專利名稱：家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法
家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法本發明涉及生物鑒定試劑盒，更具體地，涉及一種家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法。冬蟲夏草是我國傳統名貴中藥，冬蟲夏草已經被用來治療高血糖癥、呼吸系統疾病、肝病、腎衰竭，并作為抗癌藥物和抗氧化劑等。目前，與冬蟲夏草有關的無性型菌種報到已有22個學名，涉及13個屬。經過多年爭論，2005年10月，中國菌物學會在北京召開了 《冬蟲夏草及其無性型研討會》，確定中國被毛孢(Hirsutella sinensis)為冬蟲夏草唯一無性型菌種。目前市場上偽品和混淆品眾多，不容易區分，為臨床和推廣帶來了很多困難。冬蟲夏草的鑒定多為生藥學的鑒定，主要針對外觀、顏色、氣味、味道等，這些方法比較主觀，也需要一定的經驗，普通人很難在短期內掌握。目前也有一些使用液相色譜對其中的一些成分進行檢測，從而進行鑒定的報到，但是需要昂貴的大型設備，很難普及和現場使用。隨著分子生物學的深入研究，聚合酶鏈式反應技術(PCR)也被應用到了冬蟲夏草的鑒定，同樣的也需要PCR儀、電泳儀等設備，而且存在著操作過程繁瑣的缺點。所以及時運用生物技術發展的最新成果來進行冬蟲夏草的鑒定具有重要意義。環介導恒溫擴增技術 (LAMP)只需要一個恒溫環境就能夠產生肉眼可見的顏色變化，具有很多優越性。環介導恒溫擴增技術(LAMP)需要樣品的DNA作為模板進行擴增，其樣品的制備過程仍然有些復雜繁瑣，無法滿足家庭和現場使用。因此需要一種鑒定結果直觀、操作簡單、特異性好、適合家用的冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法來解決以上問題。本發明的目的是在于解決現有技術的不足之處而提供一種提供一種鑒定結果直觀、操作簡單、特異性好、適合家用的冬蟲夏草鑒定試劑盒。本發明的目的可以通過以下技術措施實現家用冬蟲夏草鑒定試劑盒包括以冬蟲夏草真菌ITS基因為靶基因、基于環介導恒溫擴增技術設計的三對引物內引物FIP/BIP、 外引物F3/B3和環引物LB/LP。核糖體RNA (rRNA)位于18s48s rDNA之間的內轉錄間隔區(ITS區)，它包括進化上高度保守的5. 8s rDNA和包含有rDNA前體加工信息的兩個間隔區ITS-I、ITS_2。在rDNA 多基因家族成員中，ITS是多拷貝，以串聯重復方式出現在一個或多個染色體基因位點上， 同時ITS區又有通過不等交換和基因轉變等方式經歷快速一致進化的的特性，使得重復單位在基因組內保持了高度一致性；而且ITS區兩側有高度保守序列存在，通過設計在保守區域上的引物擴增ITS區，可以有效地解決系統發育和生物鑒別問題。ITS序列是真菌菌種和分離物鑒定的可靠依據。本發明就是針對該區域進行冬蟲夏草的鑒定。根據Genebank上的冬蟲夏草基因設計引物如下
FIP :GTCGCAGTGGCATCTCTCAGTC-ATGCCCGCCAGAGTGC
BIP :AGGAGGGTCTGGGGGTCCTC-CAGCAGTTGCCTCGGCF3 :GGTTGAGATGACGCTCGGAB3 :CCCCCTGCGAACACCAFL TACTGCGCAGGGGAGCBL CCTGCGAACACCACAGC作為本發明家用冬蟲夏草鑒定試劑盒的優選實施方式，所述的冬蟲夏草鑒定試劑盒還包括稀釋液、一次性移液管、反應管。作為本發明家用冬蟲夏草鑒定試劑盒的更優選的實施方式，所述的反應管含有冷凍干燥物質，凍干物質含有Bst DNA聚合酶1 10單位/管，1.6 2mmol/L dNTP、 20 50mmol/LTris-HCl、10 20mmol/L KCl、10 50mmol/L MgS04、0. 1 0· 5 體積 ％ TritonX-100、0. 8 2mmol/L甜菜堿、0. 2 2mol/L HNB,內引物 FIP/BIP 0. 6 1. 6ummol/ L、外引物F3/B30. 1 0. 4ummol/L、環引物LB/LP 0. 2 0. 8ummol/L以上物質溶于10 IOOul水中，然后冷凍干燥處理。作為本發明家用冬蟲夏草鑒定試劑盒的更優選的實施方式，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將待檢測、陰性和陽性樣品分別用剪刀剪成盡可能小的薄片2 8片。(2)分別放入稀釋液中，做好標記，蓋好管蓋，搖晃混勻，靜置。(3)分別用一次性移液管吸取上清滴加到反應管。(4)用一次性移液管吸頭輕輕吹打反應管中的底部藍色物質，直至完全溶解。(5)將反應管放入恒溫反應環境反應。(6)觀察反應管顏色變化，藍色為陽性，淺紅色為陰性。本發明所說的基于環介導恒溫擴增技術(LAMP)鑒定冬蟲夏草的方法，是利用Bst DNA聚合酶和根據靶基因序列設計的三對特殊內引物FIP/BIP、外引物F3/B3和環引物LB/ LP，特異性的識別靶序列上的8個獨立區域，啟動循環鏈置換反應，在靶標DNA區域啟動互補鏈合成，結果在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環的花椰菜結構的莖-環DNA混合物。LAMP反應過程中，從DNTP析出的焦磷酸根離子與反應液中的鎂離子結合，產生副產物焦磷酸鎂沉淀。使溶液中的鎂離子濃度降低，從而使HNB呈現不同的顏色變化。LAMP反應時在恒溫(63 65度)條件下20 100分鐘內完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環使所需儀器簡化，克服了傳統PCR技術所需時間長、檢測成本高的缺點。此外此種鑒定對操作人員技術要求低，實際操作極為簡便，不需要特殊儀器設備，適合家庭和現場使用。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1.本發明的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒只需要一個恒定溫度就能擴增反應，不需要其他特殊設備，檢測方便，成本低，適合家庭和現場使用。2.本發明的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒應用8個區段、六條引物區擴增靶基因序列，因此具有高特異性。3.本發明的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒擴增快速且高效，在半個小時左右就可以完成反應。4.本發明的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒使用HNB作為顯色劑，可以通過肉眼觀察顏色，陰陽結果差異顯著，驗證效率高，結果可靠。5.本發明的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒由于選擇了 ITS序列這一真菌菌種和分離物鑒定的可靠依據，使得本發明的檢測準確率高。6.本發明的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒將樣品DNA的制備過程簡化為剪切、手動裂解，使得冬蟲夏草鑒定技術走進家庭成為了可能。7.本發明的冬蟲夏草鑒定試劑盒全部采用密封的一次性小管，減少了氣溶膠污染的可能。為了使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施。實施例1試劑盒的制備(1)按以下序列合成寡聚脫氧核酸引物FIP :GTCGCAGTGGCATCTCTCAGTC-ATGCCCGCCAGAGTGCBIP :AGGAGGGTCTGGGGGTCCTC-CAGCAGTTGCCTCGGCF3 GGTTGAGATGACGCTCGGAB3 :CCCCCTGCGAACACCAFL :TACTGCGCAGGGGAGCBL :CCTGCGAACACCACAGC(2)制備工藝如下將Bst DNA 聚合酶 10 單位 / 管，2mmol/L dNTP、50mmol/L Tris-HCl、20mmol/L KCl、50mmol/L MgS04、0. 5 體積％ TritonX-100、lmmol/L 甜菜堿、lmol/L HNB，內引物 FIP/ BIP1. 6ummol/L、外引物 F3/B3 0. 2ummol/L、環引物 LB/LP 0. 4ummol/L。以上物質溶于25ul水中，然后冷凍干燥處理。(3)試劑盒的應用a.將冬蟲夏草和亞香棒蟲草、分支蟲草、四川蟲草、湖北蟲草、安徽蟲草分別用剪刀剪成盡可能小的薄片2 8片。b.分別放入稀釋液中，做好標記，蓋好管蓋，搖晃混勻，靜置。c.分別用一次性移液管吸取上清滴加到反應管。d.用一次性移液管吸頭輕輕吹打反應管中的底部藍色物質，直至完全溶解。e.將反應管放入65度恒溫反應環境反應20-60分鐘。f.觀察反應管顏色變化，冬蟲夏草為淺藍色，亞香棒蟲草、分支蟲草、四川蟲草、湖北蟲草、安徽蟲草為淺紅色。(4)材料a.冬蟲夏草和亞香棒蟲草、分支蟲草、四川蟲草、湖北蟲草、安徽蟲草購買自安徽亳州藥材市場。b.Bst DNA聚合酶購買自北京紐英侖公司，HNB、甜菜堿購買自Sigma公司，引物由上海生工合成。(5)結論本發明方法操作簡單，方便快捷，且顯色結果清晰。本發明不需要特別設備和儀器，適合家庭和現場使用，并且該方法具有廣泛的適用性。最后應當說明的是，以上實施例僅用于說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明做了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解， 可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
權利要求
1.本發明提供了一種家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法，其特征在于，所述的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒包括以冬蟲夏草真菌ITS基因為靶基因、基于環介導恒溫擴增技術設計的三對弓丨物內引物FIP/BIP、外引物F3/B3和環引物LB/LP。
2.如權利要求1所述的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法，其特征在于，所述的三對引物為FIP :GTCGCAGTGGCATCTCTCAGTC-ATGCCCGCCAGAGTGCBIP :AGGAGGGTCTGGGGGTCCTC-CAGCAGTTGCCTCGGCF3 GGTTGAGATGACGCTCGGAB3 :CCCCCTGCGAACACCAFL :TACTGCGCAGGGGAGCBL :CCTGCGAACACCACAGC
3.如權利要求1所述的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法，其特征在于，所述的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒還包括稀釋液、一次性移液管、反應管。
4.如權利要求3所述的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法，其特征在于，所述的反應管含有冷凍干燥物質，凍干物質含有Bst DNA聚合酶1 10單位/管，1. 6 2mmol/ L dNTP、20 50mmol/L Tris-HClUO 20mmol/L KClUO 50mmol/L MgS04、0. 1 0· 5 體積％ TritonX-100,0. 8 2mmol/L 甜菜堿、0. 2 2mol/L HNB,內引物 FIP/BIP 0. 6 1. 6ummol/L、外引物 F3/B30. 1 0. 4ummol/L、環引物 LB/LP 0. 2 0. 8ummol/L 以上物質溶于10 IOOul水中，然后冷凍干燥處理。
5.如權利要求3所述的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將待檢測、陰性和陽性樣品分別用剪刀剪成盡可能小的薄片2 8片。(2)分別放入稀釋液中，做好標記，蓋好管蓋，搖晃混勻，靜置。(3)分別用一次性移液管吸取上清滴加到反應管。(4)用一次性移液管吸頭輕輕吹打反應管中的底部藍色物質，直至完全溶解。(5)將反應管放入恒溫反應環境反應。(6)觀察反應管顏色變化，藍色為陽性，淺紅色為陰性。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的稀釋液為水，含量為100-1500微升。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，恒溫反應環境的溫度為55-70度，反應的時間為20-200分鐘。
8.如權利要求1所述的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法，其特征在于，所述的方法包括用剪刀或者刀片剪切冬蟲夏草，取2 8片放入含水的稀釋液中，用力搖晃，釋放基因。
9.如權利要求1所述的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法，其特征在于，所述的試劑盒包含有冬蟲夏草作為陽線對照，以證明試劑盒有效。
10.如權利要求1所述的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒及其使用方法，其特征在于，所述的試劑盒包含有亞香棒蟲草、分支蟲草、四川蟲草、湖北蟲草、安徽蟲草、古尼蟲草、尼泊爾蟲草其中的一種或者幾種作為陰性對照，以證明試劑盒有效。
全文摘要
本發明提供了一種家用冬蟲夏草鑒定試劑盒，所述的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒包括快速簡便的處理真菌，得到足夠可以用于基因擴增的真菌基因。本發明的家用冬蟲夏草鑒定試劑盒以冬蟲夏草菌ITS基因為靶基因、基于環介導恒溫擴增技術設計了三對引物。本發明的家用冬蟲夏草試劑盒鑒定結果直觀、操作簡單、特異性好，不需要特別的設備和儀器，適合家用或者現場使用。
文檔編號C12Q1/68GK102424860SQ20121000236
公開日2012年4月25日 申請日期2012年1月5日 優先權日2012年1月5日
發明者俞國華, 李治國 申請人:俞國華, 李治國