專利名稱：一種植物氣孔特異性啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物氣孔特異性啟動子及其應用。
背景技術：
啟動子(Promoter)是基因組基因的一個重要組成部分，它像“開關” 一樣，在轉錄水平上基本決定其控制下的編碼基因是否表達、何時表達、何處表達和表達強度。一般根據啟動子作用方式和功能將其大體可以分為三大類組成型啟動子、特異性啟動子和誘導型啟動子(王關林，方宏筠，2002，植物基因工程原理與技術(第二版)，北京，科學技術出版社)。但這種分類不是絕對的，在某些情況下，一種類型的啟動子往往兼有其它類型啟動子的特性，例如，誘導增強性組成型啟動子(肖興國等，發明專利號200710177962. 4)。組成型啟動子(Constitutive promoter)是指能夠驅使其控制下的編碼基因在不同器官和/或組織大體恒定表達的一類啟動子。它的特點是受其控制的編碼基因的表達具有持續性，但不具有時空特異性；RNA和蛋白質表達量相對恒定，不受外界因素的誘導。 例如花椰菜花葉病毒 35S 啟動子 CaMV35S(0dell et al.，Nature，1985，313 :810_812)、 玉米 Ubiquitin 啟動子(Holtorf et al.，Plant Mol. Biol.，1995，29 :637_646)和水稻的 Actinl 啟動子(McElroy et al，1990，Plant Cell, 2 :163_171)。誘導型啟動子(Inducible promoter)是指能夠響應某些特定的物理、化學和生物信號(統稱為“誘導子”或“誘導因子”)而驅動其控制的編碼基因大幅度地增加轉錄水平的一類啟動子。它的特征為，在沒有誘導因子存在的條件下，它控制的編碼基因不表達或者只有非常低的表達(也稱為“本底表達”)，但一旦受到誘導因子的誘導，基因的表達量迅速并且大幅度增加。誘導型啟動子常常根據其誘導信號來分類和命名，例如真菌誘導啟動子、共生細菌誘導啟動子、化學誘導啟動子、金屬離子誘導啟動子、光誘導啟動子、熱誘導啟動子和創傷誘導啟動子等。器官和/或組織特異性啟動子(0rgan-and/or Tissue-specific promoter)，能夠驅使其控制下的編碼基因僅僅在生物體的某一或某些特定的器官和/或組織，或者僅僅在生長發育的某一或某些特定階段表達的一類基因。它的特征為，受其控制或調節的基因表達具有明顯的時空性，并往往表現出發育調節的特性。例如，植物上的根特異性啟動子、葉片特異性啟動子、花特異性啟動子、氣孔特異性啟動子、氣孔絨氈層特異性啟動子、花粉特異性啟動子、果實特異性啟動子、種子特異性啟動子、胚乳特異性啟動子、棉花纖維特異性啟動子和韌皮部特異性啟動子等等。氣孔(Stomatal pore)是植物與外界環境進行氣體交換的門戶，也是水分蒸騰的通道。植物進行光合作用所必需的CO2依靠氣孔進入體內，而呼吸作用所產生的O2則依靠氣孔排除到體外。此外，植物的水分蒸騰也依靠氣孔作為主要通道。因此，氣孔的開關控制著植物的蒸騰作用、光合作用和呼吸作用等重要生理過程。一般植物的氣孔 由一對保衛細胞組成，有些植物中還有副衛細胞(Subsidiary cells)圍繞著這一對保衛細胞，組成氣孔復合體(Stomatal complex)或稱氣孔器(Stomaltal apparatus) 0氣孔分布在植物的地上部分，主要集中在葉片。組成氣孔的保衛細胞是一種高度分化的細胞，在大多數雙子植物和一些單子葉植物、裸子植物、蕨類和蘚類上呈腎形，而在禾本科植物和幾種苔草上則呈啞鈴形。保衛細胞的體積比葉表皮細胞和葉肉細胞的體積小得多。它的細胞壁按其和相鄰細胞的相對位置而命名背壁(Dorsal wall)，指和表皮細胞相鄰的壁；腹壁(Ventral wall)，與背壁相對、近孔處的壁；外側壁 (Outer lateral wall)，靠葉片外表面的壁；內側壁(Inner lateral wall)，靠氣孔下腔的壁。保衛細胞的壁各處厚薄不均，一般背壁薄而腹壁特別加厚。這樣，在細胞膨壓大時， 保衛細胞呈彎月形，氣孔開放；在細胞膨壓小時，保衛細胞呈直腎形或圓柱形，氣孔關閉 (Wilmer and Fricker，1996，Stomata，Ed Chapman and Hall，London，1-375)。保衛細胞正是通過自身的膨壓大小的改變而改變自身體積的大小和形狀來調控氣孔的開、關和張開程度以應對其感受的外界環境中的生物和非生物刺激(例如々8々、0)2和干旱等)以及由自身植物根傳來的信號(Bergmann and Sack FD, 2007, Annu Rev Plant Biol，58 :163_81)。 引起這種自身的膨壓大小的改變及由此導致的自身體積大小和形狀的改變的機理，一般認為，主要是通過細胞膜和液泡膜的一些通道蛋白進行的跨膜離子和水的運輸(Pandey et al.,2007, FEBS Lett,581 2325-36 ；Schroeder et al.，2001，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，52 :627_58)。在C3和C4植物上，能夠引起氣孔開放的主要環境因子有 藍光、紅光、高濕和低 CO2 (Marten et al，2007，Plant J, 2007. 50 129-139 ；Shimazaki et al, 2007, Annu Rev Plant Biol，58 :219_47)；能夠引起氣孔關閉的主要環境因子有黑暗、干旱、高 CO2 和高臭氧濃度(Sirichandra et al，2009，J Exp Bot，60 1439-63)。此夕卜，內源激素 ABA 能夠引起氣孔關閉(Wilkinson and Davies，2002，Plant Cell Env,25 195-210 ；Israelsson M et al, 2006，Curr Opin Plant Biol，9 :654_63)，其它激素，如生長素、激動素、乙烯、芥末酸和油菜素內酯，對氣孔的開關也都有一定的影響(Acharya and Assmann，2009，Plant Mol Biol. 69 :4451_4462 ；Kim et al，2010，Annu Rev Plant Biol, 61 561-591)氣孔運動(開和關)是一個非常復雜的生理過程，有人認為它是植物適應環境變化的一種主動調節，也有人認為是被動調節，并且都有一定的實驗結果作為支撐。無論是主動調節還是被動調節，人們都希望從調控氣孔開關運動入手，提高植物的節水抗旱能力和光合效率[李軍等，中國科學C輯生命科學，2004，34 (4) :299-303]，從而提高植物、特別是作物的產量和品質。為此，鑒定、分離和功能研究保衛細胞特異性基因及其主要調控者-啟動子的研究在全世界展開。Zhao 等從 22000 多株擬南芥(Arabidopsis thaliana)中分離到 3X IO8 個保衛細胞葉綠體，由此鑒定出1734種獨特蛋白[Zhao et al. 2008，Plant Cell,20(12) 3210-3226]。一些保衛細胞優勢表達和/或特異性表達的蛋白和/或其編碼基因，如擬南芥 Aktl (Sentenac et al, 1992, Science，256 :663_665)、Katl (Anderson et al, 1992, PNAS，89 3736-3740)和 TPCl(Rienmuller et al，2010，Plant and Cell Physiol,51 91548-91554)以及馬鈴薯Kstl (MulIer-Roeber et al, 1995,EMBO J, 14 2409-2416)等陸續被鑒定和/或克隆。隨著這些基因的克隆，其主要調控區域_啟動子的鑒定、分離、重組和功能研究方面，近年來取得了明顯的進展。例如，Katl啟動子(Nakamura et al,1995, Plant Physiol, 109 :371-374)、Kstl (Plesch et al，2000，Gene, 249 :83 89)、Abhl 啟動子(Hugouvieux et al.，Cell, 2001,106 :477_487)、Chll 啟動子(Guo et al.，Plant Cell，2001，13 :1761-1777)、0sml 啟動子(Zhu et al. ,Plant Cell，2002，14 :3009_3028)、 Ostl 啟動子(Mustilli et al.，Plant Cell，2002，14 :3089_3099)，Racl (Lemichez et al.，Genes Dev.，2001，15 :1808_1816)、SLACl 啟動子(Vahisalu et al，2008，Nature， 452 :487-491)、CDeT6-19啟動子以及擬南芥單加氧酶基因CYP86A2啟動子(Taylor et al, 1995,Plant Journal,7(1) 129-134 ；Galbiati et al,2008,Plant Journal, 53 750-762. Francia et al，2008，Plant Signaling & Behavior，3 (9) :684_686)等。然而，這些啟動子雖然能夠驅動其控制的基因在氣孔強勢表達，但同時也在它組織和器官有不同程度的表達。也就是說，它們還缺乏氣孔表達的特異性。

發明內容
本發明的目的是提供一種植物氣孔特異性啟動子及其應用。本發明所提供的植物氣孔特異性啟動子來源于海島棉(Gossypium barbadense L.)，是下述a)或b)或c)的DNA片段a)3'端至少含有序列表中序列1的第529-993位核苷酸序列(GbSLSP_F5)，并且從序列1的第529位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為465 至993bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的 DNA片段；c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。所述嚴格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次 5min. 0. 5X SSC, 0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次15min。所述啟動子的最后一位核苷酸是序列1的第993位。所述啟動子為下述1)-3)中任一種1)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第511-993位核苷酸序列 (GbSLSP-F4)，并且從序列1的第511位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為483至993bp的任意一個DNA片段；2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第401-993位核苷酸序列 (GbSLSP-F3)，并且從序列1的第401位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為593至993bp的任意一個DNA片段；3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第346-993位核苷酸序列 (GbSLSP-F2)，并且從序列1的第346位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為648至993bp的任意一個DNA片段。在本發明的實施例中，所述啟動子具體為下述al)_a5)中任一種 al)核苷酸序列為序列表中序列1所示的DNA分子(GbSLSP)；a2)核苷酸序列為序列表中序列1的第346-993位核苷酸所示DNA分子 (GbSLSP-F2)；a3)核苷酸序列為序列表中序列1的第401-993位核苷酸所示DNA分子(GbSLSP-F3)a4)核苷酸序列為序列表中序列1的第511-993位核苷酸所示DNA分子 (GbSLSP-F4)；a5)核苷酸序列為序列表中序列1的第529-993位核苷酸所示DNA分子 (GbSLSP-F5)。本發明提供的植物氣孔特異性啟動子，還可以是下述d)或e)或f)的DNA片段d) 3 ‘端至少含有序列表中序列1的第346-634位核苷酸序列(GbSLSP-SH)，并且從序列1的第346位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為289 至634bp的任意一個DNA片段；所述啟動子的最后一位核苷酸是序列1的第634位；e)與d)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的 DNA片段；f)在嚴格條件下與d)或e)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。所述嚴格條件是在2XSSC，0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次 5min. 0. 5X SSC, 0. 1% SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次15min。在本發明的實施例中，所述啟動子具體為下述bl)或b2 bl)核苷酸序列為序列表中序列1的第1-634位核苷酸所示的DNA分子 (GbSLSP-SH)；b2)核苷酸序列為序列表中序列1的自第346-634位核苷酸所示DNA分子 (GbSLSPF2-SH)。對GbSLSP啟動子(序列表中序列1)進行5’端刪除分析得到的仍然具有氣孔特異性驅動能力的啟動子序列。其中，GbSLSP-F5(序列表中序列1的第529-993位核苷酸) 為GbSLSP啟動子5’端刪除直到轉錄起始位點(序列表中序列1自5'端第625位核苷酸) 上游96bp仍具有氣孔特異性啟動子活力的小片段，是GbSLSP啟動子的核心片段。對GbSLSP(序列表中序列1)進行3'端刪除分析得到的仍然具有氣孔特異性驅動能力的啟動子序列。其中，GbSLSPF2-SH(序列表中序列1的第346-634位核苷酸序列)為 GbSLSP啟動子3'端刪除直到距離轉錄起始位點(序列表中序列1自5'端第625位核苷酸)9bp仍具有氣孔特異性啟動子活力的小片段。GbSLSP啟動子由993個脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1，其中第594-599位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第625位脫氧核苷酸為轉錄起始位點，第 626-993位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(5‘ -UTR)。GbSLSP_F2啟動子由648個脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1的第 346-993位。其中序列1的第594-599位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第625位脫氧核苷酸為轉錄起始位點，第626-993位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(5‘ -UTR)。GbSLSP_F3啟動子由593個脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1的第 401-993位。其中序列1的第594-599位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第625位脫氧核苷酸為轉錄起始位點，第626-993位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(5‘ -UTR)。GbSLSP_F4啟動子由483個脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表中序列1的第 511-993位。其中序列1的第594-599位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第625位脫氧核苷酸為轉錄起始位點，第626-993位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(5' -UTR)。GbSLSP-F5啟動子由465個脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表序列1的第 529-993位。其中序列1的第594-599位脫氧核苷酸為TATA盒(TATAbox)，第625位脫氧核苷酸為轉錄起始位點，第626-993位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(5‘ -UTR)。GbSLSP-SH啟動子由634個脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表序列1的第 1-634位。其中序列1的第594-599位脫氧核苷酸為TATA盒(TATAbox)，第625位脫氧核苷酸為轉錄起始位點，第626-634位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(5‘ -UTR)。GbSLSPF2_SH啟動子由289個脫氧核苷酸組成，其核苷酸序列為序列表序列1的第 346-634位。其中序列1的第594-599位脫氧核苷酸為TATA盒(TATA box)，第625位脫氧核苷酸為轉錄起始位點，第626-634位脫氧核苷酸為5'端非翻譯區(5‘ -UTR)。從海島棉(Gossypium barbadense)中分別克隆得到GdSLSP全長啟動子，并對其進行功能分析，產生了本發明。含有上述啟動子的遺傳材料或獲得所述啟動子的一個引物對也屬于本發明的保護范圍。所述遺傳材料為表達盒、重組表達載體、重組菌、轉基因植物細胞或組織或器官在所述表達盒中，所述氣孔特異性啟動子的下游連接結構基因，或調節基因，或結構基因或調節基因的反義基因，或者能夠干擾內源基因表達的小RNA的編碼DNA，用于驅動結構基因，或調節基因，或結構基因或調節基因的反義基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表達。所述重組表達載體是含有上述表達盒，例如但不限于質粒和病毒。所述重組表達載體也可為重組植物表達載體。所述重組植物表達載體含有上述表達盒并且能夠將所述的表達盒轉送進入植物宿主細胞、組織或器官及其后代并且能夠或者至少方便所述的表達盒整合到宿主的基因組中，它包括但不限于雙元載體、共合載體。在本發明的實施例中，所述重組表達載體具體為在PBI121質粒的多克隆位點插入所述啟動子的核苷酸序列得到的重組質粒。所述重組表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導或基因槍等常規生物學方法轉化植物器官或組織或細胞，得到轉基因植物細胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無性系或其后代。在本發明的實施例中，具體使用的是農桿菌介導法。在本發明的實施例中，所述引物對具體為下述cl)_c5)中的任一對cl)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段組成的引物對；c2)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列5的第7_21位核苷酸所示DNA片段組成的引物對；c3)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列6的第7_28位核苷酸所示DNA片段組成的引物對；c4)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列7的第7_34位核苷酸所示DNA片段組成的引物對；c5)序列表中序列8的第7-22位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段組成的引物對。所述啟動子在植物中啟動目的基因表達中的應用也屬于本發明的保護范圍。
所述植物是陸生植物，優選是雙子葉植物，更優選是擬南芥或煙草；所述表達為氣孔特異性表達。實驗證明，本發明所提供的啟動子(包括GbSLSP-F2、GbSLSP-F3、GbSLSP-F4)均可啟動報告基因GUS和/或GFP (綠色熒光蛋白)在煙草和/或擬南芥的氣孔中特異表達，說明本發明所提供的啟動子具有良好的氣孔特異性。同時經相關實驗還證明該特異性能夠穩定地傳遞給后代。將本發明的啟動子下游銜接內源基因、外源基因及其反義基因或能夠干擾內源基因表達的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)的編碼DNA，構建表達盒并與不同的表達載體連接，轉化到植物中，利用其氣孔異性表達活性，在氣孔中特異性表達其控制或指導的所述內源基因、外源基因及其反義基因或小RNA。在轉基因植株中使其內源基因、外源基因及其反義基因或能夠干擾內源基因表達的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)的表達局限于氣孔中，排除了這些基因在植體其它組織或器官的表達。利用本發明的啟動子的氣孔特異性表達活性，用含有本發明啟動子或該啟動子與內源基因與外源基因及其反義基因、能夠干擾內源基因表達的小RNA(包括天然的和人工合成的小RNA)編碼DNA的表達載體轉化宿主細胞或宿主組織及其后代細胞，并由此再生完整的轉基因植株，培育耐旱、耐高或低濃度CO2、抗真菌病害和高光合效率的植物或作物品種。所述植物是顯花植物，包括但不限于陸生植物、被子植物和裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物、草本植物、藤本植物和木本植物、園林園藝植物和農作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物以及有性和無性繁殖植物，優選為陸生植物。本發明的氣孔特異性啟動子可用于功能分析、鑒定和分離植物氣孔形成和發育所必須的基因和調控氣孔運動的基因，同時可以用于培育耐旱、耐高或低CO2、抗真菌病害、高光合效率和高產優質的植物或作物品種。具體可在本發明的氣孔特異性啟動子下游銜接異源或同源基因或其反義基因或小RNA編碼DNA，并構建到植物表達載體，轉化宿主植物，在其氣孔表達目的蛋白、抑制或干擾目標基因的轉錄或翻譯，以開或關氣孔或者增強或降低氣孔的開關程度。本發明分離的氣孔特異性啟動子對植物氣孔生長和發育基因的功能分析和鑒定、培育耐旱、耐高或低CO2、抗真菌病害、高光合效率和高產優質的植物或作物品種等都具有重大的應用前景。本發明這不僅對氣孔和保衛細胞的分子生物學研究和氣孔運動等的理論研究具有重要的意義，而且在培育抗旱和抗病作物而去提高作物的光合效率進而提高產量和品質等方面具有重大的應用價值和廣闊的市場前景。


圖1為GbSLSP啟動子全長克隆的PCR產物電泳圖。其中泳道M為分子量標記 λ DNA/EcoRI+Hind III ；泳道1為引物1和引物2雙引物PCR擴增產物；泳道2為引物1單弓丨物PCR擴增產物；泳道3為引物2單引物PCR擴增產物；泳道4為無模板DNA的雙引物 PCR擴增對照。圖2為外加酶切位點的GbSLSP啟動子全長序列圖。其中，下劃線部分為外加的限制性內切酶識別位點(5'端為Hind 111,3'端為BamH I)；方框處為TATA盒；加粗帶底紋的“A”為轉錄起始位點；加粗斜體的堿基為序列自身的Hind III酶切位點。圖3為氣孔特異性啟動子GbSLSP驅動報告基因⑶S或GFP的植物表達載體圖譜。 A為GbSLSP驅動報告基因GUS的植物表達載體，其中pGbSLSP-GUS表示pBI-GbSLSP-GUS， B為GbSLSP驅動報告基因GFP的植物表達載體，其中pGbSLSP-GFP表示pBI_GbSLSP_GFP。圖4為轉pBI-GbSLSP-GUS的煙草Ttl代植株PCR鑒定 圖。其中，泳道M為DNA大小分子標記λ DNA/EcoR I+Hind III ；泳道1_8為轉基因煙草Ttl代8個獨立的單株；泳道9 為載體質粒(pBI-GbSLSP-GUS)對照；泳道10為未轉基因的煙草NC89對照；泳道11為蒸餾水為模板的對照。圖5為轉pBI-GbSLSP-GUS擬南芥T1代植株的PCR鑒定圖。其中，泳道M為DNA 大小分子標記λ DNA/EcoR I+Hind III ；泳道1_8為轉基因擬南芥T1代8個獨立的單株 (其中泳道1、4、5、6、7對應的T1代擬南芥植株為GbSLSP陽性植株)；泳道9為載體質粒 (pBI-GbSLSP-GUS)對照；泳道10為未轉基因的擬南芥對照；泳道11為蒸餾水為模板的對照。圖6為轉pBI-GbSLSP-GUS煙草Ttl代植株的葉片圓盤的⑶S染色圖。其中，A為轉 pBI-GbSLSP-GUS煙草Ttl代植株的葉圓盤；a為A所示葉圓盤的局部放大照片。圖7為轉pBI-GbSLSP-GUS煙草T1代植株幼苗⑶S染色圖。其中A為 pBI-GbSLSP-GUS煙草T1代幼苗整株的⑶S染色照片；a為A所示幼苗對應株的真葉⑶S染色的局部放大照片。圖8為轉pBI-GbSLSP-GUS擬南芥T1代植株不同器官的⑶S染色圖。其中，A為花序；B為花；C為柱頭；D為花藥；E為莖；F為花梗；G為花萼；H為果夾；I為葉片J為I的局部放大照片。 圖9為轉pBI-GbSLSP-GFP基因煙草Ttl代植株葉片的GFP共聚焦激光掃描顯微圖。圖10為氣孔特異性啟動子GbSLSP的5'端刪除和3'端刪除不同長度后的各個片段(GbSISP-F2、GbSISP-F3、GbSLSP_F4、GbSLSP_F5、GbSLSP-SH 和 GbSISPF2_SH)與全長啟動子(GbSLSP)之間的關系示意圖。其中，位于轉錄起始位點(TSS)上游(即左端)的數據-X表示GbSLSP經過5'端刪除后殘留的核苷酸片段的長度。圖11氣孔特異性啟動子GbSLSP 5'端刪除和3'端刪除不同長度后的各個片段連接在PBS-T載體上的酶切電泳圖。其中，泳道Ml和M2分別為DNA分子量標記λ DNA/ EcoRI+Hindlll 和 Marker I (IOObp 標記)；泳道 1 至 7 分別為 pBS-GbSLSP、pBS-GbSLSP_SH、 pBS-GbSLSP-F2、pBS-GbSLSP-F3、pBS-GbSLSP-F4、pBS-GbSLSP-F5 的 Hind III 和 BamH I 雙
酶切結果。圖12為氣孔特異性啟動子GbSLSP 5'端刪除和3'端刪除不同長度后的各個片段連接到PBI121載體上的PCR鑒定電泳圖。其中，泳道Ml和M2分別為DNA分子量標記 λ DNA/EcoRI+HindIII 和 Marker 1 (IOObp 標記)；泳道 1 至 7 分別為 pBI-GbSLSP、 pBI-GbSLSPF2、 pBI_GbSLSP_SH、 pBI_GbSLSPF3、 pBI_GbSLSPF4、 pBI_GbSLSPF5、 pBI-GbSLSPF2-SH 的 PCR 產物電泳圖。圖13為轉GbSLSPX-⑶S (F = 2、3、4、5、-SH或F2-SH)基因煙草Ttl代植株葉片和花的⑶S染色圖。其中，F2表示GbSLSPF2-GUS在轉基因煙草Ttl代植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖；F3表示GbSLSPF3-GUS在轉基因煙草Ttl代植株驅動⑶S基因表達的⑶S 染色圖；F4表示GbSLSPF4-GUS在轉基因煙草Ttl代植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖； F5表示GbSLSPF5-GUS在轉基因煙草Ttl代植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖；F-SH表示GbSLSP-SH-GUS在轉基因煙草Ttl代植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖；F2-SH表示 GbSLSPF2-SH-GUS在轉基因煙草Ttl植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖。F2至F2-SH共6 個系列圖中，均是左側(A)為葉盤的GUS染色圖，中間(a)為左側(A)圖片的局部放大圖， 右側⑶為花的GUS染色圖。圖 14 為轉 GbSLSPX-GUS (F = 2、4、5、-SH 或 F2-SH)基因煙草 T1 代幼苗的 GUS 染色圖。其中，F2表示GbSLSPF2-GUS在轉基因煙草T1代植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖；F4表示GbSLSPF4-GUS在轉基因煙草T1代植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖； F5表示GbSLSPF5-GUS在轉基因煙草T1代植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖；F-SH表示GbSLSP-SH-GUS在轉基因煙草T1代植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖；F2-SH表示 GbSLSPF2-SH-GUS在轉基因煙草T1代植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖。上述F2至F2-SH 的5個系列圖中，均是上方(A)為轉基因煙草T1植株幼苗整株的GUS染色圖，下方(B)為上方(A)的真葉局部放大圖。圖15為轉GbSLSPX-⑶S (X = 2,5)基因擬南芥T1代植株不同器官的氣孔特異性表達的⑶S染色圖。其中，F2表示GbSLSPF2-GUS在轉基因擬南芥T1代植株驅動⑶S基因表達的⑶S染色圖；F5表示GbSLSPF5-GUS在轉基因擬南芥T1代植株驅動⑶S基因表達的 GUS染色圖。A為花絮；B為花；C為柱頭；D為花藥；E為莖；F為花梗；G為花萼；H為果夾； I為葉片。圖16為轉GbSLSPF2_GUS基因擬南芥1~2代幼苗⑶S染色圖。其中，A為幼苗整株； B為子葉；b為B的局部放大圖；C為真葉；c為C的局部放大圖。圖17轉GbSLSPX-GFP (F = 2、3、4、5、-SH或F2-SH)基因煙草Ttl代植株葉片氣孔特異性表達的GFP共聚焦激光掃描顯微圖。其中，A表示GbSLSPF2-GFP在轉基因煙草Ttl代植株驅動GFP基因表達的共聚焦激光掃描顯微圖；B表示GbSLSPF3-GFP在轉基因煙草Ttl代植株驅動GFP基因表達的共聚焦激光掃描顯微圖；C表示GbSLSPF4-GFP在轉基因煙草Ttl代植株驅動GFP基因表達的共聚焦激光掃描顯微圖；D表示GbSLSPF5-GFP在轉基因煙草Ttl代植株驅動GFP基因表達的共聚焦激光掃描顯微圖；E表示GbSLSP-SH-GFP在轉基因煙草Ttl 代植株驅動GFP基因表達的共聚焦激光掃描顯微圖；F表示GbSLSPF2-SH-GFP在轉基因煙草Ttl代植株驅動GFP基因表達的共聚焦激光掃描顯微圖。圖18為用于構建GbSLSPX-GFP (F = 2、3、4、5、_SH或F2-SH)系列載體所用的GFP 基因的核苷酸序列。
具體實施例方式本發明中所述的啟動子核苷酸序列可以是其中一個或多個核苷酸發生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分離的核苷酸序列的人工突變體或“天然”突變體，它保留其啟動子功能；還可以是所述的核苷酸序列與其它啟動子序列或啟動子區保守調控序列 (“motif”或“box”)的融合序列。本發明中所述的“啟動子”為具有TATA盒(TATAbox)的啟動子；TATA盒或類似區域，定位于轉錄起始位點(TSS，在核苷酸計數上為“+1”)上游并且具有指導RNA聚合酶在正確位置上啟動轉錄的功能，但不限于該區域附近的部分；此外，它還可含有與除RNA聚合酶以外的蛋白質相關聯的用于調節表達的另一個必須區域。本發明中所述的“啟動子區域”定義為含有上文中定義的啟動子的區域和轉錄起始位點下游至少 10個核苷酸的區域。本發明中所述的“啟動子活性”是指當以某種基因的可表達方式將其連接到啟動子的下游，并導入到宿主中，該宿主顯示具有在宿主內或宿主外生產該基因產物的能力和功能時，該啟動子具有啟動活性。通常，是將編碼容易定性或定量檢測的蛋白質的基因(例如，報告基因)連接到該啟動子的下游，將該基因導入宿主內，并檢測所表達的蛋白質，可確定特定啟動子的活性或是否存在該啟動子或者該啟動子的效力。本發明中所述的結構基因是指能夠編碼某種蛋白質或其它活性物質功能的一段核苷酸序列，包括RNA 或DNA序列。所述的調節基因是指其編碼的某種RNA或蛋白質或其它活性物質能夠對其它結構基因的表達進行調節或調控的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的正義基因包括上述的結構基因和調節基因。所述的反義基因是指與上述結構基因或調節基因編碼的RNA互補的RNA或DNA序列。所述的內源基因是指來自宿主自身的基因，包括RNA或DNA 序列。所述外源基因是指任何一段核酸序列，并具有編碼某種蛋白質或其它活性物質功能， 包括天然的和人工合成的RNA或DNA序列，該序列與氣孔特異性啟動子在正常情況不相結合。所述的小RNA是指分離自生物體的或人工合成的RNA序列片段，其長度通常為20-26 個脫氧核苷酸或者在導入宿舍細胞后能夠被剪切成20-26個脫氧核苷酸的RNA片段，它本身對生物體無毒或毒性極低本發明中所述的轉化是指現有技術中已知的、能夠將外源基因導入植物細胞或植物組織的任何一種植物轉化方法，如農桿菌介導法和基因槍等。本發明中所述的宿主細胞或宿主組織或宿主器官及其后代細胞是指所有植物細胞或植物組織或植物器官或由這些細胞、組織或器官通過組織分化或無性胚再生并且發育成熟的整體植株(包括種子)。術語“核酸序列，，或“核苷酸序列，，指含有天然存在的核苷酸或核苷單體的序列。 該序列也包括具有相似功能的非天然存在的單體或其部分的修飾的或取代的序列。術語“氣孔特異性啟動子”是指能夠指導其控制下的基因僅僅在氣孔表達而在植體的其它組織不表達或按照常規方法檢測不到表達的啟動子。術語“具有75%或75%以上同源性的序列”是指與上述啟動子的核苷酸序列相比有75%或75%以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，這些序列以基本相同的方式發揮作用并且能夠驅動其下游基因的氣孔特異性表達，它們與上述啟動子中序列的差異可能是由于局部結構上的修飾或突變，包括人工突變和非人工突變。術語“嚴謹雜交條件”是指本領域技術人員已知的，或者可以在分子生物學或基因工程實驗指南，例如《Molecular Cloning》GlrdEd) (Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001)(以下簡稱“《分子克隆》第三版”)中的通用方案中找到，具體為在2XSSC，0. SDS的溶液中，在68°C下雜交并洗膜2次。每次5min. 0. 5X SSC, 0. 1% SDS的溶液中，在68 °C下雜交并洗膜2次。每次15min。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。煙草Ttl代表示由愈傷組織得到的轉基因植株及其無性系,T1表示Ttl代自交產生的種子及由它所長成的植株和無性系；擬南芥T1代表示通過直接“蘸花”侵染后產生的種子發芽形成的植株及其無性系。實施例1、海島棉氣孔特異啟動子SLSP(GbSLSP)的克隆與分離1、海島棉總DNA的提取
材料取自海島棉(Gossypium barbadense L.)品種“SHZ2-214”(從新疆石河子大學購得)，嫩葉片l_2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取總DNA。取1_5 μ 1 DNA樣品，用紫外分光光度計測量其濃度和純度，用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和完整性。將提取的DNA于-20°C保存。2、PCR擴增與擴增片段的回收設計并合成如下兩條引物(引物1和引物2)擴增海島棉氣孔特異性啟動子，為了方便以后的克隆和構建，在兩條引物的5'端分別加入了限制性內切酶Hind III和BamH I 的識別序列位點(下列引物序列中的下劃線序列)引物 1 :5 ‘ -AAGCTTACAACTTTTCTCTACCAATCA-3 ‘ (Hind III)(序列 2)；引物 2 5 ‘ -GGATCCGCTAGAGAAAAATGGGAAGGTGAG-3 ‘ (BamH I)(序列 3)。以步驟1提取的棉花基因組DNA為模板，進行PCR反應反應體系為模板DNA 800ng ； 10 XEx buffer 2 μ 1 ；dNTP 混合物(2. 5mM) 2 μ 1 ； ExTaq DNA Polymerase (5U/μ 1)0. 5μ 1 ；引物 1(10μΜ)2μ 1 ；引物 2 (10 μ Μ) 2 μ 1 ；無菌重蒸餾水(SddH2O)補足至20 μ 1。PCR反應程序先94°C預變性5min ；然后94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 Imin, 30個循環。PCR結果如圖1所示，PCR反應完成后，取15 μ 1擴增產物經1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下快速用一次性刀片小心切下位于DNA標記IOOObp左右的特異片段，用DNA片段回收試劑盒回收并純化(北京鼎國公司產品)，溶于50μ1 ddH20中，-20°C保存備用。3、回收片段的亞克隆與測序采用兩步連接法將上述步驟2回收的片段插入到載體pBS-T載體(北京天根公司產品)。具體操作為用Hind III和BamH I雙酶切上述步驟2回收的片段，得到大小約為650bp和350bp的兩條帶(由于回收片段(序列如圖2所示)內部含有一個HindIII 酶切位點)。先回大小約為650bp的片段(Hind III和BamH I之間的片段)，插入經過 HindiII-BamHI雙酶切的pBS_T載體，形成pBS_Gb650 ；然后回收兩個Hind III之間的大小約為350bp的片段，插入經過Hind III單酶切的pBS_Gb650，形成pBS_Gb650+350，通過測序鑒定插入方向。將得到的重組質粒(pBS_Gb650+350)通過“凍融法”轉化到大腸桿菌菌株DH5 α 感受態細胞。轉化的DH5 α在表面涂有IPTG和Χ-gal的含氨芐青霉素50mg/L的LB固體培養基上于37°C過夜培養，挑取平板上生長的白色菌落，接入氨芐青霉素50mg/L的LB液體培養基中于37°C過夜培養。當菌液濃度達到0D_為0. 8時，離心收集菌體，按小量堿裂解法(《分子克隆》第三版)提取質粒，用限制性酶Hind III和BamH I雙酶切后，用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可見分子大小大約分別為3000bp(載體帶)、650bp(目標帶 1)和350bp(目標帶2)三條帶。將酶切驗證正確的克隆和由此克隆提取的質粒送交商業測序公司測序。將測序正確的載體命名為pBS-GbSLSP，其中插入片段(目標帶1+目標帶2=IOOObp)命名為GbSLSP。GbSLSP的測序結果如圖2所示，在5'端和3'端分別含有引物1和引物2的序列，表明pBS-GbSLSP中確實含有上述由海島棉擴增的DNA片段GbSLSP。 GbSLSP的核苷酸序列為序列表中序列1。實施例2、海島棉氣孔特異性啟動子(GbSLSP)驅動⑶S基因或GFP基因植物表達載體的構建兩步連接法將pBS-GbSLSP用限制性內切酶Hind III和BamH I雙酶切后，用 1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，切取約650bp和約350bp的兩條目標帶，用DNA片段回收試劑盒 (北京鼎國公司產品)回收并純化。將純化后約650bp的目標帶(目標帶1)與經過Hind III和BamH I雙酶切的植物表達載體pBI121質粒(原Clontech公司產品)的大片段 (大約為13. 9kb)相連，得到的重組質粒命名為pBI-Gb650 ；再將純化后約350bp的目標帶(目標帶2)與經過Hind III單酶切的重組質粒pBI-Gb650相連，得到轉化用重組質粒 pBI-Gb650+350。將上述得到的轉化用重組質粒(pBI_Gb650+350)用“凍融法”(《分子克隆》第三版)轉化到大腸桿菌菌株DH5 α。轉化的DH5 α在表面涂有IPTG和X_gal的含卡那霉素 50mg/L的LB固體培養基上于37°C過夜培養，挑取平板上生長的單菌落，接入含卡那霉素 50mg/L的LB液體培養基中于37°C振蕩過夜培養。當菌液濃度達到0D_值0. 6-0. 8時，離心收集菌體，按上述小量堿裂解法提取質粒，用限制性內切酶Hind III和BamH I雙酶切后，在1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可見分子大小分別約為13. 9kb(pBI121載體帶)、 650bp(目標帶1)和350bp(目標帶2)的三條帶，并且進行測序驗證。將酶切和測序表明含有氣孔特異性啟動子GbSLSP片段(序列表中序列1)和PBI121酶切得到的大片段的重組表達載體命名為pBI-GbSLSP-GUS。同樣，用GFP替代pBI_GbSLSP_GUS中的⑶S(限制性內切酶BamH I和Sac I雙酶切)，得到植物表達載體pBI-GbSLSP-GFP。具體方法如下將兩端帶有BamH I和Sac I的GFP基因(序列如圖18所示)PCR產物與用BamH I和Sac I雙酶切pBI-GbSLSP-GUS得到的大片段連接，得到pB I-Gb SLSP-GFP。在重組表達載體pBI-GbSLSP-GUS中的⑶S基因，和在重組表達載體 ρΒΙ-GbSLSP-GFP中的GFP基因均需要氣孔特異啟動子GbSLSP驅動表達。所構建的植物雙元表達載體pBI-GbSLSP-GUS和pB I-Gb SLSP-GFP的圖譜見圖3。實施例3、轉GbSLSP煙草和擬南芥的獲得和鑒定1、農桿菌的轉化與轉化子的鑒定用CaC12法(《分子克隆》第三版)制備根癌農桿菌菌株LBA4404和GV3101 (美國Life Technology公司產品)的感受態細胞。利用凍融法(《分子克隆》第三版)將實施例2所得的兩個重組表達載體(pBI-GbSLSP-GUS和pB I-GbSLSP-GFP)轉入制備的LBA4404 感受態細胞，同時，將pBI-GbSLSP-GUS載體轉入GV3101感受態細胞。將轉化的LBA4404菌株接種到含有鏈霉素(Str) 100mg/L和卡那霉素(Kan) 50mg/L的YEB固體培養基，將轉化的 GV3101菌株接種到含有利福平(Rif) 25mg/L和卡那霉素(Kan) 50mg/L的YEB固體培養基， 置于28°C、在暗處培養48-72h，分別挑取兩個平板上的單菌落，各自接入含有相應抗生素的YEB液體培養基，在28°C振蕩過夜培養。當培養物的濃度達到0D600值0. 4-0. 6時，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量堿裂解法提取質粒，用限制性內切酶Hind III和BamH I 雙酶切鑒定，在1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可見分子大小大約分別為13. 9kb(載體帶)、650bp(目標帶1)和350bp(目標帶2)的三條帶。根據所含目的基因(⑶S或GFP)以及轉化菌株(LBA4404和GV3101)的不同， 將酶切和測序鑒定表明含有GbSLSP片段的轉入pBI-GbSLSP-GUS的LBA4404陽性克隆命名為LBA4404/pBI-GbSLSP-GUS、將酶切和測序鑒定表明含有GbSLSP片段的轉入 pBI-GbSLSP-GFP 的 LBA4404 陽性克隆命名為 LBA4404/pBI_GbSLSP_GFP、將酶切和測序鑒定表明含有GbSLSP片段的轉入pBI-GbSLSP-GUS的GV3101陽性克隆命名為GV3101/ pBI-GbSLSP-GUS。2、轉基因煙草的獲得1)農桿菌的準備分別挑取攜帶植物表達載體pBI-GbSLSP-⑶S或pBI-GbSLSP-GFP的農桿菌 LBA4404單菌落，接種于5ml含鏈霉素(Str) 100mg/L和卡那霉素(Kan) 50mg/L的YEB液體培養基中，28°C振蕩培養過夜培養，取活化的農桿菌液，按1 100的比例加入到含鏈霉素(Str) 100mg/L和卡那霉素(Kan) 50mg/L的YEB液體培養基中，繼續培養至0D_值為 0. 4-0. 6 ；5000rpm離心5min，收集菌體；用1/2MS0液體培養基(MS無機鹽+B5維生素+肌醇0. lg/L+蔗糖30g/L，pH5. 80)洗滌菌體一次，并將其稀釋到離心前菌液3倍體積的1/2MS 液體培養基中，準備侵染用。2)煙草的轉化與轉化植株的再生煙草的轉化根據葉盤法(HorschRB 等，1985，Science，227 :1229_1231)進行。具體操作為選取約30天苗齡的煙草(品種“NC89”，種子購自中國農業科學院)無菌苗，切下鮮嫩濃綠的葉片，用直徑9mm的打孔器制取葉盤外植體；將新制備的外植體投入上述步驟1)已準備好的農桿菌菌液中，侵染15min ；取出葉盤，用高壓滅菌的吸水紙吸除葉盤表面殘余的農桿菌菌液，置于固體再生培養基(MS無機鹽+B5維生素+肌醇0. lg/L+BA 2. Omg/ L+IAA 0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉0. 7%,pH5. 8)上暗處共培養2天；將共培養的葉盤轉到含有羧芐青霉素(Carb) 500mg/L和Kan 50mg/L的固體再生培養基進行篩選培養，每隔 2-3周更換一次培養基，并逐漸降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽長到1_1. 5cm時，將其切下換到含有Carb 200mg/L和Kan 50mg/L的固體生根培養基(MS無機鹽+B5維生素+肌醇0. lg/L+IAAO. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉0. 7%，pH5. 80)上誘導生根，獲得完整的具有卡那霉素抗性的轉基因煙草Ttl代植株。3)擬南芥的轉化與篩選擬南芥的轉化通過花蘸法(Cloughand Bent, 1998，Plant Journal, 16 (6) 735-743)進行。挑取攜帶植物表達載體pBI-GbSLSP-GUS的農桿菌GV3101單菌落，接種于 5ml含利福平(Rif) 25mg/L和Kan 50mg/L的YEB液體培養基中，28°C振蕩培養過夜。取活化過夜的農桿菌，按1 100的比例加入到含Rif 25mg/L和Kan 50mg/L的新鮮YEB液體培養基中，繼續培養至OD6tltl值大約為1. 2-1. 6，5000rpm離心5min，收集菌體大約30mL， 用50mL滲透緩沖液(1 XMS大量元素，5%蔗糖)重懸菌體，加入IOyL 0.02%的Selwet L-77，混勻，分裝入5mL Eppendorf(EP)管中，每管3mL。侵染時，將待侵染的擬南芥花序插入菌液中，侵染5min。侵染后，將擬南芥植株平放的托盤上，蓋上保鮮膜保濕，16°C黑暗條件下放置24h后恢復正常光照培養，收獲種子(轉基因T1代種子)。將收好的種子轉入到 1.5mL EP管中，加入ImL 75%的乙醇，混勻，表面消毒lmin。然后，倒掉乙醇，加入0. 5%的次氯酸鈉lmL，表面消毒lOmin，期間不斷的搖勻。倒掉消毒液，加入ImL無菌水，混勻，放置 5min。重復上述步驟給種子消毒2-3次，將消毒好的種子均勻鋪在篩選培養基上(MS+Kan 50mg/L)的平板上，置4°C春化2-4d，再轉移到培養箱中培養(22°C，16h光照/8h黑暗)，培養10-14d后，挑選長出真葉并且生根較正常的植株，初步定為轉基因植株，移入(營養土 蛭石=1 1)的土中生長，兩到三個月收獲T2代種子。4)轉基因煙草Ttl代植株和擬南芥T1代植株的分子鑒定對步驟2)和3)得到的煙草Ttl代和擬南芥T1代植株進行PCR鑒定。根據SDS法和CTAB (《分子克隆》第三版)提取上述得到的具有Kan抗性基因的煙草Ttl代植株、擬南芥 T1代植株和未轉基因的對照株(煙草品種“NC89”，擬南芥“哥倫比亞”野生型)的葉片基因組DNA，用氣孔特異性啟動子GbSLSP兩端特異性引物對(引物1和引物2)進行PCR擴增， 結果顯示，轉基因煙草Ttl代(圖4)和擬南芥T1代(圖5)均擴增得到大小約為IOOObp的目標帶，而未轉化的對照植株在相應位置則沒有擴增出此目標片段。這一結果初步表明氣孔特異性啟動子GbSLSP及其目標基因已整合到煙草和擬南芥基因組中。實施例4、利用組織化學檢測轉基因煙草和擬南芥中⑶S基因的表達，確定GbSLSP 啟動子活性和特異性轉基因煙草和擬南芥⑶S基因表達的組織化學檢測按照Jefferson RA[1987, Plant Mol Biol Rep, 5 (4) 387-405]的方法進行。將轉基因煙草Ttl代植株的葉圓盤，T1代植株幼苗，以及轉基因擬南芥T1代植株的新鮮的花絮、花、柱頭、花藥、莖、花梗、花萼、果夾、 葉(葉圓盤)在⑶S染色液(X-GLuc溶液)中于37°C染色12-16h，然后經脫色液(乙醇 冰醋酸=3 1)脫色后，在顯微鏡下觀測樣品并拍照。未轉基因的受體品種植株同樣染色作為對照。煙草葉圓盤取自近葉柄處。轉入每個表達載體的煙草Ttl代、T1代植株和擬南芥 T1植株均取10株以上的獨立轉化單株。轉基因Ttl代煙草的GUS染色的結果顯示，未轉基因的對照植株(CK)的各個組織和器官都不能染色，但轉GbSLSP的葉片保衛細胞被深度染色，葉肉細胞、葉脈和表皮毛的染色較弱(圖6)。隨機取Ttl轉基因煙草所結的種子，用5%次氯酸鈉表面消毒后接種在含 Kanl00mg/L的固體MS培養基表面，在24士 1°C暗處發芽，發芽后光照條件改為16h光照/8h 黑暗，溫度為24士 1°C，在此條件下篩選轉基因后代。在Kan抗性苗(T1代)呈現3_4片真葉時，隨機取10株以上進行整株⑶S染色。T1代煙草幼苗的⑶S染色顯示，子葉和真葉的氣孔都被染成⑶S深藍色，氣孔鄰近的葉肉也被染色，幼根中軸呈現弱的藍色(圖7)。而未轉基因的對照植株(CK)的各個組織和器官都不能染色。轉GbSLSP-GUS基因擬南芥T1代植株不同器官的⑶S染色的結果顯示，未轉基因的對照植株(CK)的各個組織和器官都不能染色，而轉基因植株的花序柄、花梗、花萼、花瓣、 花藥、花柱、果莢和葉片的氣孔都被染成⑶S深藍色，其它組織不染色(圖8)。實施例5、利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察轉基因煙草中GFP基因的表達，確定 GbSLSP啟動子的活性和特異性在盆栽的轉GbSLSP-GFP煙草Ttl代Kan抗性苗長到3_5片葉時，取其頂部第2片嫩葉，在共聚焦激光掃描顯微鏡(型號Carl Zeiss LSM510)下用488nm波長激發、550nm檢測GFP發出的綠色熒光。然后撕下葉片的下表皮，在同樣條件下檢測綠色熒光并照相。顯微檢測顯示，由GbSLSP驅動的GFP基因的表達產物GFP不僅發出了綠色熒光，而且綠色熒光僅出現在氣孔(圖9)。實施例6、氣孔特異性啟動子的最短活性片段的分析對氣孔特異性啟動子的最短活性片段的分析采用的是GbSLSP啟動子片段5'端和/或3'端刪除分析法。為了解析氣孔特異性啟動子GbSLSP的最短活性片段，我們設計了 4 個 5'端刪除片段(GbSLSP-F2、GbSLSP-F3、GbSLSP-F4、GbSLSP-F5)和 2 個 3'端刪除片段(GbSLSP-SH和GbSLSPF2-SH)。這6個部分片段間的關系及大小如(圖10)所示。1、氣孔特異性啟動子5'端和/或3'端刪除片段的克隆與分離根據GbSLSP全長序列設計并合成以下5條引物，其中上游引物(也稱5'端引物)3條(F3-F5)，下游引物(也稱3'端引物)1條(R2)。為了方便以后的克隆和構建，在 3條上游引物(F3-F5)的5'端加入了限制性內切酶Hind III識別序列位點，在1條下游引物(R2)的3'端加入了限制性內切酶BamH I的識別序列位點(下列引物序列中的下劃線序列)。這些引物如下F3 5' -AAGCTTATTTTGGAAGATGAC-3‘(序列 5)；F4 5' -AAGCTTCTTTACATGCATCATGTGATCG-3‘(序列 6)；F5 5' -AAGCTTATCGTGGGGGACCCGAAACTTGGCATAC-3'；(序列 7)R2 5' -GGATCCGTGG TTGGATGAGA CT-3'；(序列 8)。按照實施例1所述方法，以實施例1鑒定正確的含有GbSLSP全長序列的重組質粒 PBS-GbSLSP為模板，將上述3條上游引物(F3-F5)分別與引物2 (序列表中序列3)組合作為引物對進行PCR擴增，得到3條不同長度的兩端帶有酶切位點的5'端刪除啟動子片段 (GbSLSP-F3、GbSLSP-F4和GbSLSP_F5)；以全長上游引物(引物1，即序列表中序列2)與 R2(序列8)組合作為引物對進行PCR擴增，得到1條兩端帶有酶切位點的3'端刪除啟動子片段GbSLSP-SH ；用Hind III和BamH I雙酶切pBS_GbSLSP載體得到的大小約為650bp 的片段為啟動子GbSLSP-F2 ；用Hind III和BamH I雙酶切pBS_GbSLSP-SH載體得到的小片段(約280bp)為啟動子GbSLSPF2-SH。對上述PCR擴增得到的兩端帶有酶切位點的4個啟動子片段(3個5'端刪除啟動子片段，1個3'端刪除啟動子片段GbSLSP-SH)以及通過酶切獲得的GbSLSPF2-SH啟動子片段和GbSLSP-F2啟動子片段按照常規方法進行回收，并插入pBS-T載體。之后再將上述的6個重組載體按照實施例1步驟3所述的方法進行轉化、挑取單克隆，通過Hind III和 BamH I雙切鑒定(圖11)，鑒定正確者再通過測序確認。所得重組載體依照含有啟動子片段的不同分別命名為pBS_GbSLSPF2、 pBS-GbSLSPF3、pBS_GbSLSPF4、pBS_GbSLSPF5、pBS-GbSLSP-SH、pBS_GbSLSPF2_SH。測序結果表明以上6份質粒中均含有GbSLSP啟動子5'端或3'端刪除后不同長度后的片段。GbSLSP-F2的核苷酸序列為序列表中序列1的第346-993位，命名為GbSLSP_F2啟動子；GbSLSP-F3的核苷酸序列為序列表中序列1的第401-993位，命名為GbSLSP_F3啟動子；GbSLSP-F4的核苷酸序列為序列表中序列1的第511-993位，命名為GbSLSP_F4啟動子；GbSLSP-F5的核苷酸序列為序列表中序列1的第529-993位，命名為GbSLSP_F5啟動子；GbSLSP-SH的核苷酸序列為序列表中序列1的第1-634位，命名為GbSLSP-SH啟動子； GbSLSPF2-SH的核苷酸序列為序列表中序列1的第346-634位，命名為GbSLSPF2_SH啟動子。2、氣孔特異啟動子各片段驅動⑶S基因或GFP基因表達的植物表達載體的構建6個氣孔特異啟動子片段驅動GUS基因植物表達載體的構建采用常規一步酶切連接即可法，使特定的啟動子片段替代實施例2pBI-GbSLSP-GUS載體中的GbSLSP全長啟動子片段。之后按照實施例2所述方法轉化，搖菌，小量堿裂解法提取質粒，再分別用步驟1中各自克隆時所用的特異性引物對，以及序列表中序列4和序列3、序列4和序列8所組成的兩對引物對進行PCR鑒定，相應擴增出大小約為650、600、480、460、640或280bp的特異性帶 (圖 12)，相應為 GbSLSP-F2、GbSLSP-F3、GbSLSP-F4、GbSLSP-F5、GbSLSP-SH 和 GbSLSPF2_SH。 將這些片段與PBI121酶切得到的大片段的重組表達載體，依次名命為pBI-GbSLSPF2-GUS、 pBI-GbSLSPF3-GUS、 pBI_GbSLSPF4_GUS、 pBI_GbSLSPF5_GUS、 pBI_GbSLSP-SH_GUS、 pBI-GbSLSPF2-SH-GUS (簡稱為 GbSLSPX-GUS ；X = F2、F3、F4、F5、-SH 或 F2-SH)。然后，用GFP替代上述6個表達載體中的⑶S(限制性內切酶BamH I和Sac I雙酶切)，相應得到含有氣孔特異性啟動子片段驅動GFP基因的6個重組表達載體 pBI-GbSLSPF2-GFP、pBI_GbSLSPF3_GFP、pBI_GbSLSPF4_GFP、pBI_GbSLSPF5_GFP、 pBI-GbSLSP-SH-GFP、pBI-GbSLSPF2-SH_GFP (簡稱為 GbSLSPX-GFP ；X = F2、F3、F4、F5、-SH 或F2-SH)。具體方法同實施例1所述。在上述12個植物表達載體中，GUS基因或GFP基因由各氣孔特異啟動子片段驅動表達。3、轉氣孔特異性啟動子片段煙草和擬南芥的獲得按照實施例3的方法分別將上述GbSLSPX-GUS和GbSLSPX-GFP系列12個植物重組表達載體轉入煙草(品種“NC89”，種子購自中國農業科學院)中，同時分別將上述 GbSLSPX-GUS系列的6個重組表達載體轉入擬南芥(哥倫比亞生態型)中，從而篩選獲得轉基因的煙草Ttl代植株和擬南芥T1植株。分別提取轉各表達載體的煙草Ttl代植株和擬南芥T1植株基因組DNA，用引物 F2-F5(序列分別為序列4、序列5、序列6、序列7)中任一個與引物2 (序列3)組成引物對進行PCR擴增，或者使用引物1(序列2)、F2(序列4)與引物R2(序列8)組成引物對進行 PCR擴增，從而分別檢測轉基因的煙草和擬南芥中是否轉入了相應的啟動子。接著，將檢測陽性的轉基因煙草和擬南芥進行GUS基因表達的組織化學檢測(按照實施例4的方法)和 GFP表達的共聚焦激光掃描顯微鏡觀察(按照實施例5的方法)，詳見步驟4和5。4、轉GbSLSPX-GUS系列重組載體的煙草和擬南芥⑶S基因表達的組織化學檢測按照實施例4的方法分別對上述PCR檢測陽性的轉GbSLSPX-GUS系列重組表達載體的煙草Ttl代、T1代植株和擬南芥T1代、T2代植株進行GUS基因表達的組織化學染色，每個啟動子片段GbSLSPX-GUS陽性的植株均隨機取樣3-5個獨立單株，同時以未轉基因的煙草或擬南芥為對照。轉基因煙草Ttl代葉片的染色結果如圖13中A和a所示。結果表明，GbSLSP_F2 (圖 13F2-A和a)、GbSLSP_F3 (圖13F3-A和a)都能夠驅動GUS基因在保衛細胞中特異性地強表達，盡管在葉肉細胞中似乎有微量的表達；GbSLSP-F4能夠驅動⑶S基因在保衛細胞完全特異性表達(圖13F4-A和a)，只是表達強度比GbSLSP_F3要弱一些；GbSLSP_F5能夠驅動⑶S 基因在保衛細胞優勢表達，在葉肉細胞的表達相對較弱(圖13F5-A和a) ；GbSLSP-SH驅動的⑶S基因在保衛細胞、葉肉和葉脈中都有表達，盡管在保衛細胞中表達稍強(圖13F-SH-A 和a) ；GbSLSPF2-SH驅動的⑶S基因在保衛細胞中有微量表達，而且只能在局部有⑶S著色 (圖13F2-SH-A和a)。轉基因煙草Ttl代花的⑶S染色結果(圖13中B)表明，GbSLSP_F2能夠驅動⑶S基因在花的子房、萼片、花瓣、柱頭、花藥均有一定的表達(圖13F2-B) ；GbSLSP-F4 僅能驅動⑶S基因在子房有微弱的表達(圖13F4-B) ；GbSLSP-F5能夠驅動⑶S基因在花的子房、花瓣、花藥中有微弱的表達(圖13F5-B) ；GbSLSP-SH僅能驅動GUS基因在子房中有較強的表達(圖13F-SH-B) ；GbSLSPF2-SH僅能驅動⑶S基因在花藥中有很微弱的表達(圖 13F2-SH-B)。轉基因煙草T1代幼苗的GUS染色結果(圖14)表明，各個構建啟動子驅動GUS 基因均能穩定的遺傳。而未轉基因的對照植株(CK)的各個組織和器官都不能染色。轉基因擬南芥T1代的⑶S染色結果如圖15所示。轉GbSLSP_F2驅動⑶S基因不僅在葉片氣孔特異性地表達，而且在莖、花柄、花藥、萼片和花柄所有具有氣孔的組織都有特異性地表達，這些器官的氣孔都被染成GUS藍色(圖15F2)。此外，在花絲上也有很強的 ⑶S染色，但花瓣及果夾上看不到⑶S染色。轉GbSLSPF2-GUS的T2代幼苗的⑶S染色結果 (圖16)顯示，幼苗整株有氣孔的部位都能夠染成GUS染色(圖16A)，其子葉(圖16B和b) 和真葉(圖16C和c)僅僅氣孔呈現出⑶S藍色，其它的組織不被染色。轉GbSLSPF5-GUS 的T1代的⑶S染色結果(圖15F5)與轉GbSLSPF2-GUS的近似，但強度明顯減弱。此外，在花柱除頸之外的部分呈現片狀GUS染色(圖15F5C)。而未轉基因的T1代和T2代對照植株 (CK)的各個組織和器官都不能染色。5、轉GbSLSPX-GFP系列煙草Ttl代表達的GFP的共聚焦激光掃描顯微鏡觀察隨機選取轉GbSLSPFX-GFP系列重組表達載體的煙草Ttl代Kan抗性苗，每個啟動子片段GbSLSPX-GFP陽性的植株均隨機取樣3-5個獨立單株，取其幼葉在共聚焦激光掃描顯微鏡觀察下觀察GFP的表達情況且照相，照片如圖17所示，GbSLSP的6個刪除片段所驅動的GFP基因都只特異性地在氣孔表達，綠色熒光僅僅在氣孔出現，而在其它組織沒有檢測到。上述的實施例結果表明并且確證，本發明所提供的棉花啟動子GbSLSP在氣孔中具有較強的優勢表達，5，端刪除后的啟動子片段GbSLSP-F2、GbSLSP-F3、GbSLSP-F4具有良好的氣孔特異性，尤其是GbSLSP-F2具有很強的啟動子活性。GbSLSP-F5、GbSLSP_F_SH、 GbSLSPF2-SH在氣孔中具有較弱的優勢表達，而且得到的啟動子片段均能穩定地傳遞給后代。
權利要求
1.DNA分子，是下述a)或b)或c)的DNA片段a)3'端至少含有序列表中序列1的第5四-993位核苷酸序列，并且從序列1的第5 位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為465至99!3bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；b)與a)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。
2.根據權利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列1的第993位。
3.根據權利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為下述1)-3)中任一種1)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第511-993位核苷酸序列，并且從序列1的第511位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為483 至993bp的任意一個DNA片段；2)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第401-993位核苷酸序列，并且從序列1的第401位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為593 至993bp的任意一個DNA片段；3)核苷酸序列的3'端至少含有序列表中序列1的第346-993位核苷酸序列，并且從序列1的第346位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為648 至993bp的任意一個DNA片段。
4.根據權利要求1-3中任一所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為下述 al)-a5)中任一種al)核苷酸序列為序列表中序列1所示的DNA分子； a2)核苷酸序列為序列表中序列1的第346-993位核苷酸所示DNA分子； a3)核苷酸序列為序列表中序列1的第401-993位核苷酸所示DNA分子； a4)核苷酸序列為序列表中序列1的第511-993位核苷酸所示DNA分子； a5)核苷酸序列為序列表中序列1的第5四-993位核苷酸所示DNA分子。
5.DNA分子，是下述d)或e)或f)的DNA片段d)3'端至少含有序列表中序列1的第346-634位核苷酸序列，并且從序列1的第346 位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為289至634bp的任意一個DNA片段；所述DNA分子具有啟動子功能；所述DNA分子的最后一位核苷酸是序列1的第634位；e)與d)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；f)在嚴格條件下與d)或e)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片段。
6.根據權利要求5所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為下述bl)或1^2) bl)核苷酸序列為序列表中序列1的第1-634位核苷酸所示的DNA分子；b2)核苷酸序列為序列表中序列1的第346-634位核苷酸所示DNA分子。
7.含有權利要求1-6中任一所述DNA分子的遺傳材料，或獲得權利要求1-6中任一所述DNA分子的一個引物對；所述遺傳材料為表達盒、重組載體、重組菌或轉基因植物細胞或組織或器官。
8.根據權利要求7所述的引物對，其特征在于所述引物對為下述中的任一對cl)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段組成的引物對；c2)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列5的第7_21位核苷酸所示DNA片段組成的引物對；c3)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列6的第7- 位核苷酸所示DNA片段組成的引物對；c4)序列表中序列3的第7-30位核苷酸所示DNA片段和序列7的第7_34位核苷酸所示DNA片段組成的引物對；c5)序列表中序列8的第7-22位核苷酸所示DNA片段和序列2的第7_27位核苷酸所示DNA片段組成的引物對。
9.權利要求1-6中任一所述DNA分子在植物中啟動目的基因表達中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于所述植物是陸生植物，優選是雙子葉植物，更優選是擬南芥或煙草；所述表達為氣孔特異性表達。
全文摘要
本發明公開了一種植物氣孔特異性啟動子及其應用。本發明所提供的啟動子具有下述核苷酸序列1)序列表中序列1；2)將序列表中序列1的核苷酸序列經過5’端刪除和/或3’端刪除后，并且仍然具有氣孔特異性啟動子功能的核苷酸序列；3)將1)或2)中核苷酸序列的一個或幾個脫氧核苷酸殘基經過取代、添加或缺失，且具有氣孔特異性啟動子功能的核苷酸序列。實驗證明本發明所提供的啟動子不僅具有良好的氣孔特異性，而且該特異性能夠穩定地傳遞給后代。這不僅對氣孔和保衛細胞的分子生物學研究和氣孔運動等的理論研究具有重要的意義，而且在培育抗旱和抗病作物而去提高作物的光合效率進而提高產量和品質等方面具有重大的應用價值和廣闊的市場前景。
文檔編號C12N15/11GK102433338SQ20121000111
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月4日 優先權日2012年1月4日
發明者肖興國, 韓蕾 申請人:中國農業大學