專利名稱：一種油菜種子rna提取的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種適于油菜種子的RNA提取方法，利用熱硼酸鹽法提取高質量、高純度的油菜籽總RNA，以滿足新一代測序文庫構建、種子發育相關基因的克隆、表達分析及驗證對RNA質量的要求。
背景技術：
油菜種子中蛋白質、油脂、纖維含量較高，特別在成熟種子中更為嚴重，而RNA含量相對較低。此外種皮中富含色素、單寧、多酚等代謝產物，這些物質的存在嚴重影響RNA 提取的獲得率，而且會直接干擾隨后的文庫構建、反轉錄等實驗。因此如何提取完整性好、 純度高的RNA是研究油菜種子發育、油脂代謝調控相關基因克隆、表達驗證等實驗的前提。 目前已有大量商品化的試劑盒應用于植物總RNA的提取，如hvitrogen和!^rmentas等知名分子試劑公司的試劑盒，其RNA提取質量完好，但價格相對昂貴；Takara的RNA提取試劑盒價格適中，但提取的RNA蛋白和鹽離子含量均較高，這些雜質的存在會影響文庫構建的效率，很可能導致文庫構建的失敗，僅能用于反轉錄等實驗，達不到文庫構建的要求。不少研究者進行了油菜籽RNA提取方法的探討，提出了 CTAB法、SDS法等等，所提取的RNA可成功用于反轉錄等，但是否可以應用于cDNA文庫構建尚未有報道。

發明內容
為了解決現有技術存在的問題，本發明提供了一種新的方法，通過熱硼酸鹽法提取油菜籽總RNA，減少蛋白和鹽離子污染，避免其干擾cDNA文庫的構建。本發明所述油菜種子RNA提取方法如下
1)將熱硼酸鹽提取緩沖液[ο.2M十水合硼酸鈉，30mM乙二醇-雙- -氨基乙醚)四乙酸(EGTA)，1% (w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)，1% (w/v)脫氧膽酸鈉，10 mM 二硫蘇糖醇 (DTT), 1% (ν/ν)酞菁氧釩(IGEPAL CA-630), 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)]預熱至 65 0C ；
2)100 mg油菜籽液氮速凍研磨成粉后加入Iml預熱的提取緩沖液，繼續研磨成勻漿；
3)將勻漿轉至1.5ml離心管中，42°C恒溫搖床孵育1. 5h;
4)向上述勻漿中加入2M氯化鉀至終濃度160mM以沉淀蛋白，5000rpm，20min，4°C離
心；
5)轉移上清至新的離心管后，加入8M氯化鋰(LiCl)至終濃度2M，冰浴過夜；
6)次日，10000rpm，20min，4°C離心，棄上清，沉淀用預冷的2MLiCl洗滌，lOOOOrpm， 15min，4°C離心，棄上清；
7)重復上述洗滌步驟2-3次；
8)沉淀溶解于250μ1IXTE緩沖液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH,8. 0), lOOOOrpm, 15min，4°C離心以去除不溶雜質；
9)轉移上清至新管中，加入1/10體積的2M醋酸鉀(Kac)(pH，5. 5)，冰浴15min后IOOOOrpm, 15min，4°C離心；
10)轉移上清至新管，加入1/10體積的3M醋酸鈉(NaAc)(pH，6. 0),2. 5倍體積的冰酒精、2 μ 1肝糖，-80°c靜置l-2h;
11)13000rpm，15min，4°C離心，沉淀用70%酒精洗滌后，溶解于適量無RNase水中，-80°C保存備用。本方法所提取油菜籽總RNA質量完好、沒有明顯降解現象，0擬60/0D280和0擬60/ 0D230均在2.0左右，樣品中沒有其它雜質如蛋白、鹽離子的污染，產物獲得率大于40 Pg/100mg，符合cDNA文庫構建的要求。


圖1 不同RNA提取方法的比較 A:氯化鋰-酚方法；
B: Takara公司提供試劑盒； C:本發明熱硼酸方法； D: Invitrogen提供的試劑盒； M: marker DL2000。
具體實施例方式
將同一批次的油菜籽用4種不同方法提取RNA，提取產物于1%瓊脂糖凝膠上60伏(V) 電泳40分鐘，結果如圖1和表1所示。圖1中Al、A2為氯化鋰-酚法提取的RNA。提取方法是100g油菜籽于液氮中研磨成粉后轉至含適量提取緩沖液[8M LiCl, 2% (w/v) β-巰基乙醇]的離心管中，混勻后 4°C放置過夜，次日13000rpm 4°C離心3分鐘，沉淀用70% (ν/ν)酒精洗后晾干，然后將沉淀溶解于 Iml 溶解緩沖液
中，用飽和酚、酚氯仿異戊醇(25:24:1)、氯仿異戊醇(24:1)各抽提1次，向最后的上層水相中加入0. 1體積的3Μ NaAc和1. 5體積的乙醇，_20°C靜置 0. 5小時后13000rpm 4°C離心10分鐘，沉淀用70% (ν/ν)酒精洗后晾干，最后溶解于適量 RNase-free /K 中。Bi、B2 為 Takara RNAiso Plus 提取的 RNA(方法詳見 Takara Code: D9108A)。C1、C2為本發明所用的熱硼酸法提取產物，具體操作是
1)將熱硼酸鹽提取緩沖液[ο.2M十水合硼酸鈉，30mM乙二醇-雙- -氨基乙醚)四乙酸(EGTA)，1% (w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)，1% (w/v)脫氧膽酸鈉，10 mM 二硫蘇糖醇 (DTT), 1% (ν/ν)酞菁氧釩(IGEPAL CA-630), 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)]預熱至 65 0C ；
本發明中w/v是指g/mL;
2)100 mg油菜籽液氮速凍研磨成粉后加入Iml預熱的提取緩沖液，繼續研磨成勻漿；
3)將勻漿轉至1.5ml離心管中，42°C恒溫搖床孵育1. 5h;
4)向上述勻漿中加入2M氯化鉀至終濃度160mM以沉淀蛋白，5000rpm，20min，4°C離
心；
5)轉移上清至新的離心管后，加入8M氯化鋰(LiCl)至終濃度2M，冰浴過夜；
46)次日，10000rpm，20min，4°C離心，棄上清，沉淀用預冷的2MLiCl洗滌，lOOOOrpm， 15min，4°C離心，棄上清；
7)重復上述洗滌步驟2-3次；
8)沉淀溶解于250μ1IXTE緩沖液(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH,8. 0), lOOOOrpm, 15min，4°C離心以去除不溶雜質；
9)轉移上清至新管中，加入1/10體積的2M醋酸鉀(Kac)(pH，5. 5)，冰浴15min后 lOOOOrpm, 15min，4°C離心；
10)轉移上清至新管，加入1/10體積的3M醋酸鈉(NaAc)(pH，6. 0),2. 5倍體積的冰酒精、2 μ 1肝糖，-80°c靜置l-2h;
11)13000rpm，15min，4°C離心，沉淀用70%酒精洗滌后，溶解于適量無RNase水中，-80°C保存備用。Dl、D2 Shvitrogen 公司 RNA Reagent 提取的 RNA (方法詳見 hvitrogen Catalog Number: 15596-026)。表1 不同RNA提取方法的純度和得率
權利要求
1. 一種油菜種子RNA的提取方法，其特征在于包括下述步驟1)將熱硼酸鹽提取緩沖液預熱至65°C；所述熱硼酸鹽提取緩沖液成分為0. 2M十水合硼酸鈉，30mM乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸，1% (w/v)十二烷基硫酸鈉，1% (w/v)脫氧膽酸鈉，IOmM 二硫蘇糖醇，1% (ν/ν)酞菁氧釩，2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮；2)100mg油菜籽液氮速凍研磨成粉后加入Iml預熱的上述提取緩沖液，繼續研磨成勻漿；3)將勻漿轉至1.5ml離心管中，42°C恒溫搖床孵育1. 5h;4)向上述勻漿中加入2M氯化鉀至終濃度160mM以沉淀蛋白，5000rpm，20min，4°C離心；5)轉移上清至新的離心管后，加入8M氯化鋰至終濃度2M，冰浴過夜；6)次日，IOOOOrpm,20min，4°C離心，棄上清，沉淀用預冷的2M氯化鋰洗滌，IOOOOrpm, 15min，4°C離心，棄上清；7)重復上述洗滌步驟2-3次；8)沉淀溶解于250μ1 IXTE緩沖液，IOOOOrpm, 15min，4°C離心以去除不溶雜質；9)轉移上清至新管中，加入1/10體積的2M醋酸鉀，pH5.5，冰浴15min后lOOOOrpm， 15min，4°C離心；10)轉移上清至新管，加入1/10體積的3M醋酸鈉，？!16.0;2.5倍體積的冰酒精、2口1 肝糖，-80°C靜置l_2h;11)13000rpm，15min，4°C離心，沉淀用70%酒精洗滌后，溶解于適量無RNase水中，-80°C保存備用。
全文摘要
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種適于油菜種子的RNA提取方法，該方法將熱硼酸鹽提取緩沖液預熱至65℃；再將油菜籽液氮速凍研磨成粉后加入預熱的上述提取緩沖液，繼續研磨成勻漿；孵育后用氯化鉀沉淀蛋白，再經離心、除雜等步驟得到總RNA。本方法所提取油菜籽總RNA質量完好、沒有明顯降解現象，OD260/OD280和OD260/OD230均在2.0左右，樣品中沒有其它雜質如蛋白、鹽離子的污染，產物獲得率大于40μg/100mg，符合cDNA文庫構建的要求。
文檔編號C12N15/10GK102433325SQ20121001400
公開日2012年5月2日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者杜坤, 王娟, 王幼平, 蔣金金, 邵彥林 申請人:揚州大學