專利名稱：一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法
技術領域：
本發明涉及分子標記檢測技術，具體地說，涉及一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法。
背景技術：
隨著畜牧業的發展，外貌特征在雞的育種和保種中占據重要地位，分子標記也在育種和保種中起到了重要作用。但是對于控制外貌特征的分子標記的研究仍然較少，僅有少量的外貌特征能夠通過分子標記進行輔助選擇育種。烏骨雞作為中國特有雞種，具有烏皮、烏骨、烏肉等“十全”特征。其中烏骨雞的黑色特征主要受到纖維黑色素基因(Fm+/fm_)的影響。烏骨雞的結締組織呈黑色(Kuklenski， 1915)，雞冠、肉髯呈深紫色，耳朵、腳脛及喙呈藍色。攜帶Fm基因的雞種中，黑色素出現的部位包括肌膜、神經、肌腱、血管、性腺、腸系膜、骨膜與皮膚真皮層等。出于對烏骨雞“烏色”的重視，中國利用烏骨雞的骨頭與肌肉作為傳統中藥的引藥，一些攜帶Fm基因的改良雞種，飼養至12-14周齡作為傳統料理的食材。Fm基因控制的黑色表型相對于fm基因控制的非黑色表型是一種單位點控制的顯性性狀，因而在保種和育種的過程中，根據表型無法準確區分顯性純合子和雜合子個體，造成選育效率低下。隨著分子數量遺傳理論的發展，需找到影響真皮層黑色性狀的分子標記， 通過標記輔助選擇，可以迅速準確地鑒定候選個體的基因型，從根本上解決這一保種和育種問題。DNA分子標記是以個體間遺傳物質中的核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是 DNA水平遺傳多態性的直接反映。在雞基因組中分布有大量的分子標記，攜帶巨大的遺傳信息量，目前已經有多個重要性狀得到了定位，可以利用相關的分子標記進行分子標記輔助選擇育種，對育種起到了巨大的促進作用。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，是一種十分理想、有效的分子標記。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法。為了實現本發明目的，本發明提供一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法，其是對烏骨雞第20號染色體位于10739109bp位點(基于雞基因組序列信息版本號 WUGSC 2. l/gaK}a13，2006年5月)的核苷酸進行單核苷酸多態性檢測，根據檢測結果判定烏骨雞的纖維黑色素基因為純合或雜合。單核苷酸多態性檢測優選采用的方法為焦磷酸測序。本發明還檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的引物，包括F 5' -GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3‘和 R:5' -CATGCAGGATCTCTATGAAGAAAA-3‘。本發明還提供檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的探針，其核苷酸序列為CN 102534006 A5' -GTATTCTAGAAGCCATTCC-3‘。本發明還提供含有上述引物及探針的檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的試齊U盒。本發明進一步提供一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法，其是以烏骨雞的基因組DNA為模板，采用上述引物進行PCR擴增，然后用上述探針對擴增產物進行單核苷酸多態性檢測，根據檢測結果判定烏骨雞的纖維黑色素基因為純合或雜合；其中，單核苷酸多態性檢測是針對第20號染色體位于10739109bp位點的核苷酸。PCR反應體系為基因組DNA 30ng，Ix擴增緩沖液，Mg2+50mM，dNTPs 5mM，引物F 10 μ M，引物R 10 μ Μ, Taq DNA聚合酶1U，加水補至25 μ 1。PCR 反應條件為95°C 變性 5min ；95°C 變性 15sec，57°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，共 45 循環；72°C延伸 7min ；20°C保存。檢測待測雞第20號染色體位于10739109bp位點的基因型是AG還是GG (A為腺嘌呤核苷酸，G為鳥嘧啶核苷酸)；當基因型是AG時，A G= 1 1，則表示該位點在兩條染色體上都存在CNV (基因拷貝數變異)，每條染色體上都有一個拷貝的基因型是AA，一個拷貝的基因型是GG，待測雞為Fm黑色顯性純合；A G= 1 2時，則表示該位點只在一條染色體上存在CNV，一個拷貝的基因型是AA，一個拷貝的基因型是GG，另一條染色體上不存在 CNV,只有一個拷貝，基因型是GG，待測雞為Fm黑色顯性雜合；如果待測雞的基因型為GG，則表示該位點在兩條染色體上都不存在CNV，每條染色體上都只有一個拷貝，基因型是GG，待測雞為fm非黑色隱性純合。其中，單核苷酸多態性檢測采用的檢測方法為PyroMark ID定量遺傳分析系統 (Biotage公司)的Pyrosequencing焦磷酸測序技術。上述方法、引物對和探針、試劑盒可應用于雞的育種。本發明所提供的方法和產品(引物、探針、試劑盒)，對烏骨雞的Fm黑色性狀純合 /雜合進行選擇，可以直接將Fm黑色性狀純合子個體保留下來，從而大大地提高育種和保種效率。本發明為雞育種的分子標記輔助選擇提供了一個高效準確、簡便快速的分子遺傳標記，為雞的Fm黑色性狀的選種和保種提供了一種有效的分子標記育種手段。用該遺傳標記對雞的Fm黑色性狀進行標記輔助選擇，可有效地緩解實際育種和保種中的無法區分Fm 黑色純合子和雜合子的問題，提供選種保種效率，并為利用該性狀進行分子聚合育種奠定基礎，將加快育種進程。本發明的檢測方法操作簡單，費用低廉，準確度高，可實現自動化檢測。根據本發明的方法開發出相應的檢測試劑盒，可用于選擇攜帶有利基因型(AG，A G =1 1)的個體，為雞的育種保種工作提供便利。


圖1為本發明Pyrosequencing焦磷酸測序方法檢測純合子個體的烏骨雞第20號染色體位于10739109bp位點的單核苷酸多態性(基因型AG，A G = 1 1)。圖2為本發明Pyrosequencing焦磷酸測序方法檢測雜合子個體的烏骨雞第20號染色體位于10739109bp位點的單核苷酸多態性(基因型AG，A G = 1 2)。圖3為本發明Pyrosequencing焦磷酸測序方法檢測非黑色性狀雞第20號染色體位于10739109bp位點的單核苷酸多態性(基因型GG)。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用試驗材料及試劑均為市售商品。實施例中涉及的“ ％ ”，如無特殊說明，均為質量百分數。實施例1 Pyrosequencing焦磷酸測序檢測方法的建立及多態位點的確定1基因型分析1. 1家系構建構建專門用于研究定位影響雞結締組織黑色素沉積的纖維黑色素基因(Fm)的實驗群體，構建方法為F0代親本為絲羽烏骨雞公雞1只和尤溪麻雞母雞3只， 采用人工受精的方法，待收集到30枚蛋后同時入孵；Fl代出雛后，所有雛雞在同一飼養條件下按常規方法飼養，待性成熟后，從中挑選3只皮膚黑色程度深，且黑度相近的公雞，每只公雞與10只尤溪麻雞母雞組成家系，共組成3個家系，采用人工受精的方法，每收集到 120枚蛋后入孵，共入孵兩批；F2代出雛后，所有雛雞在同一飼養條件下按常規方法飼養至 12周齡。1. 2實驗材料本實驗選取了 Fm家系的3個家系的F0、F1和F2代個體，共計M5 個。在Fm家系中記錄了 F0、Fl和F2代個體的雞冠、腳脛、各種結締組織及真皮層皮膚顏色。1. 3基因組DNA的提取雞12周齡時翅靜脈采血，抗凝處理后裂解，經蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20°C保存。1.4 PCR 擴增以提取的基因組DNA為模板，用引物對跨第20號染色體10739109bp位點(基于雞基因組序列信息版本號WUGSC 2. l/g￡dGal3，2006年5月)的片段(Seq ID No. 4)進行 PCR擴增。 F 5' -GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3‘R 5' -biotin-CATGCAGGATCTCTATGAAGAAAA-3‘PCR反應體系05 μ 1)終濃度為基因組DNA 30ng，Ix擴增緩沖液，Mg2+50mM, dNTPs 5mM, F 10 μ Μ, R 10 μ Μ，Taq Gold DNA 聚合酶 1U，加滅菌水補至 25 μ 1。PCR 反應條件95°C變性 5min ；95°C變性 I5Sec, 57O退火 30sec, 72°C延伸 3Osec, 共45循環；72°C延伸7min ；20°C保存。1.5 PCR產物檢測取5 μ 1 PCR產物進行2 %瓊脂糖凝膠檢測。1. 6焦磷酸測序應用PyroMark ID定量遺傳分析系統，以PCR產物為模板，用引物對10739109bp 位點進行焦磷酸測序。使用的探針為S 5' -GTATTCTAGAAGCCATTCC-3‘1. 6. 1試樣預處理，單鏈分離純化操作1)在使用前，保證所有溶液都達到室溫；2)在PSQ 96板中預先加入45 μ 1含有0.3 μ M測序引物的退火引物，一般情況下加入IOpM引物2μ 1 ；3)使用 Vertex 混勻 Sepharose beads ；4)將需要使用的s印haroe beads總量(每樣本3 μ 1)轉移到一個Eppendorf管中；5)在s印harose beads中加入結合緩沖液，使得平均每個樣品約有50 μ 1的體積， 將混合物混勻；6)將以上混合物加入PCR產物(50 μ 1反應體積)中，每樣本50 μ 1 ；7)將PCR產物在常溫下混勻10分鐘，使得beads與生物素結合，對于較長片段，可適當延長混勻時間；8)在Vacuum prep workstation中，四個樣品板中依次加入180ml高純水、70%乙醇、洗滌緩沖液和120ml變性緩沖液；9)打開 vacuum prep workstation 的泵，將 vacuum prep tool 在高純水中清洗 30 秒；然后將 vacuum prep tool 移至Ij PCR 板中，抓取 s印harose beads (請在 beads 與 PCR 產物結合后三分鐘內完成此操作，不要讓Beads又沉到管底)；拿起PCR板，檢查是否大部 ,Jf beads 者vacuum prep tool _t ；10)將 vacuum prep tool 放入 70% 乙醇中 5 秒；11)然后移到變性緩沖液中5秒；12)再移到洗滌緩沖液中清洗5-10秒；13)把吸頭放在相應含有測序引物的板孔的上方，不要接觸液面，關掉泵；14)將vacuum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放s印harose beads (測序引物也可最后加入)15)使用高純水清洗 vacuum prep tool ；16)將放有樣品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫，艮阿進行Pyrosequencing反應。1.6.2試樣上機1)打開 PyroMark ID 主機；2)打開電腦和相應操控軟件；3)選擇 SNP，SNP Runs 和 New SNP Run (或選擇 SQA)；4)填入 Run name,選擇 Instrument parameters ；5)選擇需要使用的樣品孔，并點擊Activate ；6)在 Entry 中填入 SNP entry (或 SQA)；7)準備好樣品，并加入樣品板中；8)準備酶和底物，并將所有試劑在使用前在室溫下放置10分鐘；9)將酶、底物和dNIPs加入試劑艙中；10)將放有試樣的經過試樣預處理的PSQ 96 Plate Low放置在儀器上；11)核實儀器參數選擇；12)點擊Run按鈕，運行；13)分析結果產生三種基因型
第一種基因型AG，A G = 1 1，待測雞為Rn黑色純合；第二種基因型AG，A G = 1 2，待測雞為Rn黑色雜合；第三種基因型GG，待測雞為fm非黑色純合。2相關性分析結果如表1所示，該結果表明，在所檢測的245個個體中，AG(A G = 1 1)基因型有2個，AG(A G=I 2)基因型有106個，GG基因型有137個，AG (A G=I 1) 基因型個體和AG(A G= 1 2)基因型個體均為Fm黑色性狀表型，GG基因型個體均為 fm非黑色性狀表型。其中AG(A G= 1 1)基因型個體均為顯性純合子，AG(A G = 1 2)基因型個體均為顯性雜合子，而GG基因型個體均為隱性純合子。表1第20號染色體10739109bp位點不同基因型與Fm黑色性狀的相關性分析統計
權利要求
1.一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法，其特征在于，對烏骨雞第20號染色體位于10739109bp位點的核苷酸進行單核苷酸多態性檢測，根據檢測結果判定烏骨雞的纖維黑色素基因為純合或雜合。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，單核苷酸多態性檢測所采用的方法為焦磷酸測序。
3.檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的引物，包括F 5' -GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3‘；和R 5' -CATGCAGGATCTCTATGAAGAAAA-3‘。
4.檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的探針，其核苷酸序列為 5' -GTATTCTAGAAGCCATTCC-3‘。
5.檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的試劑盒，其含有權利要求3所述的引物及權利要求4所述的探針。
6.一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合或雜合的方法，其特征在于，以烏骨雞的基因組DNA為模板，采用權利要求3所述的引物進行PCR擴增，然后用權利要求4所述的探針對擴增產物進行單核苷酸多態性檢測，根據檢測結果判定烏骨雞的纖維黑色素基因為純合或雜合；其中，單核苷酸多態性檢測是針對第20號染色體位于10739109bp位點的核苷酸。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，單核苷酸多態性檢測所采用的方法為焦磷酸測序。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應體系為基因組DNA30ng, Ix擴增緩沖液，Mg2+50mM，dNTPs 5mM，引物F 10 μ M，引物R 10 μ Μ, Taq DNA聚合酶1U，加水補至25μ 1。
9.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為95°C變性5min;95°C 變性 15sec，57°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，共 45 循環；72°C延伸 7min ；20°C保存。
全文摘要
本發明提供了一種檢測烏骨雞纖維黑色素基因純合/雜合的方法，其是對烏骨雞第20號染色體位于10739109bp位點(基于雞基因組序列信息版本號WUGSC 2.1/galGal3，2006年5月)的核苷酸進行單核苷酸多態性檢測，根據檢測結果判定烏骨雞的纖維黑色素基因為純合或雜合。通過對烏骨雞的Fm黑色性狀純合/雜合進行選擇，可以直接將Fm黑色性狀純合子個體保留下來，從而大大地提高育種和保種效率。本發明的檢測方法操作簡單，費用低廉，準確度高，可實現自動化檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102534006SQ201210011338
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者李寧, 田明, 胡曉湘 申請人:中國農業大學