專利名稱：稻瘟病菌無毒基因分子檢測引物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及稻瘟病菌無毒基因分子檢測的引物及其用法，專用于稻瘟病菌無毒基因Avrpik和Avrpizt的快速分子檢測，屬于農作物病害防治和抗病育種領域。
背景技術：
稻癌病是由 Magnaporthe oryzae (無性態Pyricularia oryzae)弓丨起的一種突發性強、易于流行的水稻病害，是世界各水稻產區廣泛分布的重要病害之一。利用寄主抗性，培育和種植抗病品種可以有效地控制植物病害的發生。迄今，通過廣泛的遺傳分析，已定位了 85個稻瘟病抗性基因和347個數量性狀位點(Quantitative trait loci, QTL), 絕大部分的基因和QTL被定位在水稻的不同染色體上，其中Pi21、Pi21、Pi22、Pi23、Pi34、 Pi35 (t)、Pbl、Pif、Pikurl、Pikur2、Pi-sel 11個屬于單基因控制的部分抗性基因，其余的 74個均為主效抗性基因。在85個基因中，70個基因采用分子標記進行了染色體定位，5個基因通過與已知基因的等位性測定確定了其染色體位置。目前已從水稻中克隆了 13個稻癌病抗性基因，即 Pib、Pita、Pi2、Pi9、Pi-zt、Pi-d2、Pi36、Pi37、Pikm、Pit、Pi5、Pid3、Pikh 以及2個QTL位點，即P21和Pbl。
水稻對稻瘟病的抗性屬于典型的小種專化性抗性，水稻的抗病基因與病菌的無毒基因之間存在特異性識別。病菌無毒基因與寄主植物抗病基因之間可以發生符合“基因對基因假說”的相互作用，即寄主植物中每個顯性的抗病基因，在病原菌中對應一個顯性的無毒基因。寄主的抗病基因產物通過直接或間接的方式對病原菌的無毒基因產物進行識別， 啟動防衛反應，進而產生對病原菌的抗性，只有寄主植物中存在相應的抗病基因，而病菌中又存在相應的無毒基因，植株才會表現出抗病性。
目前雖然已鑒定出較多的抗稻瘟病基因，但是考慮到基因的抗譜，在特定水稻種植地區能夠應用的抗病基因數目仍然有限。由于QTL表達受環境等因素影響較大，長期以來抗病育種中應用的大都是主效抗病基因，因此，導致生產中存在的突出問題是攜帶單一稻瘟病抗病基因的水稻品種大面積推廣種植3-5年后即變為感病品種，這也是長期困擾育種家和植物病理學家的難題。
稻瘟病菌具有復雜的多樣性和高度的變異性，無毒基因是病原菌中決定寄主植物品種特異抗性表達與否的基因，其缺失、表達破壞或功能區域的變異將導致病原菌群體中產生新的毒性小種，繼而導致含有對應抗病基因的作物品種喪失抗病性。了解和監測田間稻瘟病菌的無毒基因組成可以為通過品種合理布局和輪換防治稻瘟病以及選用抗病基因進行抗病育種工作提供重要的信息。
鑒定稻瘟病原菌無毒基因的傳統方法是利用攜帶單一稻瘟病抗病基因的近等基因系或單基因系，通過在水稻苗期進行人工接種，觀察植株的抗感反應型來分析病菌所攜帶的無毒基因。采用人工接種技術鑒定病菌的無毒基因，首先需要從植株的發病部位分離獲得病菌的單孢子培養物，然后種植鑒別品種，在4-5葉期噴霧接種。該方法的主要缺陷是需要分離病菌，人工接種耗時較長，從育苗至完成植株表型調查至少需要30天；另外，人工接種后水稻植株需要低溫和保濕處理，如果同時對多個菌株進行接種分析，需要相互隔離， 因而需要較大的能控制環境條件的空間。
稻瘟病菌無毒基因的克隆和分子檢測技術的發展為檢測病菌無毒基因提供了可能。目前國內外研究者已定位了 40多個稻瘟病菌無毒基因，其中9個已被克隆。PWLl 和 Pm^ 首先被克隆出來，2000 年以后，AvrPi-ta、Avrl_C039、ACEU AvrPiz-t、AvrPia、 AvrPii、AvrPik/km/kp等7個無毒基因又先后被克隆。設計稻瘟病菌無毒基因特異性引物， 通過PCR或熒光定量PCR技術，將有效地分析稻瘟病菌無毒基因，可以為快速鑒定田間稻瘟病菌的無毒基因組成和分布提供一種新技術。發明內容
本發明的目的在于提供瘟病菌無毒基因分子檢測的引物，用于稻瘟病菌無毒基因 Avrpik和Avrpizt的快速分子檢測。
本發明的目的通過以下技術方案實現
稻瘟病菌無毒基因快速分子檢測引物，包括稻瘟病菌無毒基因Avrpik和Avrpizt 特異性擴增引物兩對，即Avrpik-F/R和Avrpizt-F/R，其序列分別為
Avrpik-F 5，_actttgggaactgtcgctgtc_3，；
Avrpik-R 5， _agctgtaacaggttccagcatc_3，；
Avrpizt-F 5， -aaaccagggcagccaaaga-3，；
Avrpizt-R 5， _attcccaatcgagccaacg_3，。
其中Avrpik-F/R在攜帶無毒基因Avrpik的稻瘟病菌株上擴增出184bp的產物； Avrpik-F/R在攜帶無毒基因Avrpizt的稻瘟病菌株上擴增出153bp的產物(圖1)。上述稻瘟病菌無毒基因分子檢測引物的用法包括
(1)稻瘟病菌單孢菌株無毒基因的檢測
將稻瘟病菌菌株轉接在番茄燕麥培養上，于^TC條件下培養5-7天，刮取培養基表面的菌絲和孢子約5mg用于DNA提取。液氮研磨菌體，加入600 μ 1 CTAB抽提液，65°C處理30min，每隔IOmin震蕩一次，加入等體積的苯酚，置于搖床上輕搖lOmin，10000rpm,4°C 離心lOmin，取上清，加入等體積的酚氯仿異戊醇25 24 1，輕搖lOmin，lOOOOrpm， 4°C離心lOmin，小心抽取上清，加入等體積氯仿異戊醇(24 1)，輕搖lOmin, lOOOOrpm, 4°C離心lOmin。重復上兩個步驟，直至有機相和水相之間無蛋白層出現，取上清，加入2/3 體積預冷的異丙醇，產生絮狀沉淀，用玻璃棒將DNA攪出，置于1. 5mL干凈離心管，75%乙醇清洗2次，吹干后溶于TE，保存于-20°C備用。
采用兩對特異性弓I物Avrp ik_F/R和Avrp i zt-F/R進行PCR擴增反應。PCR反應體系為 25 μ 1，含 IOXBuffer 2. 5 μ l,dNTP 2. O μ 1，10 μ mol/L 1. O μ 1 正向和反向引物，5U/ μ 1 Taq 酶 0· 2 μ 1，，20ng/ μ 1 模板 DNA2 μ l,ddH20 16. 3 μ 1。PCR 反應程序為94°C 5min, 94°〇458，56或591458，721 1. 5min，；35 個循環，終延伸 72°C IOmin0 擴增產物在 1.8%瓊脂糖凝膠中電泳，經染色后觀察擴增產物的大小判定結果。
(2)稻瘟病病樣上稻瘟病菌無毒基因的檢測
田間采集稻瘟病病樣，用于提取DNA。稱取5mg植株病斑處標樣，采用(1)的方法提取DNA，或者采用 Epicentre 公司的MasterPure DNA Purification Kit提取、純化DNA。DNA樣品溶解于10 20 μ 1 TE中，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后保存于_20°C備用。
采用兩對特異性弓I物Avrp ik_F/R和Avrp i zt-F/R進行PCR擴增反應。PCR反應體系為 25 μ 1，含 IOXBuffer 2. 5 μ l,dNTP 2. 0 μ 1，10 μ mol/L 1. 0 μ 1 正向和反向引物，5U/ μ 1 Taq 酶 0· 2 μ 1，20ng/ μ 1 模板 DNA2 μ 1，ddH20 16. 3 μ 1。PCR 反應程序為94°C 5min, 94°C 45s, 56-59°C 45s, 72°C 1. 5min，;35 個循環，以及終延伸 72°C IOmin0 擴增產物在 1. 8% 瓊脂糖凝膠中電泳，經染色后觀察擴增產物的大小判定結果。
本發明一方面提供了檢測稻瘟病無毒基因Avrpik和Avrpizt的特異性引物。為避免由于引物專化性較低，PCR反應中出現假陰性結果或對非目標真菌和非目標無毒基因產生非特異擴增，本發明根據無毒基因Avrpik (GeneBank No. AB498879)和Avrpizt (GeneBank No. EU837058)自身的序列，采用軟件CLUSTAL與稻瘟病菌其它無毒基因序列進行比較，尋找特異性序列區域；選擇Avrpik和Avrpizt特異性序列區域設計PCR引物，通過Blastn pogram(Http//www. Ncbi. nlm. nil. gov/blast)比較所設計的引物和探針序列與其它生物種是否具有顯著的同源性。本發明設計的Avrpik和Avrpizt的特異性引物與其它生物種和無毒基因沒有顯著同源性。
本發明另一方面提供了使用本發明的特異性引物對稻瘟病菌無毒基因進行檢測的方法，該方法的實驗步驟為從待測樣品提取DNA，進行PCR檢測，通過觀察擴增產物的大小判定樣品是否攜帶Avrpik和Avrpizt基因。
本發明與現有技術相比具有以下優點和效果
1)特異性好、鑒定速度快
采用人工接種的方法鑒定稻瘟病的無毒基因不僅需要從發病部位分離單孢子菌株，還需要種植水稻鑒別品種。本發明設計的引物是稻瘟病菌無毒基因Avrpik和Avrpizt 的特異性序列，擴增的特異性高，采用基因特異性引物PCR檢測方法克服了傳統人工接種鑒別技術費事費力的缺點。
2)實用性好、應用范圍廣
采用設計的特異性引物進行PCR分析，不僅可以檢測稻瘟病菌純合菌株是否含有 Avrpik和Avrpizt基因，也可以直接分析水稻稻瘟病病樣處病菌無毒基因的組成，直接用于田間稻瘟病菌種群動態的快速檢測。


圖1引物對Avrpik-F/R和AvrpiztF/R對稻瘟病菌基因組DNA的PCR擴增。M =DNA 標記DL2000 (Takara Biotech，大連，中國)；1-2 以引物對Avrpik-F/R分別擴增與Pik基因產生抗病反應和感病反應的菌株6a-5和6a-12 ；3-4 以引物對Avrpizt-F/R分別擴增與 Pizt基因產生抗病反應和感病反應的菌株9a-6和8b-2。
圖2引物對Avrpik-F/R對來自黑龍江省的稻瘟病菌株的PCR擴增。M =DNA標記 DL2000 (Takara Biotech，大連，中國)；1-20 代表來自黑龍江的稻瘟病菌株h-6，4a_2， 6b-ll，14b-4，5a-8，18a_l，21b_4，22a_l，22b_3，29a_5，6a_5，IOb-I,15b_2，15b_4，19b_l， 21b-2,22a-6,25a_7，28a_l，31a_2。
圖3采用引物對Avrpizt-F/R對來自黑龍江省的稻瘟病菌株的PCR擴增。M :DNA標記DL2000 (Takara Biotech，大連，中國)；1-20 代表來自黑龍江的稻瘟病菌株乜_2，5a_8，6b-ll，6a-5，10b_l，14b_4，19b_l，2a_6，21b_2，15b_2，21b_4，22a_l，22b_3，15b_4，18a_l， 22a-6, 25a-7,29a_5，28a_l，31a_2。
具體實施方式
下面結合具體實施實例，進一步闡述本發明。應當理解，下列實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護范圍。
(1)黑龍江省不同地區稻瘟病菌無毒基因分析
將2009年秋季從黑龍江省建三江，尚志、綏化、佳木斯農科所和856農場水稻田采集稻瘟病病樣，單孢分離獲得的稻瘟病菌株用于Avrpik和Avrpizt無毒基因的檢測分析。
首先將保存在濾紙片上的稻瘟病菌各菌株在番茄燕麥培養基斜面上活化，然后在番茄燕麥培養基平板上繼代，在26°C條件下培養5-7天，刮取培養基表面的菌絲和孢子約 5mg用于DNA提取。液氮研磨菌體，加入600 μ 1 CTAB抽提液，65°C保溫處理30min，每隔 IOmin震蕩一次，加入等體積的苯酚，置于搖床上輕搖lOmin，lOOOOrpm，4°C離心lOmin，取上清，加入等體積的酚氯仿異戊醇25 24 1，輕搖lOmin，lOOOOrpm，4°C離心lOmin， 小心抽取上清，加入等體積氯仿異戊醇(24 1)，輕搖lOmin，lOOOOrpm，4°C離心IOmin0 重復上兩個步驟，直至有機相和水相之間無蛋白層出現，取上清，加入2/3體積預冷的異丙醇，產生絮狀沉淀，用玻璃棒將DNA攪出，置于1. 5mL滅菌的離心管，75 %乙醇清洗2次，吹干后溶于TE，保存于-20°C備用。
采用兩對特異性引物Avrpik-F/R和Avrpizt-F/R進行PCR擴增反應。PCR反應體系為 25 μ 1，含 IOXBuffer 2. 5 μ l,dNTP 2. 0 μ 1，10 μ mol/L 1. 0 μ 1 正向和反向引物，5U/ μ 1 Taq 酶 0· 2 μ 1，20ng/ μ 1 模板 DNA2 μ 1，ddH20 16. 3 μ 1。PCR 反應程序為94°C 5min, 94°〇458，56或591458，721 1. 5min，；35 個循環，終延伸 72°C IOmin0 擴增產物在 1.8%瓊脂糖凝膠中電泳，經染色后觀察擴增產物的大小判定結果。
圖2和圖3表明經過特異性引物對Avrpik-F/R擴增，20個菌株中有8個擴增出約184bp的DNA片段，表明這些菌株攜帶Avrpik基因；12個菌株擴增出約15!3bp的DNA片段，表明這些菌株攜帶Avrpizt基因。
為了比較該發明與傳統人工接種方法鑒定結果的異同，采用攜帶Pi-k和Pi-Zt基因的水稻單基因系IRBL6和IRBLll分別接種上述20個菌株，觀察各菌株在上述兩個單基因系上的反應。
將水稻單基因系IRBL6和IRBLll播于塑料育秧瘟內，每盤50穴，每穴播10 12 粒，中間及兩邊播麗江新團黑谷作為感病對照。在植株三葉一心期采用噴霧法進行人工接種，用0.02% Tween20配制孢子懸浮液，分生孢子的濃度為2X IO6個/ml。接種后黑暗處理Mh，自然光照下生長5-7d，期間保持RH > 90%，待感病對照病情穩定后，按國際水稻所稻瘟病苗瘟分級標準進行調查，其中0 3級為抗病、4 9級為感病。3次重復。
表1顯示采用Pi-k和Pi-zt特異性引物通過PCR檢測的結果與采用抗病單基因系人工接種的結果一致。接種各菌株7-10d后，感病對照麗江新團黑谷葉片病斑面積達葉面積的50 70%，病級均達到9級。IRBL6和IRBLll接種各菌株后葉片的反應為1_8級， 其中經PCR檢測Avrpik為陽性的菌株，接種IRBL6后葉片的病級均小于3級，表現為抗病反應；經PCR檢測Avrpizt為陽性的菌株，接種IRBLll后葉片的病級均在3級以下，表現為抗病反應。兩種檢測方法均表明同一個菌株可以同時攜帶無毒基因Avrpik和AvrpiztJS 攜帶Avrpi-zt的頻率高于Avrpi-k，在黑龍江地區同時應用抗性基因Pi-zt和Pi-k有利于降低稻瘟病危害。
表1采用PCR和人工接種檢測稻瘟病菌的無毒基因Avrpik和Avrpizt
權利要求
1.稻瘟病菌無毒基因分子檢測引物，包括稻瘟病菌無毒基因Avrpik和Avrpiζt特異性擴增引物兩對，即Avrpik-F，Avrpik-R和Avrpizt_F，Avrpizt-R其序列分別為Avrpik-F 5， -actttgggaactgtcgctgtc-3，； Avrpik-R 5， -agctgtaacaggttccagcatc-3，； Avrpizt-F 5' -aaaccagggcagccaaaga-3 ‘； Avrpizt-R 5' -attcccaatcgagccaacg-3'。其中引物對Avrpik-F/R在攜帶無毒基因Avrpik的稻瘟病菌株上擴增出184bp的產物；引物對Avrpizt-F/R在攜帶無毒基因Avrpizt的稻瘟病菌株上擴增出153bp的產物。
2.權利要求1所述的稻瘟病菌無毒基因分子檢測引物的用法包括，可以檢測稻瘟病單孢菌株是否攜帶無毒基因Avrpik和Avrpizt，也可以直接檢測稻瘟病樣上稻瘟病菌無毒基因的組成。
全文摘要
本發明涉及稻瘟病菌無毒基因分子檢測的引物及其用法，用于稻瘟病菌無毒基因Avrpik和Avrpizt的快速分子檢測，屬于農作物病害防治和抗病育種領域。設計了兩對引物Avrpik-F/R和Avrpizt-F/R，可以分別檢測稻瘟病菌的無毒基因Avrpik和Avrpizt，特異性擴增的DNA片段長度分別為184bp和153bp。適用于稻瘟病菌純培養物和發病部位稻瘟病菌群體無毒基因組成的分析。
文檔編號C12Q1/68GK102534010SQ20121001352
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者周永力, 徐建龍, 李祥曉, 王疏, 黎志康 申請人:中國農業科學院作物科學研究所