專利名稱：一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星dna方法
技術領域：
本發明屬于分子標記技術領域，具體涉及一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星 DNA方法。
背景技術：
微衛星DNA又稱簡單序列重復(simple sequence r印eat，SSR)，其具有高水平的雜合性和突變率、雙親遺傳模式等優勢，已經被廣泛用于基因定位、種質資源鑒定、親緣關系分析、遺傳圖譜構建、品種鑒定以及進化分析等研究(見“ChromOSOma”，2000，109 365-371)。白蟻是最古老的社會性昆蟲，嚴重危害房屋建筑、水庫提壩和農林植物。由于白蟻生活隱蔽，巢體結構復雜，生殖模式多樣，人們很難直接觀察到白蟻習性，因此白蟻防治工作帶有很大的盲目性。我國學者在上世紀50年代開始采用傳統方法研究白蟻巢群的建立和發展、補充型生殖蟻的產生及其群體發展等，取得了一些重要進展(見《中華衛生殺蟲藥械》，2003，9 :8-12)。但是，由于白蟻的筑巢和覓食具有隱蔽性，其在自然環境中的許多重要生物學特性仍然沒有掌握如白蟻巢群中生殖蟻類型、數量和親緣關系如何？ 一定區域內原始蟻王蟻后控制的巢群和補充型生殖蟻控制的巢群的比例是多少？

發明內容
本發明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種操作簡便，結果可靠，可準確判斷白蟻巢群生殖模式的鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法。本發明目的的實現方式為，一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法，具體步驟如下1)在野外采集同一巢群，20頭以上的白蟻樣品，將樣品放入裝有95%酒精的樣品管中，置于-20°C冰箱中備用，采樣過程中，測定每個采樣點的經度、緯度和海拔高度；2)提取白蟻樣品的基因組DNA，再用ND-2000微量紫外/可見分光光度計測定樣品DNA濃度，并統一稀釋成10-20ng/ μ 1待用；3)在GenBank上查找與白蟻生殖模式相關的微衛星位點；4)利用軟件I^rimer Premier 5. 0在微衛星重復序列的側翼設計引物，選用微衛星位點RfM-2、Rf21-l、Rf6-l、RslO和RS68的微衛星引物對白蟻樣品DNA進行PCR擴增， PCR擴增反應在PTC-200PCR儀上進行；用6. 5%聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產物進行分離， 選用分子標準為50-350bp IRDye800 standard，電泳在LI-C0R4300DNA自動分析儀上進行，再使用SAGAct軟件測定電泳圖中每個條帶對應樣品的基因型；5)基于“孟德爾定律”對白蟻樣品的觀測基因型頻率與期望基因型頻率進行卡方檢驗，再判定該白蟻巢群的生殖模式①簡單巢群的基因型頻率觀測值與“孟德爾”簡單巢群的基因型頻率預期值沒有顯著差異時為“簡單巢群”，
②擴大巢群的觀測基因型種類數與“孟德爾”簡單巢群的預期基因型種類數不一致，或者經X2檢驗后エ蟻的基因型頻率觀測值與“孟德爾，，簡單巢群的基因型頻率預期值有顯著差異，且每一位點的等位基因數都小于5時為“擴大巢群”，③混合巢群的白蟻樣品在某些微衛星位點上有5個以上的等位基因時為“混合巢群”。本發明利用微衛星DNA技術可以深入研究自然環境中白蟻巢群的生殖模式，從而了解相關的白蟻生殖生物學特征，不僅能有效地解決上述背景技術中所提到的問題，而且可以提高白蟻防治工作的針對性。采用本發明對長沙10個黑胸散白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA鑒定表明簡單巢群7個、擴大巢群2個和混合巢群1個。
具體實施例方式本發明由由樣品采集、基因組DNA提取、微衛星位點查找、引物設計及優化、基因型測定、卡方檢驗和生殖模式判定等7個關鍵步驟組成。下面通過具體實施例詳述本發明。樣品采集在長沙采集10個黑胸散白蟻巢群的白蟻樣品，每個巢群采集エ蟻25 頭，兩個采樣點間的距離應在20m以上。采樣后，將エ蟻放入樣品管中，用95%酒精浸泡，貼上標簽，在-20°C冰箱中保存備用。在采樣過程中，用手持GPS定位儀測定每個采樣點的經度、緯度和海拔高度。基因組DNA提取按照已有的動物組織基因組DNA提取試劑盒的方法提取所有樣品的基因組DNA。采用ND-2000微量紫外/可見分光光度計測定DNA濃度，并將提取的樣品 DNA稀釋為10-20ng/ μ 1待用。微衛星位點查找在已有的GenBank上查找與白蟻生殖模式相關的微衛星位點。引物設計及優化利用軟件I^rimer Premier5. 0在微衛星重復序列的側翼設計引物，設計引物的原則為引物長度為19-2^p，GC含量40% -60%，退火溫度為45_65°C，預期PCR產物長度為100-300bp。根據不同引物的不同Tm值在PCR儀上進行溫度梯度優化，選擇20個樣品等量混合，得到樣品DNA。本實施例的樣品DNA是10個黑胸散白蟻巢群中20個樣品的DNA等量混合得到。基因型測定選定微衛星位點RfM-2、Rf21-l、Rf6-l、RslO和RS68的引物對白蟻樣品DNA進行PCR擴增。PCR擴增反應在PTC-200PCR儀(Bio-Rad)上進行。PCR擴增反應體系10レ1，包括模板0嫩(10叫/^1)2.(^1，(1(1!120 4. 8 μ 1，1 XReaction Buffer 1. 0μ 1, MgC12^nmol/L)0· 4μ 1，dNTPs (0. 2mmol/L) 0· 8 μ 1，5，端加有 M13 正向測序引物的正向引物(2pmol/y 1)0. 2μ 1，反向引物(2pmol/y 1)0. 2μ 1。帶有熒光標記的Μ13 引物(M13F-29/ IRD 800) (0. 32pmol/ μ 1)0. 32 μ 1, Taq polymerase (0. 4U/ μ 1)0. 08 μ 1。PCR擴增反應程序94°C預變性30s ；94°C變性30s，60°C退火30s，每循環一次降 1°C，72°C延伸30s，6個循環；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環；72°C延伸:3min，4°C終止反應。用6. 5 %聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產物進行分離，分子量標準為50-350bpIRDye800 standard (LI-COR，Inc.) 電泳在 LI-COR 4300DNA 自動分析儀上進行，再使用SAGAct軟件(LI-COR，he.)測定電泳圖中每個條帶對應樣品的基因型。卡方檢驗整理和統計每個微衛星位點對應的樣品基因型，基干“孟德爾定律”由 エ蟻基因型逆推出生殖蟻的預期基因型，再根據生殖蟻基因型推算出后代基因型的頻率預期值，再將エ蟻基因型頻率觀測值與エ蟻基因型頻率預期值進行卡方檢驗。生殖模式判定基于卡方檢驗結果來判定黑胸散白蟻巢群的生殖模式，判定標準①當基因型頻率觀測值與“孟德爾”簡單巢群的基因型頻率預期值沒有顯著差異時為“簡單巢群”，②當觀測基因型種類數與“孟德爾”簡單巢群的預期基因型種類數不一致，或者經 XX2檢驗后エ蟻基因型頻率觀測值與“孟德爾”簡單巢群的エ蟻基因型頻率預期值有顯著差異，且每一位點的等位基因數都小于5時為“擴大巢群”，③當白蟻樣品在某些微衛星位點上有5個以上的等位基因時為“混合巢群”。由此判斷出，在長沙10個黑胸散白蟻巢群中，有7個簡單巢群、2個擴大巢群和1 個混合巢群。
權利要求
1.一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法，其特征在于具體步驟如下1)在野外采集同一巢群，20頭以上的白蟻樣品，將樣品放入裝有95%酒精的樣品管中，置于-20°C冰箱中備用，采樣過程中，測定每個采樣點的經度、緯度和海拔高度；2)提取白蟻樣品的基因組DNA，再用ND-2000微量紫外/可見分光光度計測定樣品DNA 濃度，并統一稀釋成10-20ng/y 1待用；3)在GenBank上查找與白蟻生殖模式相關的微衛星位點；4)利用軟件I^rimerPremier 5. 0在微衛星重復序列的側翼設計引物，選用微衛星位點Rf24-2、Rf21-1、Rf6_l、RslO和RS68的微衛星引物對白蟻樣品DNA進行PCR擴增，PCR 擴增反應在PTC-200PCR儀上進行；用6. 5%聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產物進行分離，選用分子標準為50-350bp IRDye800 standard，電泳在LI-C0R4300DNA自動分析儀上進行， 再使用SAGAct軟件測定電泳圖中每個條帶對應樣品的基因型；5)基于“孟德爾定律”對白蟻樣品的觀測基因型頻率與期望基因型頻率進行卡方檢驗， 再判定該白蟻巢群的生殖模式①簡單巢群的基因型頻率觀測值與“孟德爾”簡單巢群的基因型頻率預期值沒有顯著差異時為“簡單巢群”，②擴大巢群的觀測基因型種類數與“孟德爾”簡單巢群的預期基因型種類數不一致，或者經X2檢驗后工蟻的基因型頻率觀測值與“孟德爾”簡單巢群的基因型頻率預期值有顯著差異，且每一位點的等位基因數都小于5時為“擴大巢群”，③混合巢群的白蟻樣品在某些微衛星位點上有5個以上的等位基因時為“混合巢群”。
2.根據權利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法，其特征在于設計引物的原則為引物長度為19-2^p，GC含量40% -60%，退火溫度為45_65°C，預期 PCR產物長度為100-300bp。
3.根據權利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法，其特征在于根據不同引物的不同Tm值在PCR儀上進行溫度梯度優化，選擇20個樣品等量混合，得到樣品DNA。
4.根據權利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法，其特征在于 PCR 擴增反應體系 10 μ 1，包括模板 DNA(10ng/y 1)2.0 μ 1，ddH20 4. 8 μ 1，IX Reaction Buffer 1. 0μ 1, MgC12 (2mmol/L) 0. 4 μ 1, dNTPs (0. 2mmol/L)0. 8μ 1,5'端力口有 M13 正向測序引物的正向引物(2ρπι01/μ 1)0·2μ 1，反向引物(2pmol/y 1)0.2μ 1 ；帶有熒光標記的 Μ13 引物(M13F-29/IRD 800) (0. 32pmol/y 1)0. 32 μ 1, Taq polymerase (0. 4U/ μ 1)0. 08μ 1 ；PCR擴增反應程序94°C預變性30s ；94°C變性30s，60°C退火30s，每循環一次降1°C， 72°C延伸30s，6個循環；94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環；72°C延伸 ;3min，4°C終止反應。
5.根據權利要求1所述的一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法，其特征在于基于“孟德爾定律”由工蟻基因型逆推出生殖蟻的預期基因型，再根據生殖蟻基因型推算出后代基因型的頻率預期值，再將工蟻基因型頻率觀測值與工蟻基因型頻率預期值進行卡方檢驗。
全文摘要
本發明涉及一種鑒定白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA方法，在野外采集同一巢群的20頭以上白蟻樣品，提取樣品基因組DNA，稀釋。在GenBank上查找與白蟻生殖模式相關的微衛星位點，利用軟件Primer Premier 5.0在微衛星重復序列的側翼設計引物，選用微衛星引物對白蟻樣品DNA進行PCR擴增后在自動分析儀上進行電泳，用SAGAGT軟件測定電泳圖中每個條帶對應樣品的基因型。基于“孟德爾定律”對白蟻樣品的觀測基因型頻率與期望基因型頻率進行卡方檢驗，判定白蟻巢群的生殖模式。采用本發明對長沙10個黑胸散白蟻巢群生殖模式的微衛星DNA鑒定表明簡單巢群7個、擴大巢群2個和混合巢群1個。本發明操作簡便，結果可靠，可準確判斷白蟻巢群的生殖模式，對制定防治白蟻策略有重要參考價值。
文檔編號C12Q1/68GK102559896SQ20121000607
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者李剛華, 雷朝亮, 黃求應 申請人:華中農業大學