專利名稱：一種ERα36敲低PC12細胞株及其構建方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種ERa 36敲低PC12細胞株及其構建方法。
背景技術：
雌激素(estrogen，Ε)在生物體內具有廣泛的生物學活性，不但對眾多靶組織如生殖道、乳腺、骨骼及心血管系統有調節作用，還可作用于與認知功能相關的神經回路，參與5-羥色胺、多巴胺、谷氨酸、GABA和乙酰膽堿等神經遞質和多種神經肽活動的調節，影響突觸可塑性和學習記憶。同時，雌激素在神經細胞的分化和發育、神經元存活和軸突生長的誘導以及新生神經元的形成等諸多過程中也發揮重要作用。阿爾茲海默病(Alzheimer’ s disease,AD)是一種嚴重威脅老年人身體健康的神經退行性疾病。已知雌激素替代療法能夠改善腦功能的退化，降低絕經期后女性AD發病率，而生理水平的雌激素可減少伴隨AD產生的神經毒性蛋白。雌激素替代(HT)能改善絕經期后女性學習記憶等腦功能，但同時又具有誘發子宮內膜癌和乳腺癌的封信啊。雌激素拮抗劑可作為乳腺癌術后復發防止藥物，但同時也可減弱患者的記憶功能。雌激素受體(estrogen receptor, ER)是類固醇激素受體超家族的成員之一，能夠與雌激素特異性結合，通過基因組作用模式調控靶基因的轉錄或激活細胞內信號，改變胞內蛋白功能和調控基因表達。雌激素受體主要分為ERa和ERi3兩種類型。近年來，隨著研究的不斷深入，又陸續發現新的ER α受體亞型。目前，ER α分為ER α 66、ER α 46、ER α 36 三種亞型。其中，ERa 36是由Wang等在2005年克隆并鑒定出的一種新型雌激素α受體。 研究發現，在乳腺癌、子宮內膜癌、結腸癌等組織中，均有ERa 36的表達，并參與腫瘤細胞的生長、增殖、分化等病理過程。但ER α 36在神經系統中的表達及其功能還未見報道。shRNA是short hairpin RNA的縮寫。翻譯為“短發夾RNA”。shRNA包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環(loop)序列分隔的，組成發夾結構，由pol III啟動子控制。隨后在連上5 6個T作為RNA聚合酶III的轉錄終止子。在活體中輸送“小干擾RNA”(siRNA) 的一種辦法是，將siRNA序列作為“短發夾”克隆進質粒載體中。當送入動物體內時，該發夾序列被表達出來，形成一個“雙鏈RNA”(shRNA)，并被RNAi通道處理。PC12細胞株(pheochromocytoma cell line，PC12)源于大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤克隆化的細胞株，神經嵴源性，有較典型的神經內分泌細胞特性，胞膜上有膽堿能M和 N受體等，常作為多巴胺能神經元的細胞模型。通常，它們在含血清的培養基中可增殖，呈現未分化狀態，而在加入NGF后細胞分化為交感神經元的形態。同時研究還發現，神經元樣的 PC12細胞可以發生增殖，因此，常被用作研究神經細胞分化的體外細胞模型。目前對于ERa 36的研究主要集中在乳腺癌、子宮內膜癌、結腸癌等組織或細胞中，對于其在神經系統中的表達及功能的研究還未見報道。雌激素的這種誘發乳腺癌和神經保護的雙刃劍作用是否可以通過ERa 36來調節，還值得我們進一步研究。因此，我們利用ER α 36-shRNA轉染PC12細胞建立ER α 36敲低的PC12細胞模型，為探討ER α 36在中樞神經系統中的作用提供可行的細胞材料。

發明內容
本發明為ERa 36敲低的PC12細胞系的建立，通過應用siRNA技術，利用 ER α 36-shRNA轉染PC12細胞，建立ER α 36敲低的PC12細胞株，再利用免疫細胞熒光、免疫細胞化學和Western blot技術對細胞株進行檢測，證明細胞株建立成功。本發明通過下述技術方案實現本發明的一方面在于提供一種ERa 36敲低PC12細胞株的構建方法，其包括如下步驟(a)構建含有堿基序列 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 的 pRNAT_U6. 1/Neo 重組質粒；(b)利用如步驟(a)獲得的重組質粒轉染宿主細胞PC12得到重組細胞株；(c)將步驟(b)所得重組細胞株經過G418篩選培養基培養，每3 5天更換一次篩選培養基，篩選10 14天，獲得陽性細胞株；其中，所述的G418篩選培養基為15%新牛血清的RPMI-1640培養基中，加入G418使其終濃度為500ug/mL ；(d)在15% NCS的RPMI1640培養基中加入G418的終濃度為250 μ g/mL，在37°C 的5% CO2培養箱中維持篩選，每3 5天更換上述培養基；(e)將步驟(d)篩選所得的陽性細胞株利用免疫細胞熒光、Western Blot方法、免疫細胞化學法檢測ERa 36的表達；其檢測結果為與PC12細胞株相比，陽性細胞株中有98%以上的細胞表達綠色熒光蛋白，陽性細胞株中ERa 36的表達量為PC12細胞的47%。具體的，在上述的構建方法中，步驟(a)所述的構建方法包括如下步驟(f)取SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2兩條單鏈DNA模板等濃度混勻后，經95°C加熱lOmin，室溫靜置lh，稀釋至終濃度lOng/ul ；(g)用T4DNA連接酶將步驟(f)所得產物與BamH I和HindIII酶切后的線性化載體 pRNAT-U6. Ι/Neo 在 22°C連接 2h ；(h)將步驟(g)獲得的連接產物轉化感受態E. coli DH5a后，經細胞培養、提取質粒、測序鑒定結果如SEQ ID NO :3。本發明的另外一方面在于通過上述的構建方法所獲得的ERa 36敲低PC12細胞株。ER a 36敲低的PC12細胞系的建立，為研究ERa 36在中樞神經系統中作用提供了有力的實驗材料。


圖1 :ER a 36-shRNA表達載體的構建示意圖；圖 2 :pRNAT-U6. 1/Neo 質粒DNA 的酶切鑒定；其中，HindIII 代表HindIII marker, DL2000代表DL2000marker, ShRNA代表經過雙酶切的ERa 36-shRNA質粒；圖3 為建立ERa 36敲低的PC12細胞株；其中，PC12代表PC12細胞株，PC12-36L 代表轉染了 ERa 36-shRNA質粒的PC12細胞株，PC12-36C代表轉染了 pRNAT_U6. 1/Neo質粒的PC12細胞株；圖4:Western blot法對細胞株中ERa 36進行檢測；其中，PC12代表PC12細胞株，PC12-36L代表轉染了 ERa 36-shRNA質粒的PC12細胞株；圖5:不同ERa 36表達的PC12細胞株的生長曲線圖(*p < 0. 05，、< 0. 01)； 其中，PC12代表PC12細胞株，PC12-36L代表轉染了 ERa 36-shRNA質粒的PC12細胞株， PC12-36C代表轉染了 pRNAT-U6. Ι/Neo質粒的PC12細胞株。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。pRNAT-U6. Ι/Neo 購自 GeMcript，SD1211 ；感受態 E. coli DH5a TaKaRa Code :D9057 ；SOC培養基S0C培養基組份濃度20g/L胰蛋白胨(Tryptone)，5g/L酵母膏 (Yeast Extract) ,0. 5g/L NaCl,2. 5mM KCl, IOmM Mg2+，20mM 葡萄糖(glucose)，定容至 IOOml0配制方法①配制IM的葡萄糖溶液將18g的葡萄糖溶解在90ml的去離子水中，定容至100ml，用0.22 μ m濾膜過濾除菌；②向100ml SOB培養基中加入除菌的IM葡萄糖溶液anl，均勻混合；③4°C保存。LB液體培養基配制每升培養基，在950ml去離子水中加入胰化蛋白胨IOg ；酵母提取物5g ；NaCl IOg ；搖動容器直至溶質溶解。用5mol/LNa0H調pH至7. 0，用去離子水定容至1L。在15psi高壓下蒸汽滅菌20min ；LB固體培養基配制方法同LB液體培養基，100ml LB液體培養基再加入1. 5g瓊脂粉；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒天跟生化科技有限公司，DP209-02 ；PC12細胞株大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞，購自上海細胞所；6孔培養板購自美國Corning公司，3516 ；無血清無抗生素的RPMI1640培養基購自美國Gibco公司，31800022 ；Opti-MEM 購自美國 hvitrogen 公司，31985-062 ；Lipofectamine 2000 轉染試劑盒購自 hvitrogen，11668-019 ；新生牛血清(NCS)購自美國Gibco公司，16010059 ；G418 購自美國 Amresco 公司，E859 ；胰酶購自美國Amresco公司，0458_25g ；兔Mi^ptavidin-HRP試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，CffOl 18 ；濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，ZLI-9031 ；GFP抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，TA-06 ；羊抗兔IgG-HRP 購自北京中杉金橋生物技術有限公司，ZDR-5209 ；羊抗鼠IgG-HRP 購自北京中杉金橋生物技術有限公司，ZDR-5210 ；ERa 36抗體由美國Creighton大學醫學研究中心王兆一博士饋贈；β -actin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，BM0627。實施例1.質粒ER α 36-shRNA的獲得CN 102533765 A
質粒ER α 36-shRNA由美國Creighton大學醫學研究中心王兆一博士饋贈，它是通過克隆DNA寡核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的基因，并將其重組于pRNAT_U6. 1/ Neo載體，從而構建成的特異性的ERa 36-shRNA。 (1) shRNA序列、DNA模板的合成對應ER a 36基因的shRNA DNA模板為SEQ ID NO :1, SEQ ID NO 2并人工合成序列。(2)構建 ER a 36-shRNA 表達載體ERa 36-shRNA 表達載體的構建示意圖，如圖 1。取 SEQ ID N0:liPSEQ ID NO 2 兩條單鏈DNA模板各lug/ul，混勻，95°C加熱lOmin，室溫靜置lh，稀釋至終濃度lOng/ul待用，用T4DNA連接酶與BamH I和HindIII酶切后的線性化載體pRNAT_U6. 1/Neo在22°C連接池；獲得連接產物。連接反應體系含有
線性化載體 pRNAT-U6.1/Neo0. Iug
DNA模板Iul
T4 DNA 連接酶0.5ul
1 χ T4 DNA連接酶緩沖液補充終體積為10uL。(3)轉化取步驟⑵的5ul連接產物，轉化IOOuL感受態E. coli DH5 α，緩慢混勻，冰浴 30min，42°C水浴90秒，冰浴2min，加入900ul的SOC培養基，37°C下150轉/min搖床培養 Ih ；收集菌液，分IOOul和900ul涂布加入100ug/ml Amp的LB固體培養基，37°C過夜培養。(4)鑒定挑斑點最大的兩個單菌落，接種到50ml LB液體培養基(含100 μ g/ml Amp)中， 37°C振蕩培養約12h，至對數生長后期。收集過夜培養的菌種，按照質粒提取試劑盒說明書(上海萊楓生物科技有限公司，商品貨號DK302-01)提取質粒DNA ；將提取的質粒溶于20 μ 1 TE緩沖液(ρΗ8. 0) 中，-20°C儲存。用紫外分光光度計檢測其濃度，濃度為2 μ g/μ 1。將提取的質粒DNA，取1 μ g進行酶切鑒定酶切鑒定反應體系如下，反應溫度37°C，反應時間2h ；獲得酶切產物。
限制性內切酶HindIIIΙμ
限制性內切酶BamH IΙμ
酶解緩沖液(IOxHbuffer)2μ1
提取的質粒DNAIpg
ddH2015μ1取酶切產物10 μ 1，用凝膠電泳鑒定酶切后產物，結果如圖2，得到分子量 6500bp左右和IOObp左右，將IOObp片段切下，利用天跟生化科技有限公司普通瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒將DNA回收，送去大連寶生物公司測序，測序結果如SEQ ID NO 3與質粒設計圖譜相吻合，證明最終獲得陽性質粒，將其命名為質粒ERa 36-shRNA。實施例2.質粒ER α 36-shRNA轉染PC12細胞(1)轉染前于6孔板中接種細胞濃度為6 X IO5個/mL的PC12細胞，每孔2mL，放于37°C的5% CO2培養箱培養，24h后細胞貼壁濃度達到90%進行轉染；(2)轉染過程轉染方法見Lipofectamine 2000(美國hvitrogen公司)說明書。(a)將 20 μ L 的 Lipofectmine 2000 加入到 250 μ L 的 Opti-MEM 中，輕輕混勻，室溫靜置5min ；(b)將 2 μ L 濃度為 2 μ / μ L 的 ER α 36-shRNA 質粒與 250 μ L 的 Opti-MEM 輕輕混勻；(c)再將步驟(a)和(b)所得的混合液混勻，室溫靜置20min ；(d)將步驟(1)的6孔板中的培養基換成無血清無抗生素的RPMI1640培養基，每孑L 2mL ；(e)向步驟(d)的6孔板每孔中加入500 μ L步驟(c)所得的混合轉染液，前后振蕩混勻；(f)將6孔板放于37°C的5 % CO2培養箱，培養4小時后，將培養基更換為加有15 % NCS的RPMI1640培養基^iil，繼續在37°C的5% CO2培養箱培養48h。熒光顯微鏡下觀察 GFP表達。向PC12細胞中轉染空質粒的步驟同轉染過程(a)到(f)，區別在于步驟(b)所述質粒以pRNAT-U6. Ι/Neo代替ERα 36-shRNA，將獲得的陽性細胞株命名為PC12-36C。實施例3.陽性細胞株的篩選(1)向步驟(f)的6孔板每孔中加入終濃度500 μ g/mL的G418，進行陽性細胞株的篩選，每3 5天更換含終濃度500 μ g/mLG418和15%新生牛血清(NCS)的RPMI1640的篩選培養基，在37°C的5% CO2培養箱中培養10 14天；(2)挑取單克隆繼續在37°C的5%C02培養箱中培養3 4周；將獲得的陽性細胞株命名為PC12-36L ；(3)在15% NCS的RPMI1640培養基中加入G418的終濃度為250 μ g/mL，在37°C 的5% CO2培養箱中維持篩選，每3 5天更換上述培養基；實施例4.陽性細胞株的檢測1.免疫細胞熒光對細胞株中ERa 36進行檢測細胞熒光檢測由于轉染的質粒中帶有綠色熒光蛋白(GFP)基因，轉染成功后即可以在熒光顯微鏡下觀察到GFP。熒光顯微鏡下觀察PC12細胞、以及分別經pRNAT-U6. Ι/Neo質粒、ER a 36-shRNA質粒轉染的PC12細胞的情況，從圖3中可見，圖3㈧為PC12細胞，即對照組細胞沒有轉染質粒，因此沒有GFP表達；圖3(B)為成功轉染了空質粒載體PRNAT-U6. Ι/Neo的PC12細胞，發現轉染的細胞株中有GFP表達，熒光顯微鏡下呈現綠色熒光；圖3 (C)為轉染ER a 36-shRNA 質粒的PC12細胞，發現細胞株中有GFP表達，熒光顯微鏡下呈現綠色熒光，證明轉染成功。2.免疫細胞化學對細胞株中ER a 36進行檢測
接種對數生長期細胞(5xl04個/mL)于六孔板中，每孔^iil，細胞貼壁48h。4% 多聚甲醛固定爬片細胞，2 Mh內即可實驗。用IxPBST (T :曲拉通-100)漂洗爬片細胞3次，每次5min。PBS浸泡5min。按兔Sti^ptavidin-HRP試劑盒說明書操作，滴加兔 Mi^ptavidin-HRP試劑盒中的試劑1，內源性過氧化物酶封閉液，室溫孵育10min。PBS充分淋洗。滴加兔Mi^ptavidin-HRP試劑盒中的試劑2，正常羊血清封閉液，室溫孵育lOmin。 傾去封閉液，直接滴加一抗ER α 36(1 100)，濕盒37°C孵育池。PBS充分淋洗。滴加兔 Mi^ptavidin-HRP試劑盒中的試劑3，生物素標記羊抗兔二抗工作液，室溫孵育lOmin。PBS 充分淋洗。滴加兔Mi^ptavidin-HRP試劑盒中的試劑4，HRP標記的鏈霉親和素，室溫孵育lOmin。PBS充分淋洗。滴加DAB顯色工作液，顯色lOmin，自來水沖洗浮色。在避光處照相。利用免疫細胞化學檢測發現細胞呈免疫陽性反應并且有免疫陽性顆粒說明轉染成功，免疫組化檢測轉染后PC12細胞中ERa 36的表達，圖3 (D)為PC12細胞對照組，細胞中觀察到免疫陽性顆粒，證明存在ER α 36表達；圖3 (E)為PC12細胞空質粒載體，與對照組相比免疫陽性顆粒沒有明顯變化，證明轉染空質粒載體對ERa 36表達沒有影響；圖3(F)為 PC12細胞轉染質粒ERa 36-shRNA，發現ERa 36敲低后表達量明顯減少。3. Western blot技術對細胞株中ER a 36進行檢測利用Wfestern blot檢測發現有蛋白印跡的條帶，即為細胞株中存在ER a 36表達， 蛋白印跡的條帶變淡即為ERa 36敲低成功。不同組細胞分別用PBS沖洗兩次，加入細胞裂解液(1 X IO7個細胞/500 μ L)，得到細胞全蛋白，采用Bradford法測定全細胞蛋白質的濃度。10% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉lh，加入相應一抗ER α 36 (ER α 36抗體0. 33 μ L加入到 PBS-Tween-20 溶液 2mL 中)、β -actin ( β -actin 抗體 2 μ L 加入到 PBST 溶液 ^nL 中)4°C 孵育過夜，室溫PBST洗膜，與對應的辣根過氧化物酶標記的二抗檢測ER α 36需加羊抗兔 IgG-HRP (羊抗兔IgG-HRP 0. 6 μ L加入到PBST溶液6mL中)、檢測β -actin需加羊抗鼠 IgG-HRP (羊抗鼠IgG-HRPO. 6 μ L加入到PBST溶液6mL中)室溫孵育2h，PBST洗膜，ECL顯色，進行X光膠片感光，沖洗膠片。掃描儀和凝膠成像系統記錄相應條帶的透色光積分吸光度值。圖4為Wfestern blot檢測轉染后PC12細胞中ER α 36的表達，圖4 (A)為PC12細胞對照組，圖4(B)為PC12細胞轉染質粒ERa 36-shRNA，轉染組細胞中ERa 36的表達都明顯低于對照組，ER a 36的表達量為母細胞的47%。圖4 (C、D)為兩種細胞的β -actin，證明兩種細胞全蛋白加樣量一致。提示，ERα36敲低的PC12細胞株PC12-36L建立成功，可以用于其他實驗研究。4.不同ERa 36表達的PC12細胞株的生長曲線圖接種對數生長期細胞IX 1 個/11^于M孔細胞培養板中，利用RPMI1640+15% NCS培養基在37°C的5 % CO2培養箱中培養，每天對細胞進行計數，每次三個平行孔。每次先棄去培養基，用PBS緩沖液，以500 μ L/孔的量清洗細胞，再用500 μ L/孔的胰酶消化細胞，利用血球計數板對細胞進行計數，繪制生長曲線，如圖5。PC12-36C細胞與PC12細胞的生長曲線十分接近，并無特別明顯的增殖加快的跡象，而PC12-36L細胞的生長曲線明顯區別于PC12細胞，增殖速度加快。
5.不同ERa 36表達的PC12細胞倍增時間的比較對通過上述方法測得的細胞數量和繪制的細胞生長曲線進行計算，利用倍增時間公式=Td = TxigZzlg(NzX)計算，其中Td為倍增時間，T為所取的對數生長期的天數，Ntl為對數生長期首天的細胞數，N為對數生長期末天的細胞數。表1不同ERa 36表達的PC12細胞倍增時間的比較
權利要求
1.一種ERa 36敲低PC12細胞株的構建方法，其特征在于包括如下步驟(a)構建含有堿基序列SEQID NO 1和SEQ ID NO 2的pRNAT_U6. 1/Neo重組質粒；(b)利用如步驟(a)獲得的重組質粒轉染宿主細胞PC12得到重組細胞株；(c)將步驟(b)所得重組細胞株經過G418篩選培養基培養，每3 5天更換一次篩選培養基，篩選10 14天，獲得陽性細胞株；其中，所述的G418篩選培養基為15%新牛血清的RPMI-1640培養基中，加入G418使其終濃度為500ug/mL ；(d)在15%NCS的RPMI1640培養基中加入G418的終濃度為250 μ g/mL，在37°C的5% CO2培養箱中維持篩選，每3 5天更換上述培養基；(e)將步驟(d)篩選所得的陽性細胞株利用免疫細胞熒光、WesternBlot方法、免疫細胞化學法檢測ER α 36的表達；其檢測結果為與PC12細胞株相比，陽性細胞株中有98%以上的細胞表達綠色熒光蛋白，陽性細胞株中ERa 36的表達量為PC12細胞的47%。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(a)所述的構建方法包括如下步驟(f)取SEQID NO :1和SEQ ID NO :2兩條單鏈DNA模板等濃度混勻后，經95°C加熱 lOmin，室溫靜置lh，稀釋至終濃度lOng/ul ；(g)用T4DNA連接酶將步驟(f)所得產物與BamHI和HindIII酶切后的線性化載體 PRNAT-U6. Ι/Neo 在 22°C連接 2h ；(h)將步驟(g)獲得的連接產物轉化感受態E.coli DH5a后，經細胞培養、提取質粒、 測序鑒定結果如SEQ ID NO :3ο
3.如權利要求1或2所述的構建方法所獲得的ERa36敲低PC12細胞株。
全文摘要
本發明公開了一種ERα36敲低PC12細胞株的建立方法。具體是通過應用shRNA技術，利用ERα36-shRNA轉染PC12細胞，建立ERα36敲低PC12細胞株。應用免疫細胞熒光、免疫細胞化學和Western blot技術檢測細胞株中ERα36，證明細胞株建立成功。并測定細胞生長曲線和倍增時間。ERα36敲低PC12細胞株的建立為研究ERα36在中樞神經系統中作用提供了有力的實驗材料。
文檔編號C12N15/63GK102533765SQ20111045685
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者徐祎慧, 鄒偉, 馬依妮 申請人:遼寧師范大學