專利名稱：牛支原體烯醇化酶及其編碼基因的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛支原體烯醇化酶及其編碼基因的新用途，特別涉及牛支原體烯醇化酶及其編碼基因在制備檢測纖溶酶原以及檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途。本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
牛支原體(Mycoplasma bovis)屬于柔壁菌門柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬，是牛支原體相關(guān)疾病的病原，可引起犢牛肺炎、乳腺炎、角膜炎和關(guān)節(jié)炎，是一種重要的呼吸道病原體，目前牛支原體粘附宿主細(xì)胞的機(jī)制都還不明確。1961年，Hale在美國首次從一例患乳腺炎的牛乳中分離到該病原。目前，在北美洲、歐洲以及亞洲，牛支原體已經(jīng)成為一種重要的病原菌并在多個(gè)國家與地區(qū)都有牛支原體相關(guān)疾病導(dǎo)致嚴(yán)重了經(jīng)濟(jì)損失的報(bào)道。2008年，牛支原體首次在我國被分離鑒定，但到現(xiàn)在為止還沒有該疾病引起經(jīng)濟(jì)損失的統(tǒng)計(jì)報(bào)道。牛支原體作為一種重要的牛呼吸道疾病的病原菌，有關(guān)它的粘附過程、致病機(jī)理以及免疫預(yù)防已經(jīng)成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。牛支原體通過在牛上呼吸道粘膜的定植，降低機(jī)體抵抗力引起其它病原體的繼發(fā)感染。牛支原體表面沒有發(fā)現(xiàn)專門的粘附結(jié)構(gòu)，但是在其表面具有一組多變表面脂蛋白。該蛋白家族是多種病原菌的表面免疫相關(guān)蛋白，并且在致病菌與宿主細(xì)胞的黏附以及侵染宿主的過程中起到重要作用；同時(shí)具有很強(qiáng)的免疫原性，能夠刺激宿主產(chǎn)生很強(qiáng)的粘膜免疫。 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在牛支原體表面存在除Vsp蛋白家族之外的粘附因子，例如pMB67、P26 抗原等并推測牛支原體表面存在著其它的粘附相關(guān)因子。纖溶酶原及其激活物廣泛存在于生物體內(nèi)是一種92Ku大小的單鏈糖蛋白，在體外具有真核生物糖蛋白激活活性。該分子的結(jié)構(gòu)包含有一個(gè)N端的氨基酸激活區(qū)其中包含著一個(gè)K5結(jié)合區(qū)，以及一個(gè)絲氨酸蛋白酶活性的區(qū)域。纖溶酶原以及它所激活轉(zhuǎn)換成的纖溶酶參與著眾多生理以及病理過程例如，纖維蛋白的溶解、周質(zhì)蛋白溶解、癌細(xì)胞的組織侵染過程以及神經(jīng)元細(xì)胞的死亡過程等。眾多細(xì)菌和支原體在其表面都存在纖溶酶原結(jié)合區(qū)域結(jié)構(gòu)，使得這些病原體具有了菌體表面相關(guān)的水解蛋白能力，而這一能力能夠加強(qiáng)其在宿主內(nèi)的侵染能力與擴(kuò)散能力。新的研究還表明結(jié)合纖溶酶原可以明顯加強(qiáng)病原菌粘附宿主細(xì)胞的能力。已經(jīng)有數(shù)種纖溶酶原結(jié)合受體在細(xì)菌及支原體中得到鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在克隆表達(dá)牛支原體基因時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)表達(dá)纖溶酶原結(jié)合蛋白的基因，并命名其為P18，該基因表達(dá)大小約為67Ku的重組蛋白。測序發(fā)現(xiàn)該蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。經(jīng)序列比對分析證實(shí)，該蛋白與牛支原體烯醇化酶(Genebank登錄號(hào)為YP_004683492. 1)的氨基酸序列具有100%的同源性，因此確定本發(fā)明所克隆得到的基因?yàn)榕Ｖгw烯醇化酶基因。在體外表達(dá)該基因的重組蛋白后，通過western blot分析證明，證實(shí)牛支原體烯醇化酶具有良好的免疫活性，可被牛支原體抗體識(shí)別，從而可推測該基因可能是一種重要的牛支原體毒力基因。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，牛支原體烯醇化酶還具有與纖溶酶原的結(jié)合活性。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。首先，本發(fā)明提出了牛支原體烯醇化酶在制備檢測纖溶酶原試劑中的用途，優(yōu)選的，所述的牛支原體烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a) SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有與纖溶酶原結(jié)合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的烯醇化酶含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提出了編碼所述烯醇化酶的基因在制備檢測纖溶酶原試劑中的用途，優(yōu)選的，所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)編碼SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)編碼具有與纖溶酶原結(jié)合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物是通過將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換、 缺失或插入而獲得的仍具有與纖溶酶原結(jié)合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的基因含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。其次，本發(fā)明提出了牛支原體烯醇化酶在制備檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途，優(yōu)選的，所述的牛支原體烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a) SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的烯醇化酶含有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提出了編碼所述烯醇化酶的基因在制備檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途，優(yōu)選的，所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)編碼SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)編碼具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物是通過將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得的仍具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的基因含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。需要說明的是，蛋白質(zhì)的功能是由氨基酸序列所決定的，但是并不是說一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替換、缺失或插入都必將影響該蛋白質(zhì)的功能，這一點(diǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。在本發(fā)明提供的氨基酸序列的基礎(chǔ)上本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過保守方式替換所述序列的氨基酸而方便地獲得本發(fā)明蛋白的多種衍生物。例如，可用其他疏水性氨基酸替換序列中的疏水性氨基酸，或用芳香族氨基酸替換其他芳香族氨基酸或用堿性氨基酸替換其他堿性氨基酸等，當(dāng)然也可通過缺失或插入的方式刪除或增加幾個(gè)或多個(gè)氨基酸，只要該獲得的蛋白仍具有與本發(fā)明所述的蛋白相同的功能則都應(yīng)該包括在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)，其中所述功能包括對支原體抗體的免疫原性和/或與纖溶酶原結(jié)合的能力，而不論這種免疫原性和/或與纖溶酶原結(jié)合能力強(qiáng)弱大小發(fā)生怎樣的變化，都應(yīng)視為具有支原體抗體的免疫原性和/或與纖溶酶原結(jié)合的能力。本發(fā)明通過原核表達(dá)，獲得了牛支原體烯醇化酶并通過調(diào)整誘導(dǎo)條件成功的可溶性表達(dá)了該蛋白，并通過重組牛支原體烯醇化酶與纖溶酶原配體實(shí)驗(yàn)以及牛支原體烯醇化酶與牛支原體抗體Western blot實(shí)驗(yàn)最終證明該蛋白具有纖溶酶原結(jié)合活性與免疫原性， 因此能夠用于檢測纖溶酶原以及用于檢測或診斷由牛支原體引起的感染或疾病。并且也為以后研究牛支原體粘附機(jī)制，致病力以及疫苗的研制開辟了新的道路。


圖1為牛支原體烯醇化酶基因(P18)的分段PCR擴(kuò)增片段電泳結(jié)果；1 :P18-5/P18-6 引物擴(kuò)增產(chǎn)物；2 :P18_3/P18_4 引物擴(kuò)增產(chǎn)物；3 :P18_1/P18_2 引物擴(kuò)增產(chǎn)物；C 負(fù)對照；M =DNA Marker圖2為牛支原體烯醇化酶基因(P18)重疊PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果；1-2 牛支原體烯醇化酶基因擴(kuò)增結(jié)果；C 負(fù)對照；M =DNAMarker圖3為表達(dá)、純化重組牛支原體烯醇化酶(P18)電泳結(jié)果；1 未誘導(dǎo)的pET_32a/BL21裂解液；2 誘導(dǎo)后的pET_32a/BL21裂解液；3 未誘導(dǎo)的PET-P18/BL21裂解液4 誘導(dǎo)后的pET_P18/BL21裂解液；5_6 純化后的牛支原體烯醇化酶重組蛋白；M :Protein weight Marker圖4為重組牛支原體烯醇化酶(P18)與纖溶酶原配體實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果；1 純化后的牛支原體烯醇化酶重組蛋白；2 =BSA ；M =Protein weight Marker圖5為牛支原體烯醇化酶(P18)與牛支原體抗體Wfestern blot實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果。1 純化后的牛支原體烯醇化酶重組蛋白；2 :E. coli蛋白；3 =BSA ；M =Protein weight Marker
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1牛支原體烯醇化酶基因(P18)的克隆和表達(dá)1、材料1. 1支原體培養(yǎng)牛支原體湖北分離株(HB)由本實(shí)驗(yàn)室分離并鑒定(Vassalli J D，Sappino A P, and Belin D. The plasminogen activator/plasmin system[J].J Clin. Invest. 1991. 88 ) :1067-1072)。按照文獻(xiàn)(Radaelli Ε, Luini Μ. Bacteriological, serological, pathological and immunohistochemical studies of Mycoplasma bovis respiratory infection in veal calves and adult cattle at slaughter[J], Research in Veterinary Science 2008. 85(2) :282-290.)描述的方法，在含有 20%馬血清、10%酵母浸出液以及醋酸鉈(0. 125mg/ml)與青霉素QOOIU/ml)的PPLO培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)菌種。 在37. 0°C下培養(yǎng)3 5d后4°C，13000r/min離心30分鐘收集菌體，并用PBS沖洗菌體3次。菌體存于-70°C冰箱1. 2主要試劑組織/細(xì)胞DNA(小量)抽提試劑盒(上海華舜生物技術(shù)公司)；膠回收試劑盒 (上海華舜生物技術(shù)公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(omega) ；DAB顯色試劑盒(碧云天)；多種 HRP 酶標(biāo)二抗(Sigma) ；Ni-NTA 樹脂(Novagen)；人血纖溶酶原(Sigma) ；rTaq 酶、dNTP、PCR Buffer (寶生物大連公司)。2、方法2. 1、基因組的提取與目的基因的克隆應(yīng)用組織/細(xì)胞DNA抽提試劑盒按照說明書獲取基因組。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測定的牛支原體湖北分離株(HB)全基因組序列(NC_015725. 1) (Li Y，Zheng H，Liu Y，et al. The Complete Genome Sequence of Mycoplasma bovis Strain Hubei-I[J]. 2011, PLoS ONE 6(6) :e20999.)，針對牛支原體烯醇化酶基因(P18)序列設(shè)計(jì)引物。由于在大腸桿菌中TGA 編碼是終止密碼子而在支原體中編碼為色氨酸。我們通過重疊PCR的方法設(shè)計(jì)3対特異性引物將牛支原體烯醇化酶基因(P18)中的TGA突變?yōu)門GG。引物信息見表1。反應(yīng)程序均為95°C 5min ；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 60s，共 32 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。表1牛支原體烯醇化酶基因(PlS)PCR擴(kuò)增引物
權(quán)利要求
1.牛支原體烯醇化酶在制備檢測纖溶酶原試劑中的用途，優(yōu)選的，所述的牛支原體烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)將SEQID NO :1所示的氨基酸序列通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有與纖溶酶原結(jié)合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的烯醇化酶含有SEQID N0:1所示的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求1所述烯醇化酶的基因在制備檢測纖溶酶原試劑中的用途，優(yōu)選的， 所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)編碼SEQID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)編碼具有與纖溶酶原結(jié)合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物的核苷酸序列， 該蛋白衍生物是通過將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得的仍具有與纖溶酶原結(jié)合活性的牛支原體烯醇化酶的蛋白衍生物。
4.按照權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的基因含有SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
5.牛支原體烯醇化酶在制備檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途，優(yōu)選的，所述的牛支原體烯醇化酶含有以下(a)或(b)的氨基酸序列(a)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；或(b)將SEQID NO :1所示的氨基酸序列通過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或插入而獲得的仍具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的烯醇化酶含有SEQID N0:1所示的氨基酸序列。
7.編碼權(quán)利要求5所述烯醇化酶的基因在制備檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途，優(yōu)選的，所述的基因含有以下(a)或(b)所述的核苷酸序列(a)編碼SEQID NO 1所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(b)編碼具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物的核苷酸序列，該蛋白衍生物是通過將SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換、缺失或插入而獲得的仍具有牛支原體烯醇化酶免疫原性的蛋白衍生物。
8.按照權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的基因含有SEQID NO :2所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了牛支原體烯醇化酶及其編碼基因的新用途。具體的，本發(fā)明公開了牛支原體烯醇化酶及其編碼基因在制備檢測纖溶酶原以及檢測或診斷牛支原體感染試劑中的用途。本發(fā)明通過原核表達(dá)，獲得了烯醇化酶蛋白并通過調(diào)整誘導(dǎo)條件成功的可溶性表達(dá)了該蛋白，進(jìn)一步的，通過重組烯醇化酶蛋白與纖溶酶原配體實(shí)驗(yàn)以及烯醇化酶蛋白與牛支原體抗體Western blot實(shí)驗(yàn)最終證明該蛋白具有纖溶酶原結(jié)合活性與免疫原性，因此能夠用于檢測纖溶酶原以及用于檢測或診斷由牛支原體引起的感染或疾病。并且也為以后研究牛支原體粘附機(jī)制，致病力以及疫苗的研制開辟了新的道路。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102533940SQ201210006999
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月11日
發(fā)明者劉洋, 李媛, 辛九慶 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所, 哈爾濱動(dòng)物生物制品國家工程研究中心有限公司