專利名稱：一種新的基因定量方法
一種新的基因定量方法[技術(shù)領(lǐng)域]
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種新的基因定量方法。 [背景技術(shù)]
包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、核酸序列依賴性擴(kuò)增 (NASBA)等技術(shù)的基因擴(kuò)增技術(shù)可將極微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍，從而大大提高對(duì)DNA或者RNA分子的分析和檢測(cè)能力，能檢測(cè)單分子DNA或?qū)γ?0萬個(gè)細(xì)胞中僅含1個(gè)靶DNA或RNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。
由于基因擴(kuò)增技術(shù)的高靈敏性導(dǎo)致會(huì)出現(xiàn)一些假陽性，基因定量技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生， 常見的定量技術(shù)包括熒光定量PCR技術(shù)，LAMP的實(shí)時(shí)濁度定量技術(shù)等，這些技術(shù)的出現(xiàn)為基因擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用帶來了更為廣闊的前景。目前我國(guó)臨床已經(jīng)拋棄了普通的基因擴(kuò)增定性檢測(cè)，全部采用定量基因擴(kuò)增技術(shù)。但是這些定量技術(shù)都需要大型的儀器設(shè)備，一臺(tái)定量 PCR儀的價(jià)格是普通PCR儀價(jià)格的十多倍，因此只能夠在大醫(yī)院和科研院所展開相關(guān)檢測(cè)和研究，基層醫(yī)院和偏遠(yuǎn)地區(qū)無法享受這一高科技產(chǎn)品帶來的福音。
因此特別需要一種簡(jiǎn)單而且不需要大型設(shè)備的基因定量技術(shù)。[發(fā)明內(nèi)容]
本發(fā)明的目的是在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種提供一種鑒定結(jié)果直觀、操作簡(jiǎn)單、特異性好、適合基層的基因定量技術(shù)。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)(1)通過實(shí)驗(yàn)鑒定出一組擴(kuò)增試劑在相同條件下的靈敏度，即可以檢測(cè)到的最低基因數(shù)量；( 將待定量的模板稀釋不同倍數(shù)， 然后對(duì)不同濃度的模板用同一組擴(kuò)增試劑進(jìn)行基因擴(kuò)增；C3)通過能夠?qū)崿F(xiàn)基因擴(kuò)增的最大稀釋倍數(shù)計(jì)算待定量的基因數(shù)量。
一組檢測(cè)時(shí)間在相同的檢測(cè)條件下，能夠檢測(cè)到的最低基因數(shù)量，即該組檢測(cè)試劑的檢測(cè)靈敏度。一組試劑的檢測(cè)靈敏度是一個(gè)恒定的數(shù)值，具有很強(qiáng)的可重復(fù)性。我們可以通過實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行基因定量，等比稀釋等方法鑒定一組基因擴(kuò)增試劑的檢測(cè)靈敏度。
將待定量的模板進(jìn)行逐級(jí)稀釋，用同一組擴(kuò)增試劑對(duì)各稀釋比例的模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，大于該組擴(kuò)增試劑靈敏度濃度的稀釋管可以完成擴(kuò)增反應(yīng)，低于該組擴(kuò)增試劑靈敏度的稀釋管不會(huì)完成擴(kuò)增反應(yīng)。用該組擴(kuò)增試劑的靈敏度乘以可以完成擴(kuò)增反應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)就是帶定量的模板數(shù)量。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的一種新的基因定量方法只需要原有的基因擴(kuò)增設(shè)備，像LAMP和NASBA技術(shù)只需要一個(gè)恒溫環(huán)境即可，不需要額外的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，大大簡(jiǎn)化了設(shè)備投入，成本投入低，適合基層和現(xiàn)場(chǎng)使用。2.本發(fā)明的一種新的基因定量方法計(jì)算簡(jiǎn)單，只是應(yīng)用了一個(gè)乘法計(jì)算，簡(jiǎn)潔明了，易懂易用。3.本發(fā)明的一種新的基因定量方法省去了熒光定量PCR所需要的熒光劑、探針等物質(zhì)，成本更低。4.本發(fā)明的一種新的基因定量方法具有廣泛的適用性，可以和PCR、LAMP、NASBA等現(xiàn)有的基因擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合，完成定量過程。[具體實(shí)施方式
]
為了使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施。
本實(shí)施例采用LAMP技術(shù)定量檢測(cè)大腸桿菌。
實(shí)施例1
(1)按以下序列合成大腸桿菌寡聚脫氧核酸引物
ECFL :CTTCGCCACCGGTATTCC
ECBL GGATTAGATACCCTGGTAGTCC
ECBIP :GCTCAGGTGCGAAAGCGTGGACCTCCAAGTCGACATCGTT
ECFIP :TCAGTCTTCGTCCAGGGGGCCAGGTGTAGCGGTGAAATGC
ECB3 :CGTTAGCTCCGGAAGCCA
ECF3 :TCTCGTAGAGGGGGGTAGA
(2)制備工藝如下
將Bst DNA 聚合酶 10 單位 / 管，2mmol/L dNTP、50mmol/L Tris-HCl、20mmol/ LKCl、50mmol/L MgS04、0. 5 體積％ TritonX-100、lmmol/L甜菜堿、lmol/L HNB,內(nèi)引物FIP/ BIP1. 6ummol/L、外引物 F3/B30. 2ummol/L、環(huán)引物 LB/LP 0. 4ummol/L。
以上物質(zhì)溶于20ul水中。
(3)靈敏度的檢測(cè)和未知濃度的定量檢測(cè)
a.取冷藏的HBlOl大腸桿菌菌液在LB培養(yǎng)基上劃線分離單菌株。挑單菌落接種至IOml液體LB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜，裂解法抽提大腸桿菌基因組DNA。
b.對(duì)抽提的DNA進(jìn)行0D260分光光度計(jì)檢測(cè)，確定DNA的含量。取部分DNA進(jìn)行 10倍等比稀釋，直至稀釋的濃度低于1拷貝/微升。
c.分別取各稀釋管中液體5ul，加入LAMP反應(yīng)管，65度恒溫，60分鐘，最大倍數(shù)的稀釋管中基因的拷貝數(shù)就是該組試劑的檢測(cè)靈敏度。
d.將未知濃度的大腸桿菌按照10倍等比稀釋8組，分別取各稀釋管中液體5ul， 加入LAMP反應(yīng)管，65度恒溫，60分鐘。
e.靈敏度乘最大稀釋倍數(shù)的數(shù)值就是該未知濃度檢測(cè)管的大腸桿菌濃度。
(4)材料
a.大腸桿菌HBlOl為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用工程菌之一，為本實(shí)驗(yàn)室保存。
b.Bst DNA聚合酶購(gòu)買自北京紐英侖公司，HNB、甜菜堿購(gòu)買自Sigma公司，引物由上海生工合成。
(5)結(jié)論
本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，方便快捷，且顯色結(jié)果清晰。本發(fā)明不需要特別設(shè)備和儀器，適合基層和現(xiàn)場(chǎng)使用，并且該方法具有廣泛的適用性。
最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供了一種新的基因定量方法，其特征在于，所述的方法包括(1)通過實(shí)驗(yàn)鑒定出一組擴(kuò)增試劑的靈敏度，即可以檢測(cè)到的最低基因數(shù)量；( 將待定量的模板稀釋不同倍數(shù)，然后對(duì)不同濃度的模板用同一組擴(kuò)增試劑進(jìn)行基因擴(kuò)增；C3)通過能夠?qū)崿F(xiàn)基因擴(kuò)增的最大稀釋倍數(shù)計(jì)算待定量的基因數(shù)量。
2.如權(quán)利要求1所述的一種新的基因定量方法，其特征在于，所述將模板稀釋不同倍數(shù)，可以使等比稀釋，也可以是不同比例的稀釋，但稀釋的倍數(shù)是確定的。
3.如權(quán)利要求1所述的一種新的基因定量方法，其特征在于，所述的基因擴(kuò)增包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)、核酸序列依賴性擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)。
4.如權(quán)利要求1所述的一種新的基因定量方法，其特征在于，所述一組擴(kuò)增試劑的靈敏度，即可以檢測(cè)到的最低基因數(shù)量是固定的，在只改變模板數(shù)量的條件下，這一數(shù)值不發(fā)生變化。
5.如權(quán)利要求1所述的一種新的基因定量方法，其特征在于，所述的不同倍數(shù)的模板包括可以實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)的模板濃度和不可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的模板濃度。
6.如權(quán)利要求5所述的一種新的基因定量方法，其特征在于，所述的計(jì)算初始的模板濃度等于最低可以檢測(cè)到的極限模板濃度乘以稀釋倍數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的基因定量方法，所述的方法包括(1)通過實(shí)驗(yàn)鑒定出一組擴(kuò)增試劑的靈敏度，即可以檢測(cè)到的最低基因數(shù)量；(2)將待定量的模板稀釋不同倍數(shù)，然后對(duì)不同濃度的模板用同一組擴(kuò)增試劑進(jìn)行基因擴(kuò)增；(3)通過能夠?qū)崿F(xiàn)基因擴(kuò)增的最大稀釋倍數(shù)計(jì)算待定量的基因數(shù)量。本發(fā)明只需要原有的基因擴(kuò)增設(shè)備，大大簡(jiǎn)化了設(shè)備投入，成本低，適合基層和現(xiàn)場(chǎng)使用；本發(fā)明只是應(yīng)用了一個(gè)乘法計(jì)算，簡(jiǎn)潔明了，易懂易用；本發(fā)明具有廣泛的適用性，可以和PCR、LAMP、NASBA等現(xiàn)有的基因擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合，完成定量過程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102517397SQ20121000237
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者俞國(guó)華, 李治國(guó) 申請(qǐng)人:俞國(guó)華, 李治國(guó)