專利名稱：一種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術和分析技術領域，具體的說是ー種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統及其在木糖快速檢測中的應用。
背景技術：
木糖是ー種重要的碳水化合物，在人們的生產生活中具有非常重要的作用。在自然界中，天然D-木糖是以多糖的形態存在于植物中，它們在農產品的廢棄部分中(例如玉米的穗軸、秸桿、棉桃的外皮)含量很高，木糖是其自然降解和人為降解中的重要產物。利用木糖發酵生產こ醇可以提高原料的利用率和燃料こ醇的產量，降低燃料こ醇的生產成本，因此目前已經受到越來越多的關注。在細菌中有的能利用D-木糖作為碳源生長，在動物中羊幾乎能完全地利用木糖。在動物的蛋白多糖中D-木糖與多肽鏈的絲氨酸殘基以糖苷鍵連接，成為多糖側鏈與蛋白質的橋接結構。木糖醇是木糖通過加氫制得的，其用途非常廣泛。在發達國家木糖已應用于寵物飼料。木糖可以作為糖尿病人的耐受性好的無熱量甜味劑、營養劑和治療劑。它還可以作為加熱食品增香劑，用于焙烤食品、火腿、香腸、臘肉、人造肉等。木糖還被廣泛應用于肉食加工、肉類香料以及制備食品抗氧劑等方面。另外，木糖已作為軟化劑、離子表面活性剤、增塑劑、水分調節劑等用于油漆、牙膏、卷煙、制革、鋳造、火藥等多種行業。因此，快速、高靈敏度、高選擇性、實時的木糖檢測對遺傳、人類營養、食品技術、醫藥以及包括生物燃料在內的生物過程等領域極其重要。目前，木糖的檢測方法有還原法、酶學方法、色譜法、拉曼光譜法和紅外光譜法等。但是這些方法存在各種各樣的問題，例如，采用還原法檢測時，其靈敏度較低，而且易受到其他有顔色和還原性物質的干擾；在酶學方法中，酶的來源和純化是個至關重要的問題；色譜法包括氣相色譜法、液相色譜法和離子色譜法，存在的主要問題是樣品制備過程復雜、操作費時、誤差較大、需要昂貴設備等。因此，建立ー種快速、靈敏、特異的木糖實時檢測方法，勢在必行。 酶學方法的優點是靈敏度高、特異性好，但是酶的純化和穩定性是難以解決的問題。木糖脫氫酶(XDH) (EC 1.1.1.175)是ー些微生物中木糖代謝途徑的關鍵酶。木糖在木糖脫氫酶的催化下，借助于輔酶NAD+，被氧化成木糖酸內酷，輔酶NAD+則被還原為NADH。細菌表面呈現系統是微生物表面呈現系統的ー個重要分支，其基本策略也是將外源蛋白或多肽與細菌表面蛋白融合或嵌合并活性表達于細菌表面。自從發現大腸桿菌外膜蛋白LamB、OmpA和PhoE能夠作為外源蛋白的表面呈現載體以來，該技術得到了迅猛發展，現已成為研究的熱點，在微生物學、分子生物學、疫苗學等多個領域的基礎和應用研究中得到了廣泛應用。冰核蛋白(ice-nucleation protein, INP))是丁香假單胞菌等菌株的外膜蛋白，可加速純水的冰晶形成。INP通過糖基磷脂酰肌醇而錨定在細菌表面，利于大分子蛋白的表面呈現。冰核蛋白細菌包括假單胞菌屬、歐文氏菌屬和黃單胞菌等。目前，利用全長的冰核蛋白、去掉中間重復序列的串連N端、C端結構域的蛋白或只用N端結構域的蛋白均在大腸桿菌表面成功展示了外源蛋白，例如:綠色熒光蛋白、幾丁質酶和磷酸鹽結合蛋白等。近年來,在Pseudomonas borealis菌株中發現一種新的冰核蛋白基因inaPb,它與已熟知的冰核蛋白只有 66 %的同源性。

發明內容
本發明的目的是提供一種基于冰核蛋白的細菌表面展示系統及其在木糖檢測中的應用。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:ー種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統:細菌表面展示系統為編碼目標蛋白木糖脫氫酶的基因序列xylB和負責跨膜定位和轉運的冰核蛋白N端結構域的基因序列 inaPb-N。編碼目標蛋白木糖脫氫酶的基因序列XylB和負責跨膜定位和轉運的冰核蛋白N端結構域的基因序列inaPb-N融合，表達于宿主細胞表面，得到基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統。基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統的應用:所述細菌表面展示系統用于木糖的高特異性、高靈敏度檢測。所述細菌表面展示系統用于D-木糖的高特異性、高靈敏度檢測。檢測原理是木糖在菌體表面的木糖脫氫酶的催化下，借助于輔酶煙酰胺腺嘌呤ニ核苷酸(NAD+)被氧化成木糖酸內酷，輔酶NAD+則被還原為還原態的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。NADH在340nm處有特征吸收峰，因此可以根據340nm處的吸光值來求得木糖的含 量。本發明的效果是:1.本發明利用冰核蛋白表面展示系統將木糖脫氫酶穩定地展示在細菌的表面，從而解決了胞內酶提取過程復雜和穩定性低的難題。2.本發明細菌表面展示的木糖脫氫酶酶活高，與原始菌株中胞內的木糖脫氫酶相比，穩定性好。3.本發明細菌表面展示的木糖脫氫酶特異性好，其他糖類，如D-葡萄糖、纖維ニ糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-果糖、D-蔗糖、D-木糖醇、D-麥芽糖和L-阿拉伯糖對D-木糖的測定均無干擾。4.本發明構建的基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統靈敏度高，具有較寬的木糖檢測范圍(5-900 PM)和較低的檢測限(2 PM)。5.本發明構建的木糖脫氫酶展示菌株可以固定在電極上，構建電化學生物傳感器，實現木糖的檢測，而且此菌體可以重復多次使用，穩定性好。6.本發明構建的木糖脫氫酶展示菌株可開發成ー種生物催化劑，用于生物燃料電池等領域。7.通過本發明提供的細菌表面展示系統建立了木糖快速檢測的方法。此方法靈敏度高、特異性好、操作簡單、成本低，可用于食品、果蔬、糖酒飲料、肉食、食品添加剤、保健品、醫藥，和化妝品、牙膏、卷煙等エ業領域，以及發酵、生物轉化、生物能源等生物過程領域中木糖的監測。


圖1為本發明實施例提供的木糖脫氫酶基因xdh的PCR產物膠回收圖。A是DL2000分子量標準是基因xdh的PCR產物膠回收條帯。圖2為本發明實施例提供的木糖脫氫酶基因inaPb-N的PCR產物膠回收圖。A是DL2000分子量標準；B是基因inaPb-N的PCR產物膠回收條帶。圖3為本發明實施例提供的木糖脫氫酶細菌表面展示系統的載體構建流程圖。圖4為本發明實施例提供的紫外分光光度計檢測D-木糖的標準曲線圖。本發明目的、功能及優點將結合實施例，參照附圖做進ー步說明。
具體實施例方式本發明構建基于木糖脫氫酶細菌表面展示系統，利用紫外分光光度計檢測信號，從而得到木糖的含量，進而用于木糖的快速檢測，具體為:1.構建基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統；2.制作木糖檢測的標準曲線；3.測定實際樣品中的木糖，根據標準曲線計算得出木糖的含量。實施例1細胞表面展示木糖脫氫酶菌體的獲得:1.培養木糖脫氫酶的新月柄桿菌株(Caulobacter crescentus NA1000)(市購產品):將上述菌株接種于培養基中置30°C，200rpm，搖床培養24小時。培養基成分:植物蛋白胨5.0g，酵母提取物2.5g，K2HPO4 3.7g, KH2PO4L 3g,MgSO4 7H20 0.5g，NaCl 1.0g,蒸餾水 1.0L, pH 7.2-7.5，高溫滅菌，待用；2.培養冰核蛋白細菌Pseudomonas borealis (市購產品):將上述菌株于培養基中置22°C，200rpm，搖床培養16小時。培養基成分是:胰蛋白胨1.5% (g/100ml)，大豆蛋白胨0.5% (g/100ml)，氯化鈉
0.5% (g/100ml)，用蒸餾水配制而成，調節pH為7.2±0.2，經121 °C壓カ蒸汽滅菌后，待用。3.重組表達載體的構建。I)以新月柄桿菌(C.crescentus NA1000)基因組DNA為模板,設計并合成引物,進行PCR擴增，得到編碼木糖脫氫酶的基因xylB。引物是Pl (5，— 3，):CGGGATCCATGTCCTCAGCCATCTATCCCAGCC 和 P2 (5，— 3，):CCCAAGCTTACGCCAGCCGGCGTCGATCCAGT。PCR 反應體系為:ddH20 34.7 y L，模板DNA 1 u L, IOXPCR Buffer (Mg2+Free) 5 u L,MgCl2(25mmol/L)3u L,引物 Pl (20pmol/y L) I y L，引物 P2 (20pmol/μL) I y L，dNTPMixture (各 2.5mmol/L)4u L, TaKaRa Taq (5U/u L) 0.3 u L0 反應參數為:95°C 預變性 5min，94°C 30s，59°C 30s, 72°C 60s，30 個循環，最后 72°C延伸 lOmin。將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收(參見圖1)，連接于PMD-19Tsimple載體,構建重組質粒,命名為pMDXdh。2)以冰核蛋白細菌Pseudomonas borealis菌株基因組DNA為模板,設計并合成引物，進行PCR擴增，得到編碼冰核蛋白N端結構域的基因inaPb-N。
弓丨物是 P3 (5，— 3，):CATGCCATGGGCATGAACGATGACAAAGTTTTGGTC 和 P4 (5，— 3，):CGGGATCCCACCGCTGTCTCCAGCGTTTGTG。PCR 反應體系為:ddH20 34.7 y L，模板DNA I u L, 10XPCR Buffer (Mg2+Free) 5 u L,MgCl2(25mmol/L)3u L,引物 P3 (20pmol/y L) I y L，引物 P4 (20pmol/y L) I y L，dNTPMixture (各 2.5mmol/L)4u L, TaKaRa Taq (5U/u L) 0.3 u L0 反應參數為:95°C 預變性 5min，94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 60s，30 個循環，最后 72°C延伸 lOmin。將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收(參見圖2)，連接于pMD-19Tsimple載體。得到的重組載體用限制性內切酶Nco I和BamH I雙酶切，然后連接到經同樣雙酶切的載體pET28a(+)上，得到的重組載體命名為pTInaPb-N。3)將上述載體pMDXdh用限制性內切酶BamH I和Hind III雙酶切，然后與同樣雙酶切的載體PTInaPb-N連接，得到xylB和inaPb-N的融合基因；4.重組載體的表達。將重組載體轉化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3),即得到細胞表面展示木糖脫氫酶的菌體(參見圖3)。酶切鑒定正確后接種于新鮮的含卡那霉素(30ii g/ml)的LB液體培養基中，振蕩培養至吸光度(OD6J為 0.4時，加入IPTG (異丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷)使其終濃度為lmmol/L，25°C誘導培養24h，待用。大腸桿菌E.coli BL21(DE3)在LB培養基中培養，LB培養基成分為:5g/L酵母膏，10g/L 蛋白胨，10g/L NaCl。實施例2利用構建的木糖脫氫酶細菌表面展示系統，借助紫外分光光度計進行木糖的快速檢測:
1.標準曲線的繪制:將上述實施例所得細胞表面展示木糖脫氫酶菌體進行誘導表達，24h后收獲菌體，用50mM PBS緩沖液(pH 8.0)洗滌三次，將菌體密度調整至OD6tltl =
1.0。向Iml反應液(50mM PBS緩沖液，pH 8.0)中加入上述100 u L的菌液、NAD+(終濃度為ImM)和不同濃度的D-木糖溶液(終濃度為0-1000 u M)，進行平行操作，混勻，在30°C水浴鍋中放置，10分鐘后取出，12000rpm/min，離心I分鐘，取上清液，移入微量比色皿中，波長340nm處進行光譜測定，以50mMPBS緩沖液(pH 8.0)調零。最后以木糖濃度為橫坐標，波長340nm處的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，可得一條直線，求出其斜率，即為D-木糖的工作標準曲線斜率(參見圖4)。D-木糖的工作標準曲線如圖4所示，由圖可知，該工作標準曲線的R2值達到
0.999，線性擬合度很好，其斜率為0.0029。2.D-木糖的檢測過程。向反應液中加入上述IOOii L的菌液、NA+(最終濃度為ImM)和經稀釋過的含有D-木糖的待測樣品，進行平行操作，混勻，在30°C水浴鍋中放置，10分鐘后取出，離心，取上清液于分光光度計波長340nm處測量其吸光度，以50mM PBS緩沖液(pH8.0)調零。根據測得的吸光度，利用D-木糖工作標準曲線計算出D-木糖的含量。實施例3秸桿經過物理化學處理之后的降解產物中D-木糖含量的測定:1.樣品處理:將秸桿經物理化學處理之后的降解液用0.22 Pm的一次性濾膜進行過濾處理，用50mM PBS緩沖液(pH 8.0)進行稀釋(稀釋比例分別是10倍、100倍、1000
倍)，備用。
2.制備展示有木糖脫氫酶的菌體:將上述實施例所得細胞表面展示木糖脫氫酶菌體接種于新鮮的含卡那霉素(30iig/ml)的LB液體培養基中，振蕩培養至吸光度(0D_)為 0.4時，加入IPTG使其終濃度為lmmol/L，25°C誘導培養24h，收獲菌體，洗滌，用50mMPBS緩沖液(pH 8.0)將菌體密度調整至OD600 = 1.0。3.D-木糖檢測過程:具體步驟見實施例2。4.D-木糖濃度的計算:取吸光值在標準曲線范圍內的稀釋比例的吸光值來進行計算，代入標準曲線得出的計算公式，最后乘以相應的稀釋倍數，從而得到原秸桿降解液中D-木糖的濃度為84.87 ± 1.45mM。D-木糖濃度計算公式為:
權利要求
1.一種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統，其特征在于:細菌表面展示系統為編碼目標蛋白木糖脫氫酶的基因序列xylB和負責跨膜定位和轉運的冰核蛋白N端結構域的基因序列inaPb-N。
2.按權利要求1所述的基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統，其特征在于:編碼目標蛋白木糖脫氫酶的基因序列xylB和負責跨膜定位和轉運的冰核蛋白N端結構域的基因序列inaPb-N融合，表達于宿主細胞表面，得到基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統。
3.一種權利要求1所述的基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統的應用，其特征在于:所述細菌表面展示系統用于木糖的高特異性、高靈敏度檢測。
4.權利要求3所述的基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統的應用，其特征在于:所述細菌表面展示系統用于D-木糖的高特異性、高靈敏度檢測。
全文摘要
本發明涉及生物技術和分析技術領域，具體的說是一種基于冰核蛋白的木糖脫氫酶細菌表面展示系統及其應用。細菌表面展示系統為編碼目標蛋白木糖脫氫酶的基因序列xylB和負責跨膜定位和轉運的冰核蛋白N端結構域的基因序列inaPb-N。將所述細菌表面展示系統用于木糖檢測。本發明對木糖檢測的方法靈敏度高、特異性好、方法簡單，適用于食品、果蔬、糖酒、飲料、肉食、食品添加劑、保健品、醫藥，和化妝品、牙膏、卷煙等工業領域，以及發酵、生物轉化、生物能源等生物過程領域中木糖的監測。
文檔編號C12N1/21GK103087969SQ201210007398
公開日2013年5月8日 申請日期2012年1月11日 優先權日2011年10月28日
發明者劉愛驊, 梁波 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所