專利名稱：從木質纖維素生物質水解產物發酵液中生產高固體糖漿的制作方法
技術領域：
本發明涉及發酵工藝技術領域。具體地講，已經發現具有小于100厘泊的粘度并包含至少約40%的固體的糖漿能夠通過加工木質纖維素生物質水解產物發酵液而產生。
背景技術：
纖維素的和木質纖維素的原料和廢物，如農業殘留物、木材、林業廢物、來自造紙業的淤渣、以及市政和工業固體廢物，為生產有價值的產品如用作燃料的乙醇以及其它化學品提供了潛在地大量可再生原料。纖維素的和木質纖維素的原料與廢物(其由碳水化合物多聚體組成)包含纖維素、半纖維素和木質素，一般用多種化學的、機械的和酶學的方法釋放主要的己糖和戊糖到水解產物中，這種水解產物能采用生物催化劑發酵生產有用的產品O除了可代謝糖存在于生物質水解產物中之外，水解產物還包括未消化的木質素和其它生物質成分進入產品分離和下游過程。除了主要產品之外，這些水解產物成分(其混合了生物催化劑和其它發酵液成分)還需要進行處理。尤其是在生產體積非常高的燃料乙醇的生產中，純粹使用水與使用化石能源一樣重要以生產燃料乙醇。為最小化凈用水，移除產品的發酵液可被循環到工藝的早期階段，或固體可從該發酵液中分離并且所述液體流被循環到工藝的早期階段(被稱為逆流)。并且，所述液體流可在循環之前用多種方法純化。所述包含大比例木質素的固體流作為動物飼料營養價值低，但可用作燃料，其消耗后為整個生產過程提供能量。對于在玉米粒干燥軋制方法生產乙醇的所有釜餾物中的液體和固體部分的分離，離心是通常使用的，其中使用谷物而不是木質纖維素生物質作為發酵糖源。通常使用的高速水平潷析器在移除懸浮固體方面效率不高。W02008076716公開了使用陰離子聚合物絮凝劑來提高來自離心機的離心機分離液中的固體附聚以利于后續的固體/液體分離。使用該方法可獲得含很少或不含懸浮固體的稀釜餾物。US20080153149公開了離心后將所得液體部分(稀釜餾物)放入真菌生物反應器中的方法。該方法使用所述稀釜餾物作為底物來生產高價值的真菌生物質，并獲得可重復使用的加工水。仍然需要一個高效率低成本的工藝來處理來自發酵液的生產側流，所述發酵液包括木質纖維素生物質水解產物，尤其是在必須處理大量的液體時，以產生可循環利用的液體流和可用的固體流。發明概沭本發明提供了從木質纖維素生物質水解產物發酵液處理的糖漿副產品和生產所述糖漿的方法。因此，本發明提供了包含至少約40重量％的固體并具有小于約100厘泊的粘度的糖漿；其中所述糖漿是液體部分蒸發的產品，所述液體部分來自木質纖維素生物質水解產物發酵液的液體/固體分尚。在另一個實施方案中，本發明提供了生產糖漿的方法，包括a)提供木質纖維素生物質水解產物發酵液；b)任選地從(a)的木質纖維素生物質水解產物發酵液中移除產品流以產生枯竭的發酵液；c)將來自(a)的發酵液或(b)的枯竭的發酵液的液體和固體部分分尚以產生包含小于約O. I重量％的懸浮固體的稀釜餾物；以及d)蒸發(C)的稀釜餾物以產生糖漿，所述糖漿具有至少約40重量％的固體和小于約100厘泊的粘度。 在一個另的實施方案中，本發明提供了生產乙醇的方法，包括a)提供包含乙醇產品的木質纖維素生物質水解產物發酵液；b)通過蒸餾從(a)的木質纖維素生物質水解產物發酵液中移除乙醇以產生全釜餾物；c)將來自(b)的全釜餾物的液體和固體部分分離以產生包含小于約O. I重量％的懸浮固體的稀釜餾物；以及d)蒸發(C)的稀釜餾物以產生糖漿，所述糖漿具有至少約40重量％的固體和小于約100厘泊的粘度。在另一個實施方案中，本發明提供了生產丁醇的方法，包括a)提供包含丁醇產品的木質纖維素生物質水解產物發酵液；b)從木質纖維素生物質水解產物發酵液中提取丁醇以產生枯竭的發酵液；c)將來自(b)的枯竭的發酵液的液體和固體部分分離以產生包含小于約O. I重量％的懸浮固體的稀釜餾物；以及d)蒸發(C)的稀釜餾物以產生糖漿，所述糖漿具有至少約40重量％的固體和小于約100厘泊的粘度。序列簡述下列序列符合37C. F. R. I. 821-1. 825 (“對含有核酸序列和/或氨基酸序列公開的專利申請的要求一序列規則”)，并且與世界知識產權組織(WIPO)標準ST. 25 (1998)以及EPO和PCT的序列列表要求(規則5. 2和49. 5 (a-bis規則)，以及行政指導的208節和附錄C)相一致。核苷酸的符號和格式以及氨基酸序列數據符合如37C.F.R. § 1.822所示的規則。表I :用于糖化的糖基水解酶的編碼區和蛋白質的序列號
WfSEQ ID NO:~ SEQ ID NO:~
__氨基酸__編碼區_
Xyn3,來自里氏木霉(Trichoderma reesei)—I5
Fv3,來自輪枝嫌抱菌(Fasarium verticilIioides )26
Fv43D,來自輪枝嫌抱菌(Fusarium verticillioides) 37
Fv51A,來自輪枝嫌抱菌(Fusarmm verticillioides) 48保藏菌株信息
申請人已經按照國際承認的用于專利程序目的的微生物保藏的布達佩斯條約的有關條款進行了以下生物保藏
保藏人鑒定參考國際保藏所命名保藏日期
發酵單胞菌屬(Zymomonas) ZW658ATCC No PTA-7858 2006 年 9 月 12 日~發明詳沭當發酵培養基包括木質纖維素生物質水解產物時，來自培養基中由生物催化劑產生的產品發酵液是復雜漿液，其包括產品、細胞、木質素、以及其它生物質成分的混合物。有用的材料的側流處理對發酵液中產生量相對低的產品的生產尤其重要，如丁醇和乙醇。通過本文所公開的步驟，液體和固體流被高效率處理，包括生產具有至少約40%的固體的糖 漿。所述糖漿具有足夠高含量的固體以提供能量。在消耗時，所述能量可應用到生產過程。來自糖漿的能量以及循環利用的純化水為總體生產過程提供效率從而可獲得商業可行性。下列定義和縮寫用于解釋權利要求和說明書。如本文所用，術語“包括”(comprises,comprising, includes, including)、“包含”(comprises, comprising)、“具有，，(has, having)、“含有，，(contains, containing)、或其任何其它變型旨在涵蓋非排他性的包括。例如，包含一系列元素的組合物、混合物、工藝、方法、制品或設備不必僅限于那些元素，而可以包括其它未明確列出的元素，或此類組合物、混合物、工藝、方法、制品或設備固有的元素。此外，除非另有相反的說明，“或”是指包含性的或而不是指排他性的或。例如，以下任何一種情況均滿足條件A或B :A是真實的(或存在的)且B是虛假的(或不存在的)，A是虛假的(或不存在的)且B是真實的(或存在的)，以及A和B都是真實的(或存在的)。在本發明的元件或組分前的不定冠詞“一個”和“一種”旨在為有關所述元件或組分的實例(即出現)數量的非限制性。因此，應將“一個”或“一種”理解為包括一個或至少一個，并且元素或組分的詞語單數形式也包括復數形式，除非有數字明顯表示單數。如本文所用，術語“發明”或“本發明”是非限制性術語，并且不旨在意指本發明的任何單獨實施方案，而是涵蓋如本說明書和權利要求所述的所有可能的實施方案。如本文所用，用術語“約”修飾本發明的成分或反應物的數量時是指數值量的變化，它們可能發生在例如，典型的測量和用于制備濃縮液或實際使用溶液的液體處理程序中；這些程序中的偶然誤差中；制造、來源、或用于制備組合物或實施方法的成分的純度的差異中；等。術語“約”還包括由于相對于由特定起始混合物所得組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術語“約”來修飾，權利要求包括量的等同量。在一個實施方案中，術語“約”是指在報告數值10%范圍內，優選地在報告數值5%范圍內。術語“可發酵糖”是指在發酵過程中能被微生物用作碳源的低聚糖和單糖。術語“木質纖維素”是指包含木質素和纖維素的組合物。木質纖維素材料也可包含半纖維素。術語“纖維素”是指包含纖維素和包括半纖維素在內的附加組分的組合物。術語“糖化”是指由多糖生產可發酵糖。術語“經預處理的生物質”是指在糖化之前已經經過預處理的生物質。所述預處理可為物理的、熱的或化學方法的形式以及它們的組合。術語“丁醇”是指異丁醇、I-丁醇、2-丁醇、或它們的組合。術語“木質纖維素生物質”是指任何木質纖維素材料并且包括下述材料，所述材料包含纖維素、半纖維素、木質素、淀粉、寡糖、和/或單糖。生物質還包含附加組分，如蛋白質和/或脂類。生物質可來源于單一來源，或生物質可包括來源于一種以上來源的混合物；例如，生物質可包括玉米芯和玉米秸桿的混合物，或小草和葉片的混合物。木質纖維素生物質包括但不限于生物能源作物、農業殘留物、市政固體垃圾、工業固體垃圾、來自造紙業的淤渣、庭院垃圾、木材和林業垃圾。生物質的例子包括但不限于玉米芯、作物殘留物如玉米殼、玉米秸桿、小草、小麥秸桿、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱植物材料、大豆植物材料、從谷物制粉中獲得的組分、樹木、枝條、根、葉片、木片、木屑、灌木和灌叢、蔬菜、水果、以及花。術語“木質纖維素生物質水解產物”是指木質纖維素生物質糖化產生的產品。生物質也可在糖化前進行預處理或預加工。 術語“木質纖維素生物質水解產物發酵液”是指包含產品的發酵液，所述產品得自木質纖維素生物質水解產物中的生物催化劑生長和生產。所述發酵液包括木質纖維素生物質水解產物的成分，所述成分為沒有被生物催化劑消耗的，以及生物催化劑本身和生物催化劑產生的產品。術語“漿液”指不溶解的材料和液體的混合物。漿液還可包含高水平的溶解固體。漿液的例子包括糖化液、發酵液和釜餾物。術語“全釜餾物”是指蒸餾的塔底物。所述全釜餾物包含高鍋爐和蒸餾進料流的任何固體。全釜餾物是枯竭的發酵液的類型。術語“稀釜餾物”是指來自全釜餾物、發酵液、或產品枯竭的發酵液的固體/液體分離的液體部分。本文術語“產品枯竭的發酵液”(“product depleted broth”)或“枯竭的發酵液”(“d印leted broth”)是指移除產品流后的木質纖維素生物質水解產物發酵液。術語“糖漿”指濃縮的產品，其由稀釜餾物移除水而產生，一般來講為蒸發。術語“濾餅阻力”或“濾餅比阻”是指量化漿液過濾性的高度具體值。所述數值是獨立于漿液濃度、粘度、壓力和過濾面積的。所述數值是使用Ruth公式計算的并能用于標度過濾設備。Ruth 公式dt/dV= ( μ a JZI A ρ) V+ μ Rm/ A ρ其中t是過濾時間，V是過濾體積/單位過濾面積(m3/m2)，Δ ρ是過濾應用的壓力(Pa)，μ是液體粘度(kg/ms)，μ a av是平均比濾餅阻力(m/kg)，Rm是過濾器介質阻力(πΓ1)，并且C是成型濾餅質量/濾液單位體積(kg/m3)。參見Yim等人(Korean M. Chem. Eng. , 18(5),741,(2001))。“Xyn3”是來自里氏木霉木聚糖酶GHlO家族。當這組酶作用于經預處理的生物質或分離的半纖維素時，通過其能增加在木乙糖酶存在下的木糖單體產量，Xyn3 (SEQ IDNO: I ;編碼SEQ ID N0:5)間接地顯示具有木聚糖內切酶活性。“Fv3A”是來自輪枝鐮孢菌GH3家族酶。通過用P-硝基苯基_ β -吡喃木糖苷、木乙糖、混合的、來自半纖維素的線性低聚木糖低聚物和支鏈阿拉伯木聚糖做底物的檢測，Fv3A(SEQ ID NO:2;編碼SEQ ID NO:6)顯示具有β-木糖苷酶活性。“Fv43D”是來自輪枝鐮孢菌GH43家族酶。通過用P-硝基苯基_ β -吡喃木糖苷、木乙糖、或混合的、線性低聚木糖低聚物做底物的檢測，Fv43D (SEQ ID N0:3;編碼SEQ IDNO: 7)顯示具有β-木乙糖酶活性。“Fv51A”是來自輪枝鐮孢菌GH51家族酶。通過用P-硝基苯基-α -阿拉伯呋喃糖甙的測試以及通過木聚糖內切酶的作用從來自半纖維素的低聚物組中釋放阿拉伯糖，Fv51A (SEQ ID N0:4;編碼SEQ ID NO:8)顯示具有L-α -阿拉伯呋喃糖甙酶活性。術語“目標產品”是指任何由發酵的微生物生產宿主細胞產生的產品。目標產品可為宿主細胞中遺傳工程的酶途徑的產品或可由內源途徑產生。典型的目標產品包括但不限于酸、醇、烷烴、烯烴、芳烴、醛、酮、生物聚合物、蛋白質、肽、氨基酸、維生素、抗生素和藥物。 _2] 低粘度高固體糖衆本發明涉及處理來自木質纖維素水解產物發酵液的側流，尤其是用于生產高固體糖漿。通常在從木質纖維素水解產物發酵液中移除產品之后處理所述側流。移除產品的發酵液為枯竭的發酵液。當其中液體部分為稀釜餾物時，木質纖維素水解產物發酵液或枯竭的發酵液分離為固體和液體部分。該稀釜餾物含懸浮固體量很低。由于稀釜餾物中懸浮固體濃度低，在后續的蒸發過程中它保持了低粘度。在整個蒸發過程所述粘度維持在低于約100厘泊，允許蒸發到至少約40%的固體或大于所得糖漿。蒸發產生為至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%的固體的糖漿。含至少約40%的固體的糖漿能夠消耗以提供能量，而含約35%或更低的固體的糖漿不提供比消耗它們更多的能量。在一個典型的玉米粒干磨乙醇生產方法(該方法中籽粒和非木質纖維素生物質用做可發酵糖源)中，所述稀釜餾物具有高得多的懸浮固體濃度，在蒸發過程中變得粘稠，并且僅能蒸發成為固含量低于40%的糖漿。來自所述干磨方法的稀釜餾物中總懸浮固體通常為約2%-3%。在本發明方法中，來自木質纖維素生物質水解產物發酵液的或枯竭的發酵液的稀釜餾物具有小于1，OOOppm或O. 1%的懸浮固體。能將所述稀釜餾物蒸發為含40%或更高的固體的糖漿也允許回收蒸發過程中更多的水，所述水能在整個生產過程中循環利用。可使用本方法循環利用來自木質纖維素生物質水解產物發酵過程的至少約60%的水。所述循環利用的水可為木質纖維素生物質水解產物發酵過程中的至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的水。在木質纖維素生物質水解產物發酵生產乙醇或丁醇中，由于相對高體積必需處理的發酵液/獲得產品的體積，并且相對高生產體積不允許一次用水，水的循環利用特別重要。糖漿中的高百分比固體無需附加的干燥步驟，從而降低資本和運營成本。木質纖維素牛物質水解產物發酵液牛物質水解產物本領域技術人員可用任何已知的方法處理木質纖維素生物質，在水解產物中產生可發酵糖。通常，所述生物質使用物理的、熱的和/或化學的處理進行預處理，并酶解糖化。物理的和化學的處理包括但不限于碾磨、銑削、切割、堿處理如用氨或氫氧化鈉、以及酸處理。低氨預處理是特別有用的，其中生物質與包含氨的水溶液接觸，形成生物質-氨水混合物，其中氨的濃度足夠維持生物質-氨水混合物的堿性ΡΗ，但相對于生物質的干重小于約12重量％，并且相對于生物質-氨水混合物的重量,生物質的干重至少約15重量％的固體，如共同申請和共同擁有的美國專利申請公布US20070031918A1所公開的，其以引用方式并入本文。在預處理之前還通常減小生物質粒度。酶解糖化通常使用酶聚生體來降解纖維素和半纖維素以產生水解產物，其包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。糖化酶的綜述見Lynd, L. R.等人(Microbiol. Mol. Biol. Rev.，66 506-577,2002)o使用至少一種酶，并且通常使用糖化酶聚生體，其包括一種或更多種糖苷酶。糖苷酶水解二糖、低聚糖和多糖的醚鍵，并且存在于廣義“水解酶”(EC 3.)的酶分類EC 3. 2. 1.x(Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, CA,以及增補 I (1993)、增補 2(1994)、增補 3 (1995)、增補 4 (1997)和增補 5 [分別在 Eur. J. Biochem.，223 :1_5，1994 ；Eur. J. Biochem.，232 1-6,1995 ；Eur. J. Biochem.，237 1-5,1996 ；Eur. J. Biochem.，250 1-6,1997 ;和Eur. J. Biochem.，264 :610-6501999中])。本發明的方法中可用的糖苷酶能根據它們水解的生物質組分進行分類。可用于本發明方法中的糖苷酶包括纖維素水解糖苷酶(例如，纖維素酶、內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡糖苷酶)、半 纖維素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、內切木聚糖酶、外切木聚糖酶、β -木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果膠酶、葡糖醛酸糖苷酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、異淀粉酶)。此外，它可用于將其它活性加入糖化酶聚生體中，如肽酶(EC 3. 4. X. y)、脂肪酶(EC 3. I. I. x和3. I. 4. X)、木素酶(ECI. 11. I. X)和阿魏酸酯酶(EC 3. I. I. 73)，以幫助從生物質的其它組分中釋放多糖。本領域熟知生產多糖水解酶的微生物常常表現出某種活性，如纖維素降解，該活性由若干種酶或一組具有不同底物特異性的酶催化。因此，來自微生物的“纖維素酶”可包括一組酶，所有酶可有助于纖維素降解的活性。取決于獲取酶時利用的純化方案，商業或非商業酶制劑如纖維素酶可包括多種酶。糖化酶可商購獲得，如Spezyme* CP纖維素酶、Multifeet 木聚糖酶、
Accelerase 1500、以及 Accellerase DUET (Danisco U. S. Inc.，GenencorInternational, Rochester, NY)。此外糖化酶可為未純化的并以細胞提取物或完整細胞制劑的形式提供。所述酶可使用已經工程化的重組微生物以表達多個糖化酶進行生產。本發明中有特別價值的為一類糖苷水解酶，如家族GH3、GH39、GH43、GH55、GH10和GH11。GHs是一組酶，其水解兩個或更多個碳水化合物間的糖苷鍵，或碳水化合物與非碳水化合物基團間的糖苷鍵。GHs家族基于序列相似性計進行分類，在碳水化合物-活性酶(CAZy)數據庫中可提供(Cantarel 等人(2009)Nucleic Acids Res. 37 (Database issue)D233-238)。這些酶能作用于許多底物并在糖化過程中有效。糖苷水解酶家族3 (“GH3”)的酶具有許多活性β-葡糖苷酶(EC:3. 2. 1.21)、β-木糖苷酶(EC:3. 2. I. 37)、N-乙酰β-氨基葡糖苷酶(EC:3. 2. I. 52)、葡聚糖@-1，3-葡糖苷酶化(:3. 2. I. 58)、纖維糊精酶(EC:3. 2. I. 74)、外-1,3-1，4-葡聚糖酶(EC:3. 2. I)、以及半乳醣苷酶(EC 3. 2. 1.23)。糖苷水解酶家族39 (“GH39”)的酶具有a -L-艾杜糖苷酸酶(EC: 3. 2. I. 76)或β -木糖苷酶(EC:3. 2. I. 37)活性。糖苷水解酶家族43 (“GH43”)的酶具有下列酶的活性L_a -阿拉伯呋喃糖酶(EC 3. 2. I. 55), β-木糖苷酶(EC3. 2. I. 37)、阿拉伯糖內切酶(EC 3. 2. 1.99),以及半乳聚糖-I，3-β -半乳醣苷酶(EC 3. 2. I. 145)。糖苷水解酶家族51 (“GH51”)的酶具有L-α-阿拉伯呋喃糖酶(EC 3. 2. I. 55)或內切葡聚糖酶(EC 3. 2. I. 4)活性。糖苷水解酶家族 10 (“GH10”)更全面地描述見 Schmidt 等人·，1999，Biochemistry 38 :2403-2412和 Lo Leggio 等人，2001，FEBS Lett 509 :303-308)而糖苷水解酶家族 11 (“GH11”)更全面地描述見 Hakouvainen 等人.，1996, Biochemistty 35 :9617_24。在酶聚生體中尤其有用的是糖苷脫水酶(GH) Xyn3、Fv3A、Fv51A和Fv43D。Xyn3(SEQ ID NO: I)是來自里氏木霉的GHlO木聚糖酶家族；Fv3A (SEQ ID NO: 2)是來自輪枝鐮孢菌GH3酶家族；Fv43D (SEQ ID NO: 3)是來自輪枝鐮孢菌GH43酶家族；而Fv51A (SEQ IDNO: 4 )是來自輪枝鐮孢菌GH51酶家族。這些酶可從它們的天然宿主生物體分離，或表達在工程宿主生物體中而產生。例如，嵌合基因，其包含在目標表達宿主細胞中活性的啟動子、編碼上面給出的糖苷水解酶的序列、和終止信號，由質粒載體表達或通過本領域技術人員熟知的標準方法整合到目標表達宿主細胞基因組中。所用的編碼序列可為針對表達用的特定宿主密碼子優化的。通常所用的表達宿主細胞包括細菌如埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和鏈霉菌屬(Streptomyces),酵母如糖酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、 漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)和法夫酵母屬(Phaffia),以及絲狀真菌如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短柄霉屬(Aureobasidium)、黑管菌 M (Bjerkandera)> 擬臘菌屬(Ceriporiopsis)、白腐真菌屬(Chrysoporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、棒囊殼屬(Corynascus)、毛殼菌屬(Chaertomium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)、鍵抱屬(Fusarium)、赤霉菌屬(Gibberella)、腐質菌屬(Humicola)、稻痕菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、毛霉屬(Mucor)、瘤胃真菌屬(NeocalIimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(PaeciIomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、脈射菌屬(Phlebia)、Piromyces、側耳屬(Pleurotus)、Scytaldium、裂裙菌屬(Schizophyllum)、抱子絲菌屬(Sporotrichum)、踩節菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、草根霉菌屬(Thielavia)、彎頸酶屬(Tolypocladium)、栓菌屬(Trametes)和木霉屬(Trichoderma)。本領域的技術人員會了解如何確定在聚生體中的有效酶量及調整為最佳酶活性的條件。本領域的技術人員也會了解如何優化在聚生體內所需的酶活的多個類，以在選定的條件下獲得一個給定的預處理產品的最佳糖化。糖化的實例描述見US20070031918A1。在發酵前糖化混合物可通過蒸發而濃縮，例如，增加可發酵糖的濃度。任選地，在糖化產品中的液體可從分批或連續方法中的固體中分離。任選地，液體或全部糖化產品可在發酵前滅菌。根據發酵中使用的生物催化劑和糖化過程中使用的pH，所述PH可被調整為適宜發酵的。包含可發酵糖的木質纖維素生物質水解產物通常以百分比包括在發酵培養基中，從而提供所有或部分用于生物催化劑生長和產品生產的碳源。木質纖維素生物質水解產物發酵液中的水解產物，占總體積的至少約25%，并可占至少約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更多。US20070031918A1 中的實施例 9 給出了水解產物的使用占到發酵液的40%或80%的實例，其以引用方式并入本文。根據所述水解產物中可發酵糖的濃度，培養基中可加入附加的糖。例如，當含約80克/升葡萄糖和約50克/升木糖的水解產物占發酵液的40%時，可添加附加的葡萄糖和木糖至期望的終糖濃度。如本領域技術人員所熟知，除了水解產物，發酵液可包含其它營養物、鹽和因子，這些物質是生長和使用特異性生物催化劑生產產品所必需的。補充劑可包括例如酵母提取物、特定氨基酸、磷酸鹽、氮源、鹽和痕量元素。也可包括通過特定生物催化劑生產特定產品所需的組分，如用于保留質粒的抗生素或酶催化反應所需的輔因子。在本文所用的發酵液中，水解產物占總體積的90%。在制備水解產物的替代方案中，將水解產物加入到發酵液，然后啟動發酵，同步糖化和發酵(SSF)可用于生產木質纖維素生物質水解產物發酵液。在該方法中，糖從生物質中產生，所述生物質通過生產生物催化劑而代謝。生物催化劑發酵和目標產品
木質纖維素生物質水解產物發酵培養基中的可發酵糖是通過適宜的生物催化劑代謝以生產目標產品。所述糖分在發酵過程中與生物催化劑接觸，其中生物催化劑在通過生物催化劑生產目標產品的條件下生長。根據對應用的特定生物催化劑有用的條件，溫度和/或頂空氣相可針對發酵進行調整。發酵可以是有氧的或厭氧的。這些和其它的條件，其包括溫度和PH，針對使用的特定生物催化劑進行調整。通常所述生物催化劑被工程化以生產目標產品，但它可天然地生產目標產品。使用生物催化劑通過發酵生產的目標產品包括例如酸、醇、烷烴、烯烴、芳烴、醛、酮、生物聚合物、蛋白質、肽、氨基酸、維生素、抗生素和藥物。醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、赤蘚糖、木糖醇、山梨醇和1，3-丙二醇。酸包括但不限于乙酸、乳酸、丙酸、3-羥基丙基、丁酸、葡糖酸、衣康酸、檸檬酸、琥珀酸和乙酰丙酸。氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。附加的目標產品包括甲烷、乙烯、丙酮和工業酶。尤其適宜的產品是乙醇和丁醇，包括異丁醇、2-丁醇和I-丁醇。糖轉化為目標產品的發酵可通過一個或多個合適的生物催化劑在一步或多布發酵過程中進行。生物催化劑可以是選自細菌、絲狀真菌和酵母的微生物。生物催化劑可為野生型微生物體或重組微生物體，并且包括例如埃希氏菌屬(Escherichia)、發酵單胞菌屬(Zymomonas)、糖酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和梭菌屬(Clostridium)。在另一個實施方案中，生物催化劑可以選自重組大腸桿菌(Escherichia coli )、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillus stearothermophi Ius ) > 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、嗜熱梭菌(Clostridia thermocellum)、高溫產氫菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)和樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)。已描述了許多在發酵中用于生產目標產品的生物催化劑，并且其它的可以通過突變或以重組的方法工程化而發現和生產。任何生物催化劑(其利用木質纖維素生物質水解產物培養基中的可發酵糖)可用于生產已知產生的目標產品，并因此使用本方法加工生產木質纖維素生物質水解產物發酵液。在木質纖維素生物質水解產物發酵培養基中生產的產品尤其有用的是醇產品，其可用作燃料，如丁醇和乙醇。通過產溶劑梭菌(Clostridia)將碳水化合物轉化為丙酮、丁醇和乙醇的發酵(ABE 發酵)是眾所熟知的(Jones and Woods (1986) Microbiol. Rev. 50 :484_524)。US5192673描述了用于使用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)突變體生產高含量丁醇、丙酮和乙醇的發酵方法。US 6358717描述了用于使用拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)突變體生產高含量丁醇、丙酮和乙醇的方法。通過經基因修飾的酵母生產丁醇已公開，例如US 20070092957A1。基因修飾的大腸桿菌(E. coli)菌株也已被用作乙醇生產的生物催化劑。(Underwood 等人.，(2002) Appl. Environ. Microbiol. 68 6263-6272)。乙醇由經基因修飾的發酵單胞菌屬在木質纖維素生物質水解產物發酵培養基(US 20070031918A1)中產生。經基因修飾的增加乙醇產量的運動發酵單胞菌菌株的描述見US2003/0162271A1 和 US 2009/0246846A1。在US 7504250中公開的是生產1，3_丙二醇的重組微生物體。通過大腸桿菌重組菌株(Zhou等人，(2003) Appl. Environ. Microbiol. 69 399-407)、芽孢桿菌屬天然菌株(US20050250192)和米根霉(Rhizopus oryzae) (Tay 和Yang (2002) Biotechnol. Bioeng. 80 :1-12)在發酵中生產乳酸。通過大腸桿菌重組菌株 作為生物催化劑在發酵中生產1，3-丙二醇(US 6013494，US 6514733)和己二酸(Niu等人，(2002) Biotechnol. Prog.，18 :201-211 )。使用重組梭菌(Clostridia) (Cheryan 等人，(1997) Adv. Appl. Microbiol. 43 :1_33)和新鑒定的酵母菌株(Freer (2002) WorldJ. Microbiol. Biotechnol.，18 :271-275)通過發酵生產乙酸。通過公開于 US 6159738的重組大腸桿菌和其它細菌，以及重組大腸桿菌突變體(Lin等人(2005) Metab. Eng. 7 116-127)生產琥 自酸。通過光滑球擬(Torulopsis gabrata)酵母突變體(Li等人，(2001)Appl. Microbiol. Technol. 55 :680-685)和大腸桿菌突變體(Yokota 等人，(1994) Biosci.Biotech. Biochem. 58 :2164-2167)生產丙酮酸。使用大腸桿菌重組菌株作為生物催化劑用于生產對羥基肉桂酸(US20030170834)和奎尼酸(US20060003429)。在發酵過程中使用丙酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidipropionici)突變體(Suwannakham 和 Yang(2005)Biotechnol. Bioeng. 91 :325-337)生產丙酸，并且使用酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)(Wu 和 YangC2003)BiotechnoI. Bioeng. 82 :93-102)生產丁酸。通過梭菌屬(Clostridium sp.)菌株 17crl(Janssen(2004)Arch. Microbiol. 182 482-486)發酵從蘇氨酸生產丙酸酯和丙醇。使用酵母樣普魯蘭出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) (Anantassiadis 等人，(2005) Biotechnol. Bioeng. 91 :494-501),通過黑曲霉(Aspergillis niger)突變體(Singh 等人·，(2001) Indian J. Exp. Biol. 39 :1136-43)生產葡糖酸。通過氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)突變體(Elfari等人，(2005) ApplMicrobiol. Biotech. 66 :668-674)生產 5_ 麗基-D-葡萄糖酸，通過土曲霉(Aspergillusterreus)突變體(Reddy 和 Singh(2002)Bioresour. Technol. 85 :69-71)生產衣康酸，通過黑曲霉(Aspergillusniger)突變體(Ikram-Ul-Haq 等人，(2005) Bioresour.Technol. 96 :645-648)生產梓樣酸，以及通過高里假絲酵母(Candida guilliermondii)FTI 20037 (Mussatto and Roberto (2003)J. Appl. Microbiol. 95 :331-337)生產木糖醇。通過重組紅串紅球菌(Pseudomonas putida)和富養羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)(Gorenflo等人，(2001) Biomacromolecules 2 :45_57)生產包含4_輕基戊酸乙醋和顯著量3-羥基丁酸3-羥基戊酸的生物聚酯。通過重組大腸桿菌(Ui等人，(2004) Lett. Appl.Microbiol. 39 :533-537)生產 L-2，3 丁二醇。
可通過使用棒狀桿菌(Corynebacterium)、短桿菌(Brevibacterium)、以及沙雷氏菌(Serratia)的營養缺陷型菌株和氨基酸類似物抗性菌株發酵生產氨基酸。例如，日本專利公布56008596描述了使用組氨酸類似物抗性菌株生產組氨酸，EP 136359描述了使用重組菌株生產組氨酸。日本專利公布47004505和51019037描述了使用色氨酸類似物抗性菌株生產色氨酸。日本專利公布47038995、51006237、54032070描述了使用異亮氨酸類似物抗性菌株生產異亮氨酸。日本專利公布56010035描述了使用苯基丙氨酸類似物抗性菌株生產苯基丙氨酸。已經描述了使用需要苯丙氨酸生長的酪氨酸抗性菌株(Agr. Chem. Soc.Japan 50 (I) R79-R87 (1976)，或重組菌株(EP263515，EP332234)生產酪氨酸，以及使用L-精氨酸類似物抗性菌株生產精氨酸(Agr. Biol. Chem. (1972)36 :1675-1684，日本專利公布54037235和57150381)。也通過在大腸桿菌菌株ATCC 31882、31883、和31884中通過發酵生產苯基丙氨酸。US6962805描述了在重組棒狀桿菌中生產谷氨酸。通過大腸桿菌的突變體生產蘇氛酸的描述見 Okamoto and Ikeda(2000)J. Biosci Bioeng. 89 :87_79。通過百合棒狀桿菌(Corynebacterium Iilium)突變體(Kumar 等人，(2005)Bioresour. Technol. 96 287-294)生產甲硫氨酸。

通過生物催化劑也已經制備出有用的肽、酶和其它蛋白質(例如參見US6861237、US6777207、US6228630)。為生長良好和在木質纖維素生物質水解產物發酵液中有高的產品產量，可選擇或工程化生物催化劑以具有對生物質水解液中存在的抑制劑，如乙酸鹽，有更高的抗性。例如，提高木糖利用率和在脅迫條件下生產乙醇，如那些由發酵單胞菌屬(Zymomonas)在木質纖維素生物質水解發酵液中遇到的，公開在共同擁有的和共同未決的美國專利申請公布US20110014670，其以引用方式并入本文。本文公開的是發酵單胞菌屬細胞在包含木糖、乙酸鹽、乙酸銨和乙醇的培養基中連續生長，以及分離改良的發酵單胞菌屬菌株，如ZW705。從木質纖維素生物質水解產物發酵液中制備高固體糖漿在取出了包含由生物催化劑產生的產品的產品流后，處理來自木質纖維素生物質水解產物發酵液的側流。例如當丁醇為產品時，它可通過提取發酵液從發酵液中取出，如通過氣體反萃取、或使用與水不混溶的有機萃取劑并從水相中分離包含丁醇的有機相，如公開在共同擁有的和共同未決的WO 2009/149270，其以引用方式并入本文。所得的移除產品的發酵液為枯竭的發酵液。當乙醇為產品時，發酵液蒸餾，通常使用初餾塔以產生乙醇產品流和全釜餾物，其即枯竭的發酵液。蒸餾可使用本領域技術人員已知的任何條件，包括在常壓或減壓下。作為另外一種選擇，所述產品可在分離后從固體或液體部分取出。發酵液或枯竭的發酵液，如全釜餾物，分離為固體和液體流，其中被稱為稀釜餾物的液體流具有小于約0. 1%的懸浮固體。可使用任何產生含小于約0. 1%的懸浮固體的稀釜餾物的分離工藝。可使用多種過濾設備，如帶束過濾器、壓帶機、螺桿式壓縮機、轉筒過濾器、碟式過濾器、濾過器、壓力過濾機和離心過濾器。可通過如施用真空、壓力或離心力輔助過濾。此外，分離過程的組合可用于實現低懸浮固體濃度，如離心后接小壓力過濾以移除離心后殘留的懸浮固體。可再次分離初始分離的液體部分。例如在過濾時，一些初始濾液可再循環回到過濾起始的過濾器進料槽以提高稀釜餾物的質量。初始5%-10%的濾液可具有約0. 1%的懸浮固體。然而其余90%-95%的濾液通常具有低得多的懸浮固體，并且因此稀釜餾物平均將為基本上小于O. 1%的懸浮固體，即使沒有再循環初始濾液。為了提高過濾的效率可使用熱處理，如公開在共同擁有的和共同未決的美國專利申請61/328804，其以引用方式并入本文。在發酵液或枯竭的發酵液如全釜餾物的濾餅阻力降低到低于約20%的條件下，所述木質纖維素生物質水解產物發酵液或枯竭的發酵液如全釜餾物可進行熱處理。所述發酵液或枯竭的發酵液如全釜餾物的處理溫度在約70°C和約150°C之間，處理時間在約30秒和210分鐘之間。較長的時間與范圍內較低的溫度一起使用，而較短的時間與范圍內較高的溫度一起使用。例如，在美國專利申請61/328804的實施例2和4中，70°C加熱60分鐘足夠將濾餅阻力降低24% ;110°C加熱30秒足夠將濾餅阻力降低21% ;并且145°C加熱30秒足夠將濾餅阻力降低45%。在約95°C和約150°C之間的溫度尤其有用的，其中較短的時間如約30秒和30分鐘之間是有效的。來自常壓蒸餾的全釜餾物，蒸餾通常在95°C至100°C之間進行，可在此溫度下保持約15至30分鐘。在這種情況下，如果全釜餾物、或其它枯竭的發酵液、或二者的溫度由于前面的工序都處于或超過期望的溫度，可以不需要進一步施用加熱；通過將全釜餾物或其它枯竭的發酵液、或二者在絕緣容器中保持所需的時間來維持溫度。對短的處理，尤其有用的是在約110°C和約150°C之間 的溫度，持續時間在約30秒和2分鐘之間。熱處理可在任何能在所需時間內保持溫度的系統中進行。例如，加熱可在一個熱夾套容器中或在換熱器中，隨后保持在一個容器或環流反應器中。如美國專利申請61/328804公開的，根據處理的發酵液、枯竭的發酵液或全釜餾物的PH，在給定溫度下降低濾餅阻力至少約20%所需時間也有所差異。更多的濾餅阻力減少實現在較低的pH，pH6或更低的尤其有用。根據發酵中使用的生物催化劑，木質纖維素生物質水解產物發酵液的PH可以為pH6或更低。作為另外一種選擇，在熱處理之前或期間發酵液、枯竭的發酵液或全釜餾物的PH可調節至約6、5、4或3。在pH調節過程中混合或攪拌枯竭的發酵液或全釜餾物對PH調節酸的均勻分布是有用的。此外，在熱處理期間可使用混合以均勻控制溫度。混合，其可為連續的或非連續的，通常是由一個攪拌器系統進行，如使用葉輪的攪拌器。對熱處理過的木質纖維素生物質水解產物發酵液或枯竭的發酵液進行后續液體/固體分離，固體部分或濾泥餅可以消耗為生產過程提供能量。所述濾泥餅可在消耗前干燥，如空氣干燥，以降低水分。對熱處理過的木質纖維素生物質水解產物發酵液進行后續液體/固體分離，取出產品流。例如，液體流可萃取或蒸餾以產生產品流，如蒸餾產生乙醇產品流和剩余液體。液體/固體分離后，液體流的一部分可回收直接作為渦流使用。作為渦流，所述液體可能添加到過程中需要淡水的任何一點，如在預處理、糖化或生物催化劑種子繁殖中。液體部分的殘留物或其全部通過蒸發而進一步純化以產生能回收的水和糖漿。由于液體部分或稀釜餾物的懸浮固體濃度低，它在隨后的蒸發步驟中保持了低粘度。在整個蒸發過程中粘度保持低于約100厘泊，使得蒸發產生了含至少約40%的總固體的糖漿，其為懸浮和溶解固體的組合物。如本文實施例3中表明，粘度與總固體百分比、pH和溫度有關。例如，在60°C保持低于100厘泊的粘度蒸發至約67%的固體，pH為5. 7 ;而在40°C保持低于100厘泊的粘度蒸發至約69. 5%的固體，pH為4. 7。蒸發可在壓力下進行，在常壓下或在減壓下。含至少約40%的固體的所得糖漿能消耗以提供能量，不需要附加的干燥步驟。通常由玉米粒干磨乙醇方法產生的糖漿具有約35%或更少的固體，無法提供比用于其干燥然后消耗所需更多的能量。蒸發可在任何蒸發系統中進行，如降膜、升膜、壓力環流、板式或機械和熱蒸汽再壓縮系統。蒸發可為連續的或分批的，并可用多效蒸發器。蒸發的水可循環用于木質纖維素生物質水解產物發酵總體過程。
實施例本發明將在下面的實施例中得到進一步闡述。應該理解，這些實施例盡管說明了本發明的優選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。從上文的討論和這些實施例中，本領域的技術人員能夠確定本發明的特性，并且在不脫離其實質和范圍的情況下，能對本發明進行各種變化和修改以適應不同的用途和條件。 所用縮寫的含義如下“s”是指秒，“min”是指分鐘，“hr”的“h”是指小時，“ μ L”是指微升，“mL”是指毫升，“L”是指升，“m”是指米，“nm”是指納米，“mm”是指毫米，“cm”是指厘米，“ μ m”是指微米，“mM”是指毫摩爾每升，“Μ”是指摩爾每升，“mmol ”是指毫摩爾，“ ymole”是指微摩爾，“g”是指克，“ μ g”是指微克，“mg”是指毫克，“kg”是指千克，“rpm”是指每分鐘轉數，“C”是指攝氏度，“ppm”是指百萬分之一，“cP”是指厘泊。一般方法:糖化酶Accellerase 1500 (Α1500)和Multifect 木聚糖酶購自 Danisco U. s. inc.，Genencor, International (Rochester, NY)。纖維素酶和半纖維素酶牛產菌株菌株229 :里氏木霉菌株，來源于 RL-P37(Sheir-Neiss and Montenecourt, 1984,Appl. Microbiol. Biotechnol. 20 :46-53)通過誘變和對高纖維素酶產量的選擇，采用PEG介導轉化法與β -葡糖苷酶表達盒(cbhl啟動子，里氏木霉β -葡糖苷酶I基因,cbhl終止子和amdS標記)和木聚糖內切酶表達盒(cbhl啟動子,里氏木霉xyn3和cbhl終止子)共轉化(Penttila等人，1987, Gene 61 (2) :155_64)。眾多的轉化子被分離出來并檢驗β -葡糖苷酶和木聚糖內切酶產量。一個轉化子，稱為里氏木霉菌株229，被用于本文所述的某些研究中。菌株Η3Α :里氏木霉菌株229采用電穿孔法，與β -木糖苷酶Fv3A表達盒(cbhl啟動子，Fv3A基因，cbhI終止子和alSR標記)、β -木糖苷酶Fv43D表達盒(egl I啟動子，Fv43D基因，原生Fv43D終止子)以及Fv51A α -阿拉伯呋喃糖酶表達盒(egll啟動子，Fv51A基因，Fv51A原生終止子)共轉化。轉化子在包含氯嘧磺隆的Vogels瓊脂平板上選擇。許多轉化子被分離出來并檢驗β_木糖苷酶和L-α-阿拉伯呋喃糖酶產量。里氏木霉整合表達菌株Η3Α，其重組表達里氏木霉β -葡糖苷酶I、里氏木霉xyn3、Fv3A、Fv51A、以及Fv43D，被分離出來。在菌株H3A發酵期間產生的細胞外蛋白通過離心從細胞群中分離出來，通過經由Millipore IOkD分子截留分子量膜進行的膜超濾進行濃縮，并將pH調節至4. 8。使用Weichselbaum和Gornall修改的改性的縮二脲方法測定總蛋白，該方法使用牛血清白蛋白作為校準物(Weichselbaum, 1960, Amer. J. Clin. Path. 16 :40 ；GornalI 等人，1949J. Biol.Chem 177:752)。這種H3A細胞外蛋白制劑本文稱為H3A蛋白，它用作組合纖維素酶和半纖維素酶制劑，在SSF期間影響絡合碳水化合物水解。牛物催化布丨和種菌制劑運動發酵單胞菌用于發酵的起源在這些實施例中的木質纖維素生物質水解產物發酵液可采用可供選擇的生物催化劑產生。這些實施例中所用的示例性菌株如下所述。作為替代方案，菌株ZW658，保藏號為ATCC#PTA-7858，可用于生產處理用的木質纖維素生物質水解產物發酵液。運動發酵單胞菌菌株ZW705產自菌株ZW801-4，其采用美國專利申請公布US2011-0014670所述的方法，其以引用方式并入本文，在此簡要重述。運動發酵單胞菌菌株ZW801-4的培養物生長在如下的脅迫條件下。ZW801-4是運動發酵單胞菌重組的木糖利用 菌株，其描述見US7，741，119，其以引用方式并入本文。菌株ZW801-4來源于菌株ZW800，其來源于菌株ZW658，所有的描述參見US7，741，119。ZW658通過經由序貫轉座事件將兩個操縱子PgapxylAB和Pgaptaltkt整合到ZWl (ATCC#31821)基因組中，然后通過包含木糖的選擇培養基篩選進行構建，所述操縱子包含四個編碼木糖異構酶、木酮糖激酶、轉醛醇酶和轉酮醇酶的木糖利用基因。ZW658以ATCC#PTA-7858保藏。在ZW658中，使用宿主媒介的基因雙交換同源重組和作為選擇性標記的奇放線菌素抗性使編碼葡萄糖-果糖氧化還原酶的基因插入失活以產生ZW800。使用Cre重組酶，通過位點特異性重組移除由IoxP位點束縛的奇放線菌素抗性標記以產生ZW801-4。ZW801-4的連續培養在250ml攪拌的、pH和溫度受控的發酵罐(Sixfors ；Bottmingen, Switzerland)中進行。發酵基礎培養基是5克/升酵母提取物，15mM磷酸銨，I克/升硫酸鎂，IOmM山梨醇，50克/升木糖和50克/升葡萄糖。通過在97天中逐漸提高加到上述連續培養基中的乙酸銨濃度，同時保持通過特定稀釋速率測得的確定生長速率來影響在高濃度乙酸和氨的存在下的適應生長。將乙酸銨濃度提升至160mM。通過加入磷酸銨至在連續培養139天的末期最終總銨離子濃度為210mM來實現銨離子濃度的進一步提高。通過接種單菌落并擴增一個選擇的菌落來從適應種群中分離菌株ZW705。菌株AR37-31產自菌株ZW705，通過進一步改型在玉米芯水解產物培養基中生長，如共同擁有的和共同未決的美國專利申請61/424077所公開的，其以引用方式并入本文。ZW705 生長于恒濁器中(US 6, 686, 194 ；Heurisko USA, Inc. Newark, DE)，其為連續流動培養裝置，其中培養物中的細胞濃度通過控制培養基到培養物的流動而保持恒定，使得培養物的濁度保持在在指定的狹窄限制內。培養物在連續培養裝置中可利用兩種培養基生長，一種為靜息培養基(培養基A), 一種為挑戰培養基(培養基B )。培養物生長在生長室中的靜息培養基上到濁度設置點，然后以稀釋速率設置進行稀釋以維持細胞密度。通過每10分鐘加入一次限定體積的培養基來進行稀釋。當恒濁器進入培養基挑戰模式時，基于在前一次培養基添加后返回設置點的速率選擇加入挑戰培養基或靜息培養基。生長室中培養基的穩態濃度為培養基A和培養基B的混合；根據從各個培養基提取的速率決定兩種培養基的比例，其為設置的稀釋速率以允許維持設置的細胞密度。代表生長室中種群的細胞樣品以每周的間隔從恒濁器外流液中回收(在捕獲室)。所述細胞樣品在MRM3G6培養基上生長一次并在_80°C作為甘油原液保存。
ZW705生長至一個任意濁度設置點，其表明培養物使用了輸入培養基中存在的全部葡萄糖和大約一半的木糖，以在設置稀釋速率下滿足細胞密度設置點。使用靜息培養基，其為 50% 的 HYAc/YE 和 50% 的 MRM3G6. 5X4. 5NH4Acl2. 3 以及挑戰培養基，其為 HYAc/YE。3周后分離的菌株用于另一輪恒濁器改型，使用HYAc/YE作為靜息培養基以及HYAc/YE加9重量％乙醇作為挑戰培養基。菌株AR37-31在2周后分離，在水解產物培養基中鑒定為一個提高木糖和葡萄糖利用率、以及提升乙醇產量的菌株。通過序列分析，發現AR37-31在運動發酵單胞菌基因組開放閱讀框中有一個突變，所述開放閱讀框編碼具有膜轉運蛋白性質的蛋白，并注釋為編碼鐮刀菌酸抗性蛋白。培養某每升MRM3包含酵母提取物(10g)，KH2P04 (2g)和
MgSO4. 7H20 (Ig)MRM3G6包含的是MRM3，其包含60克/升葡萄糖MRM3G6. 5X4. 5NH4Acl2. 3 為 MRM3，其包含 65 克 / 升葡萄糖，45 克 /升木糖，12.3克/升乙酸銨HYAc/YE包含芯水解產物，其固體通過離心移除并過濾消毒，其包含68克/升葡萄糖，46克/升木糖和5克/升乙酸鹽，輔以6. 2克/升乙酸銨和O. 5%酵母提取物，調節至ρΗ5· 8ο比濾餅阻力比濾餅阻力量化濾餅阻力的變化/高度單位濾餅。它依賴于漿液濃度、粘度、壓力和過濾面積。所述數值得自Ruth公式如上所述[參見Yim等人，Korean M. Chem. Eng. , 18
(5),741,(2001)]。粘度測量的詳細信息粘度是由Paar Physica MCR 300流變儀測定的，其允許全溫度控制。應用于玉米生物樣品的測量原理是使用錐-錐或雙間隙型測量頭旋轉測量。測量在不同溫度下(20°C，40°C，60°C)并且以l-3001/s的剪切速率在滑道上進行。記錄的粘度是無限剪切粘度。MR使用了實驗室規模的蒸發設備，其包含填充了 Syltherm熱傳遞液的再循環加熱水浴，連接到一個5升的帶夾套圓底燒瓶上。帶雙冷凝器的短路徑蒸餾頭用于塔頂冷卻。約I至2公斤的稀釜餾物用于蒸發。在固定的時間間隔收集塔頂水和底部糖漿樣品。過濾-460毫米Netzsch壓濾坑使用了下列可商購獲得的預試生產標度壓濾機具有I. O預擠壓容量的Netzsch 470/SP膜壓濾機混合包裝膜(ANDRITZ AG，Stattegger Strasse 18,A_8045Graz,Austria)。手動配管帶合適數量的進料閥、砂芯氣孔閥、濾餅氣孔閥、反沖膜閥和濾液塊閥都包括在內。470毫米壓濾機用于液體/固體分離。該設備由兩個操作滑道第一個有兩攪拌進料槽和空氣泵給壓濾機進料，第二個運輸車是壓濾機本身。·過濾器面積6800厘米2 室的數量2·最大過濾壓力=7巴(700千帕)
最高操作溫度85 °C·關閉機制液壓頂·供給源空氣驅動隔膜泵 量綱1300 X 1500X600 毫米 重量大約250公斤壓濾機在壓力下處理液體。漿液進料到壓濾機高達100磅/平方英寸(689. 5千帕)。液壓頂以6，000磅/平方英寸(41. 4兆帕)壓縮濾板棧。還有一個單獨的氣缸，提供高達225磅/平方英寸(1551. 3千帕)的擠壓力給壓濾機用于機械壓縮。實施例I 產生木質纖維素生物質水解產物發酵液玉米芯預處理FRF 6分枇發酵Jaygo水平槳反應堆(大約170升)用于預處理4批玉米芯片，全尺寸〈1/2" (1.27厘米)。反應器裝滿玉米芯并且真空施用到該容器上至O. I巴(10千帕)絕對先于導入氫氧化銨溶液，以提供相對于生物質干重的大約4 (2批)、6 (I批)或8 (I批)重量％的NH3。添加蒸汽到大約145°C的溫度。保持這一溫度20分鐘。在預處理的結尾，反應器以受控方式減壓至常壓，然后隨后應用真空使容器內壓力降至絕對的大約O. I巴(10千帕)。退出反應器的預處理玉米芯片為大約55重量％的干物質。玉米芯片在帶I. O毫米篩網的微粒粉磨機中減小至小于 I 毫米(Model#lSH, Serial#10019 ；Pulverizing Machinery Division ofMikropul Corporation ；Summit, NJX分批發酵FRF 7-10一個水平的Littleford Dayl30升反應容器，其包含圍繞容器主體傳遞蒸汽的夾套和測流之一夾克傳遞船只的身體周圍的蒸汽和兩側之一(Littleford Day, Inc.,Florence, KY)，用于預處理分批玉米芯。對于每一分批，容器加載了玉米芯(小于I毫米大小)。玉米芯使用1.0臟篩網用微粒粉磨機處理以減小尺寸^0(^1#15!1，Serial#10019 ；PulverizingMachinery Division of Mikropul Corporation ;Summit,NJ)0 表 2 中給出了用于不同的前處理批次的玉米芯水分％。應用真空使容器內壓力降至0. Iatm先于在靠近容器頂部導入28. 9重量％的氫氧化銨溶液和水，以提供相對于生物質干重的6重量％的NH3。蒸汽導入到靠近容器的頂部以提升容器內部溫度至145°C。保持這一溫度20分鐘。在預處理末期，通過排氣冷凝器將反應器壓力降至大氣壓。隨后施用真空(大約小于latm)15分鐘以降低溫度至小于60°C。表2給出了每個前處理批次的最終％的固體，連同使用不同前處理批次的發酵批次。表2 :玉米芯，預處理和發酵批次。
玉米芯水分％預處理批次最終固體重量％ 發酵批次
5.9SSL 9537 7
5.9SSL 1065 7權利要求
1.糖漿，包含至少約40重量％的固體并具有小于約100厘泊的粘度；其中所述糖漿是液體部分蒸發的產品，所述液體部分來自木質纖維素生物質水解產物發酵液或產品枯竭的木質纖維素生物質水解產物發酵液的液體/固體分離。
2.權利要求I的糖漿，其中所述木質纖維素生物質水解產物發酵液包含目標產品，所述目標產品選自酸、醇、烷烴、烯烴、芳烴、醛、酮、生物聚合物、蛋白質、肽、氨基酸、維生素、抗生素和藥物。
3.權利要求2的糖漿，其中所述目標化合物選自乙醇、丁醇和1，3_丙二醇。
4.權利要求I的糖漿，其中所述木質纖維素生物質水解產物發酵液是由生物質產生的，所述生物質選自柳枝稷、廢紙、來自造紙業的淤渣、玉米芯、玉米殼、玉米秸桿、小草、小麥、小麥稻桿、干草、大麥稻桿、稻桿、甘鹿洛、從谷物的加工中獲得的組分、樹木、枝條、根、葉片、木片、木屑、灌木和灌叢、蔬菜、水果以及花。
5.權利要求I的糖漿，其中所述固體百分數為至少約45%。
6.權利要求I的糖漿，其中所述固體百分數為至少約50%。
7.生產目標產品的方法，包括 a)提供包含目標產品的木質纖維素生物質水解產物發酵液； b)通過蒸餾從(a)的木質纖維素生物質水解產物發酵液中移除所述目標產品以產生全釜餾物； c)將來自(b)的全釜餾物的液體和固體部分分離以產生包含小于約O.I重量％的懸浮固體的稀釜餾物；以及 d)蒸發(C)的稀釜餾物以產生糖漿，所述糖漿包含至少約40重量％的固體并具有小于約100厘泊的粘度。
8.權利要求7的方法，其中所述目標產品選自乙醇、丁醇和1，3_丙二醇。
9.權利要求7的方法，其中所述糖漿被消耗而無需進一步干燥。
10.權利要求7的方法，其中來自蒸發所述稀釜餾物的水是循環利用的。
11.權利要求7的方法，其中(a)的木質纖維素生物質水解產物發酵液、或所述枯竭的發酵液、或(b)的全釜餾物具有約6或更低的pH。
12.權利要求7的方法，其中在約70°C和約150°C之間的溫度下，在約30秒和約210分鐘之間，對(a)的木質纖維素生物質水解產物發酵液、或所述枯竭的發酵液、或(b)的全釜餾物進行熱處理，所述熱處理的時間和溫度是負相關的。
13.權利要求7的方法，其中所述木質纖維素生物質水解產物發酵液是由生物質產生的，所述生物質選自柳枝稷、廢紙、來自造紙業的淤渣、玉米芯、玉米殼、玉米秸桿、小草、小麥、小麥稻桿、干草、大麥稻桿、稻桿、甘鹿洛、從谷物的加工中獲得的組分、樹木、枝條、根、葉片、木片、木屑、灌木和灌叢、蔬菜、水果以及花。
14.權利要求7的方法，其中所述糖漿的固體百分數為至少約45%。
15.權利要求7的方法，其中所述糖漿的固體百分數為至少約50%。
全文摘要
木質纖維素生物質水解產物發酵液可以被加工以產生具有相對低粘度的高固體糖漿，所述高固體糖漿具有高能量含量并在發酵生產過程中可以被消耗。通過對發酵液或枯竭的發酵液的液體/固體分離，產生具有低懸浮固體的稀釜餾物，在維持低粘度的同時允許蒸發至高固體，獲得高固體糖漿。
文檔編號C12P19/12GK102858989SQ201180017648
公開日2013年1月2日 申請日期2011年4月27日 優先權日2010年4月28日
發明者S.M.亨內塞伊, R.B.卡薩特 申請人:納幕爾杜邦公司