-7721穩定轉染細胞株的構建方法由以下步驟組成
一、shRNA序列、DNA模板的設計與合成的思路針對ER- α 36mRNA 5，-CGAAGGGAAGTATGGCTATGGAATCC-3，為目標設計 shRNA，再分別合成兩條互補并含siRNA的正義鏈和反義鏈的DNA模板，中間以10個脫氧核苷酸的Loop 結構相連，后接RNA PloyIII轉錄終止位點，并在兩端引入BamH I和HindIII酶切位點。綜上，設計了對應ER-α36 基因的 shRNA DNA模板為SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO 2，送大連寶生物公司合成引物序列。本發明的一方面在于ERa 36缺陷型SMMC-7721穩定轉染細胞株的構建方法，其包括如下步驟(a)設計對應ER- α 36基因的shRNA的兩條單鏈DNA模板，其堿基序列為SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO 2 ；(b)構建含有上述堿基序列 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 的 pRNAT_U6. 1/Neo 重組質粒；(c)利用如步驟(b)獲得的重組質粒轉染宿主細胞SMMC-7721得到的重組細胞株；(d)將步驟(c)所得重組細胞株經過G418篩選培養基培養，每3 5天更換一次篩選培養基，篩選10 14天，獲得陽性克隆細胞株；其中，所述的G418篩選培養基為15% 新牛血清的RPMI-1640培養基中，加入G418使其終濃度為500ug/mL ；(e)將步驟(d)篩選所得的陽性克隆細胞株利用Western Blotting方法，和/或細胞計數法，和/或軟瓊脂糖集落形成實驗法檢測。上述構建方法中，其步驟(b)所述的構建方法包括如下步驟(f)取SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2兩條單鏈DNA模板等濃度混勻后，經95°C加熱lOmin，室溫靜置lh，稀釋至終濃度lOng/ul ；(g)用T4DNA連接酶將步驟(f)所得產物與BamH I和HindIII酶切后的線性化載體 pRNAT-U6. Ι/Neo 在 22°C連接 2h ；(h)將步驟(g)獲得的連接產物轉化感受態E. coli DH5a后，經細胞培養、提取質粒、測序鑒定結果如SEQ ID NO :3。本發明的另一方面在于上述構建方法所獲得的ER a 36缺陷型SMMC-7721穩定轉染的細胞株。有益效果本申請構建的ERa 36缺陷型SMMC-7721細胞與現有的技術的區別為ERa 36缺陷的人肝癌細胞，由于ERa 36本身是新近才發現克隆的，而且，肝臟不是雌激素靶器官，然而研究發現，肝癌卻是雌激素依賴性腫瘤，因此，本申請構建的ERa 36 缺陷型SMMC-7721細胞株是全新的。并且，其構建的方法也不同于現有技術。本申請所用到的shRNA具有以下特點1.克隆到shRNA表達載體中的shRNA包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環 (loop)序列分隔的，組成發夾結構，由pol III啟動子控制；2.兩個互補的寡核苷酸兩端帶有HindIII及BamH I限制性酶切位點；3.已有研究發現，四個寡核苷酸較之原先推薦的23個寡核苷酸可以更有效地抑制目的基因；
4.在啟動子下游的酶切位點下方緊連一個C，使插入片段和啟動子有一定空間間隔以確保轉錄的發生；5. ShRNA目的序列的第一個堿基是G，確保RNA聚合酶轉錄；6. shRNA插入片段中的莖環靠近寡核苷酸的中央；7.通過添加6個T在shRNA插入片段尾部以確保RNA聚合酶III終止轉錄。8.在正義鏈和反義鏈序列上沒有出現連續3個或以上的T，否則可能導致shRNA 轉錄的提前終止；9. SV40啟動子啟動新霉素抗性基因表達可用G418篩選，可用以建立穩定轉染細胞系；10.用CMV啟動子啟動綠色熒光蛋白GFP的表達，因此可直接通過熒光顯微鏡快速準確的追蹤轉染效率。


圖 1 為 shRNA-pRNAT_U6. 1/Neo 表達載體構建圖；圖2為質粒酶切鑒定圖；其中，圖中M為DNA分子量標準品，control為空質粒組， 將條帶位置的膠切下后回收DNA片段，送去寶生物測序，測序結果與預先設計的序列相吻
I=I ο圖3為SMMC-7721與SMMC_7721/Sh36細胞在光鏡下形態圖(IOX)；圖4為轉染48h的熒光照片(40X)；其中，圖中在熒光顯微鏡下顯示熒光的細胞， 證明了細胞轉染成功。圖5為轉入ERa36 shRNA后，Western blot檢測ER a 36及其同源亞型ER a 66蛋白的表達；其中，圖中7721為未轉染的SMMC-7721細胞，7721/V為轉染空質粒的SMMC-7721 細胞，7721/ ι36為轉染ER a 36低表達質粒的SMMC-7721細胞，β-Actin為細胞骨架蛋白， 在細胞內表達量相對一致，用作內參蛋白。如圖所示，7721/證36組ER a 36蛋白表達量顯著低于其它兩組，證明所構建的ERa 36低表達細胞系符合預先設計。圖6為GEL-pro Analyzer 4. 0對膠片中ERα 36蛋白條帶灰度值的掃描定量值； 其中，圖中，每組的掃描數值與所對應的β-Actin掃描數值相比，然后每組相互比較得出百分數值，用柱狀圖對其量化描述，如圖所示，證明了 7721/Sh36組ER α 36蛋白表達量顯著降低。圖7為GEL-pro Analyzer對膠片中ERa 66蛋白條帶灰度值的掃描定量值；其中， 圖中，每組的掃描數值與所對應的β-Actin掃描數值相比，然后每組相互比較得出百分數值，用柱狀圖對其量化描述，如圖所示，證明了 7721/a136組ERα66蛋白表達量無顯著變化。圖8為SMMC-7721與SMMC_7721/ai36細胞增殖曲線；其中，圖中7721細胞在第二天便進入對數增長期，且細胞增殖速度較快，第四天進入平臺期，滯留時間較短，第五天便進入凋亡期；而7721/Sh36細胞第三天進入對數生長期，第五天左右進入平臺期，且滯留時間較長，第7天后才進入凋亡期。證明了 ERa 36表達降低后細胞接觸抑制作用減弱，對惡劣環境的適應能力增強。圖9為SMMC-7721與SMMC_7721/ai36細胞單細胞克隆形成實驗；其中，圖中7721/V為轉染空質粒SMMC-7721，7721/Sh36為轉染ERa 36低表達質粒的SMMC-7721細胞，證明了 ERa 36表達降低后，細胞克隆形成能力增強了，細胞可以擺脫貼壁后才能增殖的束縛。SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2是ER- a 36基因的shRNA DNA模板，送大連寶生物公司合成。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明，本實施例中涉及到使用產品試劑盒的操作，均按照試劑盒說明書的步驟完成。pRNAT-U6. Ι/Neo 購自 GeMcript，貨號SD1211 ；TIANgel Midi普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒公司天根生化科技有限公司；商品貨號:DP209-02 ；感受態 E. coli DH5a TaKaRa Code :D9057 ；新生牛血清購自Gibco ，商品貨號16010-142 ；SOC培養基S0C培養基組份濃度20g/L胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母膏 (YeastExtract) ,0. 5g/L NaCl, 2. 5mM KCl，IOmM Mg2+, 20mM 葡萄糖(glucose)，定容至 IOOml0配制方法①配制IM的葡萄糖溶液將18g的葡萄糖溶解在90ml的去離子水中，定容至100ml，用0.22 μ m濾膜過濾除菌；②向100ml SOB培養基中加入除菌的IM葡萄糖溶液anl，均勻混合；③4°C保存。LB液體培養基配制每升培養基，在950ml去離子水中加入胰化蛋白胨IOg ；酵母提取物5g;NaCl IOg ；搖動容器直至溶質溶解。用5mol/LNa0H調pH至7.0.用去離子水定容至1L。在15psi高壓下蒸汽滅菌20min。Amp 氨芐西林，Ampicillin 的縮寫；LB固體培養基配制方法同LB液體培養基，100ml LB液體培養基再加入1. 5g瓊脂粉。Lipofectamine 2000 轉染試劑盒購自 hvitrogen，商品貨號11668_019。Opti-MEM I Reduced Serum Medium:購自 hvitrogen，商品貨號51985_091。RPMI-1640培養基購自Gibco ，商品貨號31800-014 ；配制方法一袋培養基 (10. 4g)溶于IL雙蒸水，加入碳酸氫鈉2克，溶解，過濾，4度保存。G418 購自 AMRESC0 公司，商品貨號E859。G418篩選培養基15 %新牛血清(購自Gibco ，商品貨號16010-142)的 RPMI-1640培養基中，加入G418使其終濃度為500ug/mL。2 X細胞培養基RPMI-1640培養基粉末(10. 4g)溶于500mL雙蒸水中，過濾。BCA蛋白定量試劑盒購自GENERAY公司，商品貨號GK5011?？雇玫腅Ra 36多克隆抗體美國Creighton大學王兆一博士惠贈?？故蟮摩?-actin單克隆抗體購自北京中杉金橋生物公司，商品編號TA_09。羊抗兔IgG-HRP 購自北京中杉金橋生物公司，商品編號ZDR_5209。羊抗鼠IgG-HRP 購自北京中杉金橋生物公司，商品編號ZDR_5210。低熔點瓊脂糖購自Upstate Biotechnology。
SMMC-7721 人類原發性肝癌SMMC-7721細胞系，以下縮寫成SMMC-7721，在附圖中縮寫成7721表示。SMMC-7721/Sh36 是轉染質粒 ER α 36 pRNAT_U6. 1/Neo 的 SMMC-7721 細胞，其構建過程如實施例1所述，在附圖中縮寫成7721/證36表示。SMMC-7721/V 是轉染空質粒即pRNAT_U6. 1/Neo的SMMC-7721細胞，其構建過程如實施例1所述，在附圖中縮寫成7721/V表示。實施例1細胞株SMMC_7721/ai36的獲得ERa 36-shRNA質粒由美國Creighton大學醫學研究中心王兆一博士饋贈，它是通過克隆DNA寡核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的基因，并將其重組于pRNAT_U6. 1/ Neo載體，從而構建成的特異性的ERa 36-shRNA。 (1) shRNA序列、DNA模板的合成對應ER- a 36 基因的 shRNA DNA 模板為SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2,人工合成此序列。(2)構建 ER- a 36 shRNA 表達載體ER-a 36 shRNA表達載體的構建示意圖，如圖1。取SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO: 2兩條單鏈DNA模板各lug/ul，混勻，95°C加熱lOmin，室溫靜置lh，稀釋至終濃度lOng/ul 待用，用T4DNA連接酶與BamH I和HindIII酶切后的線性化載體pRNAT_U6. 1/Neo在22°C 連接2h;獲得連接產物。其中，IXT4 DNA連接酶緩沖液50mM Tris-HCl (pH 7.5，25°C)， IOmM MgCl2, IOmM 二硫蘇糖醇(DTT)，ImM ATP。連接反應體系含有線性化載體pRNAT-U6.1/Neo DNA模板 T4 DNA連接酶 IXT4DNA連接酶緩沖液
0.5ul
補充終體積為10uL。
O.lug Iul(3)轉化取步驟⑵的5ul連接產物，轉化IOOuL感受態E. coli DH5 α，緩慢混勻，冰浴 30min，42°C水浴90秒，冰浴2min，加入900ul的SOC培養基，37°C下150轉/min搖床培養 Ih ；收集菌液，分IOOul和900ul涂布加入100ug/ml Amp的LB固體培養基，37°C過夜培養。(4)鑒定挑斑點最大的兩個單菌落，接種到50ml LB液體培養基(含100 μ g/ml Amp)中， 37°C振蕩培養約12h，至對數生長后期。收集過夜培養的菌種，按照質粒提取試劑盒說明書(上海萊楓生物科技有限公司，商品貨號DK302-01)提取質粒DNA ；將提取的質粒溶于20 μ 1 TE緩沖液(ρΗ8. 0) 中，-20°C儲存。用紫外分光光度計檢測其濃度，濃度為2 μ g/μ 1。將提取的質粒DNA，取1 μ g進行酶切鑒定酶切鑒定反應體系如下，反應溫度37°C，反應時間1 ；獲得酶切產物。限制性內切酶HindIIIΙμ
限制性內切酶BamH IΙμ
酶解緩沖液(IOxHbuffer)2μ1
提取的質粒DNAIpg
ddH2015μ1取酶切產物10 μ 1，用凝膠電泳鑒定酶切后產物，結果如圖2，得到分子量 6500bp左右，將片段切下，經TIANgel Midi普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收DNA片段， 送去大連寶生物公司測序，測序結果如SEQ ID NO :3與質粒設計圖譜相吻合，證明最終獲得質粒 ERa 36 pRNAT-U6. 1/Neo。(5)轉染參照Lipofectamine 2000轉染試劑盒的說明，轉染前Mh，于6孔板中，每孔接種 SMMC-7721細胞6X IO5個，培養基為15%新生牛血清的RPMI-1640培養基，最終使接種濃度達到90%。轉染前將6孔板中的培養基換成無血清無抗生素的RPMI-1640培養基備用。將4 μ g步驟(4)所獲的ER a 36 pRNAT_U6. 1/Neo質粒DNA溶于250 μ 1無血清的
Opti-MEM I Reduced Serum Medium 中，混合均勻。將 10 μ 1 Lipofectmine 2000 溶于
250μ 1無血清的Opti-MEM I Reduced Serum Medium中，室溫充分混勻5min。將溶解充分的 ERa 36pRNAT-U6. 1/Neo 質粒 DNA 和 Lipofectmine 2000 混合，室溫孵育 20min，獲得混合轉染液。向上述6孔板中，每孔加入500 μ 1的混合轉染液，前后振蕩混勻。將6孔板放于 37 °C的CO2培養箱培養。(6)G418篩選陽性克隆上述6孔板培養4 后，將培養基吸除，加入G418終濃度為500ug/ml的RPMI-1640 培養基Iml進行陽性篩選，每3 5天更換一次篩選培養基，篩選1周。同時設置SMMC-7721 為對照組，進行觀察。結果如圖3，ERa 36低表達細胞系SMMC_7721/a!36具有貼壁能力增強，貼壁后細胞突出的分支較多，分散較為整齊，顯微鏡下觀察細胞較透亮等特點。在終濃度500ug/ml的G418篩選濃度下，篩選10 14天后，可見有抗性的克隆出現，熒光顯微鏡觀察GFP表達，如圖4。將上述有抗性的克隆，為防止抗性丟失，繼續在G418濃度減為400ug/ml的篩選培養基中進行維持篩選，培養3 4周，用肉眼即可看見明顯克隆，最終獲得ER a 36穩定低表達的混合克隆ERa 36穩定敲低的肝癌細胞株SMMC-7721細胞，命名為SMMC_7721/ai36。SMMC-7721/V 細胞的構建參照Lipofectamine 2000轉染試劑盒的說明，轉染前Mh，于6孔板中，每孔接種 SMMC-7721細胞6X IO5個，培養基為15%新生牛血清的RPMI-1640培養基，最終使接種濃度達到90%。轉染前將6孔板中的培養基換成無血清無抗生素的RPMI-1640培養基備用。 將 4ug pRNAT-U6. 1/Neo 空質粒載體溶于 250 μ 1 無血清的Opti-MEM I Reduced Serum Medium 中，混合均勻。將 10 μ 1 Lipofectmine 2000 溶于 250 μ 1 無血清的Opti-MEM I Reduced SerumMedium中，室溫充分混勻5min。將溶解充分的pRNAT_U6. 1/Neo空質粒載體和LipOfectmineTM2000混合，室溫孵育20min，獲得混合轉染液。向上述6孔板中，每孔加入500 μ 1的混合轉染液，前后振蕩混勻。將6孔板放于 37°C的CO2培養箱培養。篩選步驟同上。實施例2 shRNA干擾效率檢測及ER α 36活性測定(7) Western Blotting 檢測 ER α 36 蛋白的表達單克隆鑒定細胞大量擴增后，利用Western Blot方法檢測轉染后細胞中ERa 36 蛋白的表達水平。分別抽提SMMC-7721/Sh36 和 SMMC-7721 以及 SMMC-7721/V 細胞的總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒測定總蛋白。50ug總蛋白經10% SDS-PAGE膠在60V恒流電壓下分離1. 5h ；將 SDS-PAGE中的蛋白轉移至PVDF膜上，60V恒流電壓轉移45min，5%脫脂奶粉中封閉lh，分別與抗兔的ER α 36多克隆抗體和抗鼠的β-actin單克隆抗體在4°C環境下過夜孵育，再與 Horseradish Peroxidase(HRP)標記的二抗作用 2h 之后，通過 ECL (美國 GE Healthcare 公司，商品貨號為RPN2109)化學發光和X光膠片曝光，其結果見圖5。如圖5所示，蛋白條帶從左至右分別是SMMC-7721細胞樣品，SMMC-7721/V細胞樣品，SMMC_7721/ai36細胞樣品中ERa36、ERa66以及內參β-actin蛋白的表達量。具體實施方法為SDS_APGE后，轉膜一次，分別雜交三種蛋白的第一抗體與第二抗體(步驟方法如上所述)。ERa 36是ERa 66的一種亞型，二者同屬于核受體超家族中的一員。本申請所構建的細胞系SMMC-7721/ai36專一性敲低ERa 36蛋白的表達量，而對ER a 66蛋白表達量無顯著性影響，使用Gel-Pro Analyzer 4. 0軟件對蛋白條帶灰度值掃描定量，定量結果見圖6、 7，結果表明 SMMC-7721 以及 SMMC-7721/V 的 ER α 36 表達量分別為 49. 7 士 8. 4 和 40. 2 士 5. 6 ； SMMC-7721/Sh36 細胞則為 21. 9士5. 3，是 SMMC-7721 細胞的 44% 以及 SMMC-7721/V 細胞的
，所以shRNA的干擾效率為56% (P < 0. 01)。(8) SMMC-7721/Sh36穩定轉染細胞株的功能檢測細胞計數法測定SMMC-7721和SMMC-7721/ai36細胞的生長曲線。分別接種對數生長期的SMMC-7721和SMMC-7721/Sh36細胞2X IO4個/孔于24孔板中，平行3個孔，每天同一時間平行操作，用0. 5%胰酶消化，血球計數儀中置于倒置顯微鏡下計數，共計8天。 結果顯示兩組細胞的對數生長期均為接種后的第三天。但SMMC-7721/a!36細胞倍增時間延長，然而，平臺期維持的時間較長，說明細胞間接觸抑制作用減弱，大量細胞能彼此接觸并能持續生長較長時間。SMMC-7721細胞在第五天(對數生長期后第二天)便進入凋亡期， 然而SMMC-7721/a!36細胞在培養至第七天時才進入凋亡期，如圖8。(9)軟瓊脂糖集落形成實驗測定單細胞的增殖能力檢測將1. 2%低熔點瓊脂糖與2X細胞培養基以1 1的體積比混合制備0. 6%的底層瓊脂，6孔板中每個孔1. 4ml溫室凝固，取對數生長期的SMMC-7721和SMMC_7721/ai36細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數，并分別調細胞濃度為10000個/ml，將0. 6 %低熔點瓊脂糖與2X細胞培養基以1 1的體積比混合，制備0. 3%的上層瓊脂，每孔加Iml 上層瓊脂和IOOul單細胞懸液(約1000細胞/孔)，混勻，室溫凝固。置于37°C ,5% CO2的細胞培養箱中培養2 3周，計數含50個細胞以上的克隆，計算細胞集落形成率，如圖9。 結果SMMC-7721/Sh36細胞集落形成數量為20 士 13，顯著高于SMMC-7721細胞0. 7 士 1. 2(P < 0. 01)。
綜上所述本發明所構建的SMMC_7721/ai36細胞株，95%以上的細胞表達綠色熒光蛋白， 經shRNA靶向沉默了內源性ER α 36的表達量56%，即ER α 36的量僅為SMMC-7721細胞的 44%。與SMMC-7721/V細胞相比，細胞倍增時間延長，然而細胞間接觸抑制作用減弱；克隆形成率升高，凋亡細胞數減少，提示沉默ERa 36的表達可增強原發性肝細胞癌的增殖侵襲能力。本申請所構建的SMMC_7721/ai36細胞系可廣泛應用于研究ERa 36對肝癌細胞生物學行為的影響及其機制也可用于觀察內源性ERa 36敲低后，細胞生長狀況及其功能的改變，探討ERa 36在肝癌細胞生長、增殖、分化及轉移中的作用及其機理。
權利要求
1.ER α 36缺陷型SMMC-7721穩定轉染細胞株的構建方法，其特征在于，包括如下步驟(a)設計對應ER-α 36基因的shRNA的兩條單鏈DNA模板，其堿基序列為SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO 2 ；(b)構建含有上述堿基序列SEQID NO 1和SEQ ID NO 2的pRNAT_U6. 1/Neo重組質粒；(c)利用如步驟(b)獲得的重組質粒轉染宿主細胞SMMC-7721得到的重組細胞株；(d)將步驟(c)所得重組細胞株經過G418篩選培養基培養，每3 5天更換一次篩選培養基，篩選10 14天，獲得陽性克隆細胞株；其中，所述的G418篩選培養基為15%新牛血清的RPMI-1640培養基中，加入G418使其終濃度為500ug/mL ；(e)將步驟(d)篩選所得的陽性克隆細胞株利用WesternBlotting方法，和/或細胞計數法，和/或軟瓊脂糖集落形成實驗法檢測。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(b)所述的構建方法包括如下步驟(f)取SEQID NO :1和SEQ ID NO :2兩條單鏈DNA模板等濃度混勻后，經95°C加熱 lOmin，室溫靜置lh，稀釋至終濃度lOng/ul ；(g)用T4DNA連接酶將步驟(f)所得產物與BamHI和HindIII酶切后的線性化載體 PRNAT-U6. Ι/Neo 在 22°C連接 2h ；(h)將步驟(g)獲得的連接產物轉化感受態E.coli DH5a后，經細胞培養、提取質粒、 測序鑒定結果如SEQ ID NO :3ο
3.如權利要求1或2所述的構建方法所獲得的ERa36缺陷型SMMC-7721穩定轉染的細胞株。
全文摘要
本發明公開了一種ERα36缺陷型SMMC-7721穩定轉染細胞株的構建方法，具體是將SEQID NO1和SEQ ID NO2的核苷酸序列片段，插入含GFP綠色熒光的pRNAT-U6.1/Neo表達載體，再轉入SMMC-7721細胞株，在SMMC-7721細胞中表達shRNA，經陽性細胞克隆篩選后，得到SMMC-7721/Sh36細胞株，使得siRNA靶向沉默了內源性ERα36的表達量30％以上，且95％以上的細胞表達綠色熒光蛋白的穩定轉染細胞。這一細胞模型可用于研究ERα36與肝癌的相關性及其機理；也可用于研究雌激素在肝癌細胞中的信號傳導通路；及作為研究雌激素的膜受體信號通路的細胞模型。
文檔編號C12N5/10GK102559679SQ201110455979
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者崔風宮, 張媛, 方晨, 鄒偉 申請人:遼寧師范大學