專利名稱：人肝臟祖先的制作方法
技術領域：
本發明涉及人肝臟干細胞、生成肝臟細胞和膽管細胞的多能細胞，以及能夠擴增和分化為包括造血、間充質或肝臟細胞譜系在內的其它肝臟遠祖細胞亞群。特別是，本發明涉及用于鑒定人肝臟祖先的標記和特性、人肝臟祖先的純化和低溫保藏方法、使人們能夠區分肝臟細胞亞群與造血細胞亞群的新方法以及證明肝祖先從胎兒到成年在人肝臟中存在的證據。本發明構成細胞和基因治療以及建立人工生物器官的基礎。
背景技術：
成熟肝臟基本的結構和功能單位是腺泡，其橫斷面的組織形式象圍繞兩個獨特的血管床的輪子3-7套肝三聯(每套有一個門小靜脈、肝小動脈和一個膽管)位于外周、中央靜脈位于中心。肝臟細胞彼此組織構成細胞板，在其兩側排列有簾式內皮膜，形成一系列的與門脈管和中央血管系統相鄰近的竇狀隙。最近的數據表明肝閏管(Canalsof Herring),即位于每個肝三聯周圍的小管,在整個區帶I產生細小的小管，它們延伸并切入肝板，形成與瓶刷子相似的結構式樣。(Theise, N. 1999,肝臟學(Hepatology), 30 1425-1433)。一個稱作迪塞間隙(Space of Disse)的狹窄空間，一直沿著竇狀隙將內皮膜與肝臟細胞分隔開。作為這種組織結構的結果，肝臟細胞具有兩個基部區(其中的每一個面向一個竇狀隙)和一個頂部區。基部區接觸血液并參與血漿成分的吸收和分泌，而頂部區則形成專門分泌膽汁鹽的膽汁小管并通過交聯網絡與膽管相連。血液從門小靜脈和肝小動脈流過竇狀隙到達末端肝小靜脈和中央靜脈。基于這種循環形式，將腺泡分為三個區帶區帶1，門周區；區帶2，腺泡中區；和區帶3，中心周圍區。增殖潛能、形態規范、(染色體)倍性以及大多數肝臟特異性基因與區帶定位相互關聯(Gebhardt, R 等人，1988, FEBS Lett. , 241 :89-93 ；Gumucio, J. J. , 1989,Springer International, Madrid ；Traber, P.等人，1988,胃腸學(Gastroenterology),95:1130-43)。跨腺泡的血液成分(包括氧氣)濃度梯度以及沿著從肝三聯到中央靜脈的血流方向承擔這種區帶化的一部分，例如，糖酵解和糖異生的彼此區室化。然而，門周區帶形成中的間隙連結蛋白質(連結蛋白26)以及中心周圍區帶形成中的谷氨酰胺合成酶(這里僅列舉兩個例子)對這樣的梯度并不敏感，而更代表了大多數組織特異性基因，并看來好象取決于微環境中對細胞或非血流變量而言為內源性的因子。除了肝臟細胞、膽管上皮細胞(膽管細胞)和內皮細胞外，位于門脈和中央靜脈區段間的區域含有其它細胞類型，諸如Ito細胞和庫佛細胞(KupfTer cell)。這些細胞在肝臟的疾病狀態中扮演突出的角色，特別是在炎癥和纖維化中，但是表面看來，它們對正常器官主要的自身穩定功能的貢獻并不大。
肝臟是盲腸囊(形成自前腸尾和原始橫隔，它們內臟間充質的一部分)匯聚發育的結果。肝臟細胞的形成，很可能是通過成纖維細胞生長因子，始于內胚層上皮與生心中胚層的相互作用之后。接著，注定為肝臟細胞的細胞增殖并以索狀方式穿入原始橫隔的間充質，形成肝臟原基。上皮-間充質的直接相互作用在肝臟的這些早期發育階段中是至關重要的，并決定哪些細胞將分別成為肝臟細胞或膽管細胞和簾式內皮膜。間充質特異性基因hlx和jumonji的突變將阻斷肝臟發育，從而表明來自該組織的貢獻的重要性。在肝臟發育的早期，肝臟含有原始的肝臟細胞簇(與缺乏基底膜的連續內皮和豐富的造血細胞相鄰接)。由于內皮細胞轉化為不連續的簾式內皮膜，所以脈管系統，特別是門脈管系統隨著基底膜的產生變得更加發達。門小間隙可以提供膽管發育的觸發器，并且由于它包圍著門小靜脈、肝小動脈和膽管，所以形成了肝三聯。很可能是為了響應諸如C_CAM105、Agp 110、E-鈣粘蛋白和連結蛋白這樣的組織-形成分子在數量和分布上的變化，未成熟肝臟細胞快速增殖并形成實質板，同時伴有絕大部分(但不是全部)造血細胞再定位于骨髓。最近的研究提示某些造血細胞祖先存留于休眠的成年嚙齒類的肝臟中，并且已從成年人類和鼠的肝臟中分離出造血干細胞(Crosbie, 0. M.等人，1999,肝臟學(Hepatology), 29 :1193-8)。在嚙齒類中成熟的物理組構是在出生后的幾周內完成的，在人類中是在頭幾年。代謝的區 帶化是根據不同的酶采取多少有些不同的安排而建立的，但在出生后的時期代謝的區帶化變得明顯起來。干細胞和定向祖先干細胞被定義為自我復制、多能，即產生的子代細胞多種命運的、能夠廣泛地發育，并能夠再構建一種或多種組織的原始細胞。大多數關于干細胞的文獻，源自有關胚胎方面的文獻或者源自關于造血、表皮或腸組織方面的文獻。最近，對定義進行了修改，以識別特定種類的干細胞。將具有參與所有細胞類型發育潛能的那些細胞稱為全能干細胞，其中包括受精卵和上至8細胞階段(桑椹胚)的正常胚胎細胞。胚胎干細胞也叫做“ES”細胞，包括源自胚泡中全能的正常細胞之永久細胞群，首先報道它們在二十世紀八十年代早期。ES細胞系可在體外培養并保持全能性。如果將ES細胞引入到無免疫應答宿主中的任何部位，但不包括子宮，將導致腫瘤發生，形成畸胎癌。但是，當將它們注射回到正常的胚泡中時，它們能夠恢復胚胎發育并參與形成正常的但卻是嵌合的小鼠。盡管已從多種物種(小鼠、大鼠、豬等)建立了 ES細胞系，但只有小鼠系統，通過將培養的修飾細胞與胚泡合并、接著將該胚泡植入到假孕宿主中，已被常規地用于產生具有新表型(敲除、轉基因)的動物。可以將顯示ES細胞的多種特性的胚胎生殖(EG)細胞系在體外直接從原基生殖細胞群中分離出來。與ES細胞一樣，當將EG細胞注射到無免疫應答的小鼠中時，EG細胞形成畸胎癌；當將EG細胞注射到胚泡中時，其對嵌合體包括生殖細胞系的形成作出了貢獻。認定干細胞是多能細胞，它的遺傳潛能被限制于有限種類的細胞類型、但具有廣泛的生長潛能。越來越多的證據諸如來自端粒酶領域的證據提示認定干細胞并不能自我復制，也就是它們的后代具有比其親代更小的生長潛能。認定干細胞通過將它們的遺傳潛能限制在單一種命運(例如肝細胞)，產生失去多能性的子代細胞，并稱其為定向祖先。在肝譜系中，有定向肝細胞祖先和定向膽管細胞祖先。最近，大量公布的實驗報道了可從人的胚胎建立人ES細胞培養物。有人建議可以將這些人ES細胞注射到組織中，希望它們能夠再造損壞的器官和組織。由于發現當將ES和EG細胞注射到除子宮(見上)以外的部位時形成腫瘤，所以計劃將人ES細胞接種到患者中并不現實，并對患者帶來產生腫瘤的嚴重可能性。為了克服這種僵局，某些研究小組正在努力進行這樣的計劃，即在限定的微環境條件下分化ES細胞，使其成為能夠安全地接種到患者中的認定干細胞。例如，在產生造血祖先方面已有一些成功的措施。但是，如果將培養物接種到患者中，仍然擔心培養物中殘留的ES可能帶來發生腫瘤的危險性。總之，在發育生物學研究將胚胎發育過程中控制決定細胞命運的謎底揭示出來之前，ES細胞仍將作為一種實驗手段，而幾乎沒有希望用于細胞或基因治療的臨床項目。圍繞肝臟干細胞的爭論在肝臟的細胞生物學領域，在成年的正常肝臟中是否存在干細胞是有巨大爭議的論題。以下總結了在該領域中相互競爭的幾種流行的模型。斜體字表示在不同模型中的關鍵概念。本領域的一些專家相信，肝臟干細胞僅存在于胚胎組織，而在成年肝臟中沒有干 細胞，而且所有成熟的肝臟細胞平等地參與肝臟的再生過程(法博Farber，E.，1992，見多種細胞類型在肝癌發生中的作用(The Role of Cell Types inHepatocarcinogenesis.)，S. A. E.編輯，Academic Press, New York)。法博Farber模型認為所有成熟的實質細胞在表型上是共相等的，并且在肝臟中，只是由于微環境造成了已知的生長潛能和基因表達的不均一性。Farber提出在致癌條件下，成年的實質細胞逆分化并變為腫瘤細胞。該模型統治肝臟腫瘤發生領域幾十年并在肝臟再生研究中仍具有影響。另一些專家相信所有的肝臟細胞都是干細胞(肯尼迪Kennedy，S.等人，1995，肝臟學，22 :160-8 ；Michalopoulos, G. K.等人，1997，科學(Science)，276 :60-6)。這些研究者相信所有的實質細胞是相互對等的，是高度可塑的，其基因表達僅由微環境支配。在適當的致癌條件下，設想成熟的實質細胞都會變為能夠隨后轉變為腫瘤細胞的干細胞。沉默干細胞模型是基于Willson和Leduc (Willson，J.W.等人，1958，病理細菌學雜志(J. Pathol. Bacteriol. )，76 :441-449)的研究建立的。正如在造血領域中，這個概念是從對肝癌發生的廣泛研究中獲得大多數承認的(Marceau，N.，1994，Gut. ,35 :294-6)。這些研究者相信祖先細胞，包括雙潛能祖先細胞，能夠繼續存在于成年組織中，但是這些研究者認為它們屬于稀少的殘留物或者來自胚胎發育細胞群的殘余。這些研究者假設祖先在正常或再生肝臟的功能發揮中不起任何作用，但只在疾病狀態中起作用(Overturf K，1999，美國病理學雜志(AmericanJournal of Pathology), 155 :2135-2143)。這也就是假設它們是“沉默的”，與肌肉中的星形細胞相似。由于其與眾不同的細胞核形狀，這些細胞被描述為“卵形細胞”。它們不大(9 左右)，并且在細胞表面表達特征性的抗原譜。所有成熟肝臟的細胞在生長和基因表達方面被假設為是共相等的，而且基因表達的不均一性僅由細胞的微環境所決定。沉默干細胞模型的支持者強烈反對實質細胞從門周到中央周圍部位移動的任何想法。肝臟細胞和其它肝祖先的重要性被認為僅與疾病狀態、特別是癌癥發生相關。因而，這些研究者將精力集中在用多種致癌性損害處理的動物中的候選祖先上。這些研究表明，“卵形細胞”在再生條件下或者在輕度至中度損傷的條件下不形成快速增殖細胞的可識別實體。只是在肝臟受到相當嚴重的損傷后，才觀察到大量的增殖性卵形細胞群(Grisham, J. W.等人，1997，見干細胞(Stem Cells)，C. S. Potter 編輯，Academic Press,London,233-282)。基于肝臟細胞流動的模型(Arber, N.等人，1988,肝臟(Liver), 11 :347-51),遭到了尖銳的批評，并且基本上已被忽視(Jurtle, R. L. , 1995,肝臟再生與癌癥發生分子和細胞機理(肝臟的再生與腫瘤的生成分子和細胞機理LiverRegeneration andCarcinogenesis Molecular and Cellular Mechanisms), AcademicPress, New York)。該模型假定，位于每個肝三聯的干細胞區室產生“流向”中央靜脈的成年實質細胞。流動過程使子代細胞與獨特的微環境接觸，從而引起細胞表型的改變。另外，假設微環境是至關重要的表型決定基。大部分研究者不贊成該模型，因為研究表明再引入肝臟的標記供體細胞并不移動(Kennedy，S.等人，1995，肝臟學，22 :160-8)，而該模型卻與此不一致。然而，即使在提供最確切證據以反對流動模型的那些研究中，也不清楚微環境或譜系的位置是否影響用于供體細胞的標記之表達。而且，最近Theise及其同事發現(Theise,N. , 1999,肝臟學，30 :1425-1433)，一直被懷疑與肝祖先相關的肝閏管至少在區帶I中伸出遍及肝板的小管，流動肝臟假說很可能會在此之后被重新光顧。Reid及其同事支持肝臟是一個干細胞和正在成熟的譜系系統(西格Sigal, S.H.等人，1992，美國生理學雜志(Am J Physiol. )，263 :G139_48)。他們提出，組織由干細胞或早期的祖先細胞群組成結構為正在成熟譜系的，類似泉涌的涌入流(fed)(布利Brill, S.等人，1993, Proceedings of the Society for ExperimentalBiology&Medicine,204 :261-9)。組織被定義為從“年輕到中年再到老年的不斷變化的細胞”。成熟的過程伴隨著細胞在大小、形態、抗原譜、生長潛能和基因表達方面的譜系位置依賴性變化。這些變化被假設為是由細胞的自主性變化之組合引起的，并不依賴于微環境及微環境誘導的變化；這里所說的微環境包括營養物、氣體交換(氧氣、CO2)、pH、激素、細胞-細胞相互作用及細胞外基質化學。表I
權利要求
1.一種提供包含源自人肝臟組織的細胞混合物的組合物的方法，其中所述的混合物包含人肝臟祖先的富集群，該方法包括 (a)獲得人肝臟組織的單細胞的懸浮液，所述的肝組織含有包括未成熟和成熟細胞在內的不同大小細胞的混合物； (b)在允許去除成熟細胞和那些相對較大細胞、而同時保留未成熟細胞和那些相對較小細胞的條件下，縮小所述懸浮液的體積；以及 (c)選擇這樣的細胞這些細胞本身、它們的后代、或其更成熟形式顯示一種或多種指示甲胎蛋白、清蛋白或二者的表達的標志， 以提供包含人肝臟祖先富集群的細胞混合物。
2.如權利要求I所述的方法，其中所述的肝臟組織得自胎兒、新生兒、嬰兒、兒童、青少年或成年個體。
3.如權利要求I所述的方法，其中未成熟細胞的直徑小于約15微米。
4.如權利要求I所述的方法，其中所述的富集群含有人二倍體全肝臟細胞。
5.如權利要求I所述的方法，其中所述的肝臟祖先為肝祖先、造血祖先、間充質祖先或其多種混合物。
6.如權利要求I所述的方法，其中所述的甲胎蛋白為全長甲胎蛋白。
7.如權利要求I所述的方法，其中所述的縮小體積處理包括根據細胞的大小、浮力密度或其組合而進行的分離。
8.如權利要求I所述的方法，其中所述的縮小體積步驟包括離心式淘洗、密度梯度離心、淘選、親和層析、突光標記、流體反向流動、連續流式離心、區帶離心、磁珠的使用或其多種組合。
9.如權利要求I所述的方法，進一步包括成熟細胞的選擇性裂解。
10.一種采用權利要求I所述的方法分離的人肝臟祖先。
全文摘要
本發明涉及一種人肝臟祖先。分離和低溫保藏人肝臟祖先的多種方法，其中包括處理人肝臟組織以提供基本上是單細胞的懸浮液，該懸浮液包含存在于人肝臟的一種或多種細胞譜系的祖先和非祖先；將懸浮液進行縮小體積處理，該步驟顯著地減少懸浮液中非祖先的數量從而提供富集祖先的懸浮液，這些祖先顯示與一種或多種細胞譜系中的至少一種相關的一種或多種標志；然后從所述的縮小體積懸浮液選擇這樣的細胞，這些細胞本身、它們的后代或者其更成熟形式表達與一種或多種細胞譜系中的至少一種相關的一種或多種標志。
文檔編號C12Q1/68GK102703379SQ20111045705
公開日2012年10月3日 申請日期2000年1月19日 優先權日1999年1月19日
發明者H·庫博達, L·M·雷德, N·莫斯 申請人:查珀爾希爾北卡羅來納大學