專利名稱：一種新型的無動物源、無飼養層的人多能干細胞培養系統的制作方法
技術領域：
本發明細胞培養技術領域，特別涉及一種新型的無動物源、無飼養層的人多能干細胞培養系統，適用于人多能干細胞的長時間培養。
背景技術：
人多能干細胞典型特點是，在體外不斷自我更新，同時保持向各個胚層細胞分化的潛能。由于人胚胎干細胞建立涉及倫理與法律等問題，其研究與應用受到一定的限制。而誘導多能干細胞很好地解決了人胚胎干細胞存在的倫理爭議，同時由于其具有與人胚胎干細胞相似的特性，即自我更新與分化潛能，因而為再生醫學尤其是個性化的治療帶來了希望。人多能干細胞不僅為基礎研究提供了獨特的模型，而且在細胞移植治療方面具有巨大的應用價值。然而在培養人多能干細胞時，其與動物源制品(如動物血清或動物蛋白) 的接觸會提高這種細胞吸收非人源代謝產物或被非人源病原污染的風險。例如，在有動物源成分存在的培養體系中，細胞會吸收并表達唾液酸Neu5Gc。由于人類循環系統中存在識別Neu5Gc的抗體，當含有Neu5Gc的細胞或組織移植入人體時，機體會識別這些非人源的抗原，從而對移植細胞或組織產生排斥反應，造成移植失敗。同時飼養層的存在導致耗費大量的人力和物力，且飼養層細胞的批次性也會導致系統的不穩定性。因此，確定培養系統中的各種成分則有利于優化培養系統并具有較高的可重復性。近年，研究者們研究發展出如下不同的人多能干細胞的培養系統(一)飼養層培養體系的發展人多能干細胞最初在以小鼠的胚胎干細胞的培養系統衍化而來的條件下建立并進行培養的，即含有鼠胚胎成纖維細胞的飼養層以及含有胎牛血清的培養基。為降低培養系統中非人源成分，研究者嘗試不同組織來源的人源細胞作為飼養層培養人多能干細胞。 Richard(Richards, Μ. , Fong, C. Y. , Chan, ff. K. , Wong, P. C. &Bongso, A.、Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2002、20、9、933_6。)等首次以胎兒 / 成人成纖維細胞作為飼養層，以人血清作為培養基，建立首個無動物源的培養系統。隨后人骨髓來源間充質細胞，新生兒包皮細胞，人胚胎干細胞分化來源的成纖維樣細胞，胎盤來源的間充質干細胞等被嘗試用作人多能干細胞的飼養層。雖然各種人源細胞用于培養人多能干細胞， 但是其支持人多能干細胞不分化的能力各不相同。這可能與細胞來源，培養條件的不同等因素有關。同時，制備飼養層的細胞也需要大量的人力、物力，其批次之間的差異性也無法解決。因此，發展無飼養層的培養系統具有更大的應用價值。( 二)無飼養層培養體系的發展Xu(Xu,C. ,et al. >Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells,Nat Biotechnol、2001、19、10、971_4。)等首次報道將人多能干細胞培養在由 Matrigel (BD公司)作為細胞外基質以及鼠胚胎成纖維細胞來源的條件培養基構成的無飼養層的培養系統內。兩種培養系統內人胚胎干細胞的mRNA表達譜相似,說明在此無飼養層的培養系統內，細胞不會受到額外的刺激。Matrigel是鼠EHS瘤細胞的提取物，因其來源提高人多能干細胞臨床應用的風險以及其成分的不確定性，因此研究者們嘗試以純化的蛋白或人工合成物替代Matrigel。在胚胎成纖維細胞來源的條件培養基作為培養基以及含牛血白蛋白的無血清培養基中，層黏連蛋白(Laminin)、纖維連接蛋白(Fibronectin)和重組表達的玻璃粘連蛋白(Vitronectin)均被報道能夠代替Matrigel長期維持人多能干細胞的增殖。2006 年，Ludwig (Ludwig, T. E. , et al.、Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions、Nat Biotechnol、2006、24、2、185-7。)等報道在成分明確的培養基TeSR中使用四種大分子的混合物包括層黏連蛋白、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋白和膠原IV (Colagen IV)等成功培養人多能干細胞并在此培養系統中建立新的人多能干細胞細胞株。但由于此培養系統的高昂費用不便于推廣應用。(三)培養基的發展在含有胎牛血清的培養體系中，很多干細胞死亡并大量分化。隨后，Amit(Amit， M. , et al.、ClonalIy derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture、 Dev Biol、2000、227、2、271-8。)等嘗試用 KO SR(Invitrogen)代替胎牛血清降低了因血清批次間差異帶來的不穩定性。隨后Xu(Xu, C. , et al.、Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells、Nat Biotechnol、2001、19、10、971_4o ) 等應用鼠胚胎成纖維細胞來源的條件培養基，以Matrigel作為細胞外基質成分能長期維持人多能干細胞不分化的狀態，也就是現在最廣泛應用的培養方法。但是該培養直接接觸到鼠源、牛源的物質，對將來應用的臨床應用上會有很大的障礙。

發明內容
多能干細胞的培養需要有細胞外基質的支持，同時需要適合的培養基，然而現有的培養系統含有動物源制品，顯然提高了多能干細胞吸收非人源代謝產物或被非人源病原污染的風險。鑒于現有技術的不足，本發明旨在克服這個難點，通過應用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法從胎盤組織中提取了能夠支持人胚胎干細胞長期培養的細胞外基質蛋白即人源化基質，同時以人血漿為原料，以NaCl沉淀的方法獲得的組分配制成的人源化培養基，與人源化基質共同構成無動物源、無飼養層的培養系統。為實現該目的，本發明提供了一種新型的無動物源、無飼養層的人多能干細胞培養系統，它包括支持人多能干細胞長期培養的人源化基質和人源化培養基，所述的人源化基質富含人IV型膠原、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白，所述的人源化培養基富含纖維粘連蛋白和玻璃連接蛋白。優選地，所述的人多能干細胞培養系統中的人源化基質按如下步驟制備而成(I)新鮮胎盤去掉羊膜與臍帶后，剪成不超過O. 3X0. 3X0. 3cm大小的組織塊，以冷水將組織塊懸起，4°C攪拌，12h后，用ImmXlmm的篩網過濾，將截留的組織仍用冷水懸起，以冷水洗2天，每12h換水一次，第三次過濾后，將截留的組織用冷的IM NaCl緩沖液懸起，4°C攪拌；其中所述的NaCl緩沖液按如下方法配制58. 5g NaCl與25ml Tris緩沖液，溶于Milli-Q水中，調節pH至7. 5，定容至IL ;所述的Tris緩沖液按如下方法配制242. 28gTris堿溶于800ml Milli-Q水中，調節pH至7. 5，加Milli-Q水定容至IL ；(2)以冷的IM NaCl緩沖液洗4天，每12h換液一次，第八次更換NaCl緩沖液時， 用1_X1_的篩網過濾，將截留的組織用冷的O. 5M醋酸溶液懸起，4°C攪拌；(3)以冷的O. 5M醋酸溶液洗3天，每12h換液一次，第六次換O. 5M醋酸溶液時， 用ImmXlmm的篩網過濾，將截留的組織稱重；以胃蛋白酶組織為I : 400的質量比加入胃蛋白酶，同時以200g/L將酶與組織塊懸起于O. 5M醋酸溶液中，4°C攪拌24h ；(4)7100g，4°C離心lh，去掉上清，收集沉淀并稱重，以質量體積比為I : I的條件加入2M尿素緩沖液，4°C攪拌24h ;其中所述的尿素緩沖液按如下方法配制240. Og尿素、 12. Ig Tris 堿、18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，濃 HCl 調節 pH 至 7. 4，Milli-Q 水定容至2L ；(5) 13000rpm，4°C離心30min，上清液裝入25KD的透析袋中，以TBS緩沖液+0. 5% 氯仿為周圍溶液于4°C透析2h，然后徹底清洗燒杯與透析袋外表面后，以冷的TBS緩沖液為周圍溶液，繼續4°C透析，每2h換TBS緩沖液一次，共換3次，最后一次透析時，4°C，過夜， 透析好的液體，即為人源化基質；其中所述的TBS緩沖液按如下方法配制12. Ig Tris堿， 18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，濃 HCl 調節 pH 至 7. 4，Milli-Q 水補齊至 2L。優選地，所述的人多能干細胞培養系統中的人源化培養基含有人血漿的NaCl沉淀組分。優選地，所述的人血漿的NaCl沉淀組分按如下步驟制備而成(I)將經過安全檢測的四種血型的血漿，以等體積比例混合，分裝成36ml/BD管， 每管加入6ml的林格液，混合均勻后再加入2MCaC12至終濃度為20mM，混勻，置于37°C水浴鍋孵育兩小時，將已凝固的血漿，存于_20°C過夜；(2)將處理過的血漿從_20°C冰箱拿出置于4°C冰箱，過夜解凍，高速冷凍離心機在4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，即是血漿來源的血清；(3)在4°C冷柜中，向血清中緩慢、均勻地加入NaCl，至終濃度為28/100ml，攪拌過夜；(4)高速冷凍離心機在4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，將收集的上清用濾紙過濾掉懸浮的小顆粒；(5)將過濾的上清，裝入25KD的透析袋中，在冷的雙蒸水中攪拌透析2小時以上；(6)重復步驟(5)兩次；(7)將步驟6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12培養基，攪拌透析過夜；(8)取出透析袋內的溶液，以外部DMEM/F12培養基為對照，280nm測定蛋白濃度， O. 22 μ m過濾后，保存于4°C，此即為血漿的NaCl沉淀組分。上述步驟(I)中所述的林格液按如下方法配制JfNaCl O. 9g,KCl O. 042g, CaCl2 O. 0242g，溶于IOOml的雙蒸水，用O. 22 μ m的濾膜過濾備用。與現有技術相比，本發明涉及的人多能干細胞培養系統具有如下優點和顯著的進
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少(I)制備成本低。本發明以胎盤為原材料制備人源化基質，胎盤是一種富含細胞外基質蛋白的人體組織，嬰兒出生后即被廢棄，因而具有來源廣泛，成本低廉等特點。(2)無動物源、無飼養層。本發明應用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法從胎盤組織中提取了能夠支持人胚胎干細胞長期培養的細胞外基質蛋白即人源化基質，同時以人血漿為原料，以NaCl沉淀的方法獲得的組分配制成的人源化培養基，與人源化基質共同構成無動物源、無飼養層的培養系統。這一培養系統能夠長期維持人胚胎干細胞的自我更新以及分化的潛能，同時無動物源的人誘導多能干細胞細胞系也可在這一培養系統中建立，因此這一成本低廉，易于擴大培養的無動物源、無飼養層培養系統為多能干細胞的臨床應用打下基礎。(3)促進干細胞貼壁。與Matrigel的成分相似，本發明的細胞外基質富含人IV 型膠原(Collagen IV)、纖維粘連蛋白(Fibronectin)和層粘連蛋白(Laminin)(見圖 2-A、B、C)。同時，本發明通過以人的血漿為原材料，比較陰離子交換柱層析、飽和硫酸銨沉淀和NaCl沉淀的方法，最后選定利用NaCl沉淀的方法從人血漿中提取制成了血漿抽提物，配制成人源化的培養基，該培養基富含纖維粘連蛋白(Fibronectin)和玻璃連接蛋白 (Vitronectin)(見圖2_D、E)，對促進干細胞的貼壁有重要作用。(4)可長時間培養人胚胎干細胞。通過實驗證明，本發明的人源化細胞外基質和人血漿抽提物，可長時間培養人胚胎干細胞，經過39代(約270天)的培養，胚胎干細胞仍然保持核型的穩定(見圖3-B)，并且具有和傳統培養方法相似的形態學特征，干性相關基因的表達水平(見圖3-A、C、D)。為了檢測在該人源化系統中，干細胞是否能保持三胚層分化的全能性，發明人分別檢測了其在體外、體內分化的能力(圖4-A、B)。體外的EBs和體內畸胎瘤都檢測到三胚層的代表標記。(5)支持誘導產生誘導多能干細胞。更進一步，通過進行人多能干細胞的誘導試驗證明，本發明的人源化干細胞培養系統能夠支持誘導人皮膚細胞去分化成為誘導多能干細胞，誘導產生的誘導多能干細胞能表達多能性相關的蛋白(圖5-A)以及相似的RNA表達水平(圖5-B)。由于重編程的另一個主要特征是表觀遺傳的改變，發明人檢測了 0ct4與 Nanog基因啟動子的甲基化水平，結果顯示誘導多能干細胞的甲基化水平與人真皮成纖維細胞相比大大降低，與干細胞的水平相近。這說明其形成確實經歷了表觀水平的變化(圖 5-C)，且誘導的誘導多能干細胞具有體外、體內的朝三胚層分化的潛能(圖6-A、B)。


通過下面結合附圖對本發明的優選實施例進行的描述，本發明的技術方案及其技術效果將變得更加清楚，且更加易于理解。其中圖I示出了本發明的人源化基質制備流程圖。圖2示出了人源化基質(FCF matrix)及培養基(XF medium)大分子成分的電泳圖。Western blot 顯不人源化基質中富含 Collagen IV、Fibronectin 和 Laminin(A、B、C)， 而培養基中富含Fibronectin以及Vitronectin等細胞外基質蛋白(D、E)。圖3示出了培養在本發明培養系統中的hESCs具有正常核型以及表達多能性相關的蛋白。(A)明場中培養在傳統MEF-CM/MG系統(左)以及無動物源無飼養層(XF/FCF)系統的H7細胞的形態；⑶在XF/FCF中培養39代后，H7細胞的G-帶染色結果；(C)FACS分析不同培養條件下，表達多能性相關的蛋白0ct4，SSEA4，TRA-1-60 and TRA-1-81的H7細胞的百分比；兩者之間沒有明顯區別。(D)定量RT-PCR分析不同培養系統中，H7細胞0ct4， Sox2 and Nanog的表達量(基因的表達水平以GAPDH的表達量歸一)，兩者之間沒有明顯區別。圖4示出了培養在XF/FCF的H7體內體外均具有向三胚層細胞分化的潛能。(A) RT-PCR分析由MEF-CM/MG(左)以及XF/FCF(右)培養的H7分化形成的EBs基因表達情況； (B)H7在XF/FCF培養14代后在N0D/SCID小鼠體內形成畸胎瘤，對畸胎瘤進行蘇木精-伊紅染色。箭頭指示來源于三胚層的典型結構。標尺，100 μ m。圖5示出了形成的hiPSCs表達多能性相關蛋白同時具有與胚胎干細胞hESCs相似的甲基化水平。(A)iPS細胞表達0ct4，SSEA4，TRA-l-60以及TRA-1-81等蛋白的免疫熒光染色，標尺，100 μ m ; (B)定量RT-PCR分析H7與iPS細胞內0ct4，Sox2以及Nanog的表達量，基因的表達水平以GAPDH的表達量歸一 ；(C)重亞硫酸鹽測序分析H7，HDFs以及iPS 細胞內，0ct4與Nanog啟動子甲基化狀態，空圈代表未甲基化的CpGs，黑圈代表甲基化的 CpGs。圖6示出了形成的hiPSCs體內體外均具有向三胚層細胞分化的潛能。(A)RT-PCR 分析由iPS (右)與H7 (左)分化形成的EBs基因表達情況；(B) Cl-OSN在XF/FCF培養7代后在N0D/SCID小鼠體內形成畸胎瘤，對畸胎瘤進行蘇木精-伊紅染色。箭頭指示來源于三胚層的典型結構。標尺，100 μ m。
具體實施例方式本發明提供的新型無動物源、無飼養層的干細胞培養系統主要包含二個主要的方面1)干細胞賴以貼壁生長的細胞外基質(FCF matrix) ；2)維持胚胎干細胞自我更新的細胞培養基(XF medium)。I、人源化基質的提取我們通過對Matrigel提取方法的優化，發展出了一種簡單易行的從胎盤中提取細胞外基質的方法。首先，我們從醫院取得乙肝、艾滋病、梅毒等檢測陰性的健康產婦的胎盤。根據人源化基質提取過程主要分為四部分(圖I)，首先將胎盤組織剪碎，其次去除血液蛋白與細胞蛋白，再次提取細胞外基質蛋白的組分，最后除菌以及透析到TBS溶液中。I、I準備試劑(I) 2M Tris 緩沖液，pH 7. 5242. 28g Tris 堿溶于 800ml Milli-Q 水中，調節 pH 至 7. 5，加 Milli-Q 水補齊至 1L。(2) IM NaCl 緩沖液，pH 7. 558. 5g NaCl與25ml 2M Tris緩沖液，溶于Milli-Q水中，調節pH至7. 5補齊至 1L。(3) 2M尿素緩沖液240. Og 尿素，12. Ig Tris 堿，18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，濃 HCl 調節 pH 至7. 4，Milli-Q水補齊至2L。(4) TBS 緩沖液12. Ig Tris 堿，18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q 水中，濃 HCl 調節 pH 至 7. 4， Milli-Q水補齊至2L。
(5) 75% 乙醇溶液。所有溶液儲存于4°C。1、2準備胎盤(I)取回的新鮮胎盤儲存于冰盒內。(2)去掉羊膜與臍帶后，將胎盤剪成大概5X5cm的組織塊，_80°C保存。(3)提取基質時，將胎盤組織塊取出，室溫解凍。(4)以解剖剪剪成不超過O. 3X0. 3X0. 3cm大小的組織塊，稱取重量。1、3實驗步驟(I)以2L左右的冷水將組織塊懸起，4°C攪拌，1 1后，用ImmX Imm的篩網過濾。將截留的組織仍用2L冷水懸起。(2)以冷水洗2天，每12h換水一次。(3)第三次過濾時，將截留的組織用2L冷的IM NaCl緩沖液懸起，4°C攪拌。(4)以冷的IM NaCl緩沖液洗4天，每12h換液一次。(5)第八次更換NaCl緩沖液時，ImmX Imm的篩網過濾，將截留的組織用冷的O. 5M
醋酸溶液懸起，4 °C攪拌。(6)以冷的O. 5M醋酸溶液洗3天，每1此換液一次。(7)第六次換O. 5M醋酸溶液時，ImmX Imm的篩網過濾，將截留的組織稱重。以胃蛋白酶組織為I : 400的質量比加入胃蛋白酶(P印sin)，同時以200g/L將酶與組織塊懸起于O. 5M醋酸溶液中。4°C攪拌24h。(8)7100g，4°C離心，lh。去掉上清，收集沉淀并稱重。(9)以質量體積比為I : I的條件加入2M尿素溶液。4°C攪拌24h。(10) 13000rpm,4°C離心 30min。保留上清。(11)上清裝入25KD的透析袋中，以TBS+0. 5%氯仿為周圍溶液透析，4°C，2h。(12)徹底清洗燒杯與透析袋外表面后，以冷的TBS為周圍溶液，繼續透析，4°C。(13)每2h換TBS —次，共換3次，最后一次透析時，4°C，過夜。(14)將透析好的液體，即為FCF matrix，在超凈臺內小心分裝于I. 5ml EP管內，
盡量避免溫度升高。保存于_20°C。與Matrigel的成分相似,本發明制備的人源化基質富含人IV型膠原(Collagen IV)、纖維粘連蛋白(Fibronectin)和層粘連蛋白(Laminin)(見圖2-A、B、C)。2、人源化培養基的制備2、I準備試劑(I)Ringer solution NaCl :0. 9g, KCl :0. 042g, CaCl2 :0. 0242g,溶于 100ml 的 ddH20,用 O. 22um 的濾膜
過濾備用。(2) 2M CaCl2 CaCl2 :11. lg，溶于 50ml 的 ddH20,用 O. 22um 的濾膜過濾備用。2、2血漿處理(I)將經過安全檢測的四種血型的血漿，以等體積比例混合，分裝成36ml/BD管。 每管加入6ml的Ringer solution,混合均勻。再加入2M CaCl2至終濃度為20mM,混勻，置于37 °C水浴鍋孵育兩小時。
(2)將已凝固的血漿，存于_20°C過夜。
2、3實驗步驟
(I)將處理過的血漿從_20°C冰箱拿出置于4°C冰箱，過夜解凍。
(2)高速冷凍離心機在4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，即是血漿來源的血清。
(3)在4°C冷柜中，緩慢、均勻的加入NaCl，至終濃度為28g/100ml，攪拌過夜。
(4)高速冷凍離心機在4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，將收集的上清用濾紙過濾掉懸浮的小顆粒。
(5)將過濾的上清，裝入25KD的透析袋中，在冷的ddH20中攪拌透析2小時以上。
(6)重復步驟(5)兩次。
(7)將步驟6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12，攪拌透析過夜。
(8)取出透析袋內的溶液，以外部DMEM/F12為對照，280nm測定蛋白濃度，O. 22 μ m過濾后，保存于4°C，此即為血漿的NaCl沉淀組分。
2、3人源化培養基配制
(I)微量元素的配制
MiIIi-Q水以濃HCl調節pH值至O. 9-1.0。稱取下列藥品
權利要求
1.一種新型的無動物源、無飼養層的人多能干細胞培養系統，其特征在于包括支持人多能干細胞長期培養的人源化基質和人源化培養基，所述的人源化基質富含人IV型膠原、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白，所述的人源化培養基富含纖維粘連蛋白和玻璃連接蛋白。
2.根據權利要求I所述的人多能干細胞培養系統，其特征在于所述的人源化基質按如下步驟制備而成(1)新鮮胎盤去掉羊膜與臍帶后，剪成不超過0.3X0. 3X0. 3cm大小的組織塊，以冷水將組織塊懸起，4°C攪拌，12h后，用1_X Imm的篩網過濾，將截留的組織仍用冷水懸起，以冷水洗2天，每12h換水一次，第三次過濾后，將截留的組織用冷的IM NaCl緩沖液懸起， 4°C攪拌；其中所述的NaCl緩沖液按如下方法配制58. 5g NaCl與25ml Tris緩沖液，溶于Milli-Q水中，調節pH至7. 5，定容至IL ;所述的Tris緩沖液按如下方法配制242. 28g Tris堿溶于800ml Milli-Q水中，調節pH至7. 5，加Milli-Q水定容至IL ；(2)以冷的IMNaCl緩沖液洗4天，每12h換液一次，第八次更換NaCl緩沖液時，用 ImmXlmm的篩網過濾，將截留的組織用冷的0. 5M醋酸溶液懸起，4°C攪拌；(3)以冷的0.5M醋酸溶液洗3天，每12h換液一次，第六次換0. 5M醋酸溶液時，用 ImmXlmm的篩網過濾，將截留的組織稱重；以胃蛋白酶組織為I : 400的質量比加入胃蛋白酶，同時以200g/L將酶與組織塊懸起于0. 5M醋酸溶液中，4°C攪拌24h ；(4)7100g，4°C離心lh，去掉上清，收集沉淀并稱重，以質量體積比為I: I的條件加入 2M尿素緩沖液，4°C攪拌24h ;其中所述的尿素緩沖液按如下方法配制240. Og尿素、12. Ig Tris 堿、18. Og NaCl 溶于 I. 8L Milli-Q水中，濃HCl 調節 pH至 7. 4，Milli_Q水定容至 2L ；(5)13000rpm，4°C離心30min，上清液裝入25KD的透析袋中，以TBS緩沖液+0. 5%氯仿為周圍溶液于4°C透析2h，然后徹底清洗燒杯與透析袋外表面后，以冷的TBS緩沖液為周圍溶液，繼續4°C透析，每2h換TBS緩沖液一次，共換3次，最后一次透析時，4°C，過夜，透析好的液體，即為人源化基質；其中所述的TBS緩沖液按如下方法配制12. Ig Tris堿，18. Og NaCl溶于I. 8L Milli-Q水中，濃HCl調節pH至7. 4，Milli-Q水補齊至2L。
3.根據權利要求I所述的人多能干細胞培養系統，其特征在于所述的人源化培養基含有人血漿的NaCl沉淀組分。
4.根據權利要求3所述的人多能干細胞培養系統，其特征在于所述的人血漿的NaCl 沉淀組分按如下步驟制備而成(1)將經過安全檢測的四種血型的血漿，以等體積比例混合，分裝成36ml/BD管，每管加入6ml的林格液，混合均勻后再加入2M CaCl2至終濃度為20mM，混勻，置于37°C水浴鍋孵育兩小時，將已凝固的血漿，存于-20 V過夜；(2)將處理過的血漿從_20°C冰箱拿出置于4°C冰箱，過夜解凍，高速冷凍離心機在 4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，即是血漿來源的血清；(3)在4°C冷柜中，向血清中緩慢、均勻地加入NaCl，至終濃度為28g/100ml，攪拌過夜；(4)高速冷凍離心機在4°C，以16000rpm離心30分鐘，收集上清，將收集的上清用濾紙過濾掉懸浮的小顆粒；(5)將過濾的上清，裝入25KD的透析袋中，在冷的雙蒸水中攪拌透析2小時以上；(6)重復步驟(5)兩次；(7)將步驟6透析的透析袋放入冷的DMEM/F12培養基，攪拌透析過夜；(8)取出透析袋內的溶液，以外部DMEM/F12培養基為對照，280nm測定蛋白濃度，0.22 um過濾后，保存于4°C，此即為血漿的NaCl沉淀組分。
5.根據權利要求4所述的人多能干細胞培養系統，其特征在于步驟(I)中所述的林格液按如下方法配制JfNaCl 0. 9g，KCl 0. 042g，CaC12 0. 0242g，溶于IOOml的雙蒸水，用0.22um的濾膜過濾備用。
全文摘要
本發明涉及一種新型的無動物源、無飼養層的人多能干細胞培養系統，應用胃蛋白酶消化以及尿素提取的方法從胎盤組織中提取了能夠支持人胚胎干細胞長期培養的細胞外基質蛋白即人源化基質，同時以人血漿為原料，以NaCl沉淀的方法獲得的組分配制成的人源化培養基，與人源化基質共同構成無動物源、無飼養層的培養系統。這一培養系統能夠長期維持人胚胎干細胞的自我更新以及分化的潛能，同時無動物源的人誘導多能干細胞細胞系也可在這一培養系統中建立，因此這一成本低廉，易于擴大培養的無動物源、無飼養層培養系統為多能干細胞的臨床應用打下基礎。
文檔編號C12N5/0735GK102586176SQ201210007010
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者牟曉寧, 王奇慧, 馬躍 申請人:中國科學院生物物理研究所