專利名稱：擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌及菌劑和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用微生物的方法降解化學(xué)農(nóng)藥殘留的技術(shù)，具體涉及一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌及菌劑，以及在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化學(xué)農(nóng)藥在防治農(nóng)林業(yè)病蟲草鼠害等方面作出了巨大貢獻(xiàn)，是現(xiàn)代農(nóng)林業(yè)中是不可缺少的生產(chǎn)物質(zhì)，但農(nóng)藥作為一把雙刃劍，它們進(jìn)入自然環(huán)境后，對整個(gè)生態(tài)環(huán)境也帶來嚴(yán)重危害。農(nóng)藥的大量使用致使部分農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境農(nóng)藥殘留嚴(yán)重，而且殘留的農(nóng)藥通過食物鏈富集，直接或間接地危害人體健康。擬除蟲菊酯農(nóng)藥作為一類最受歡迎的殺蟲劑，目前廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物及家庭衛(wèi)生害蟲防除。第二代以后的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有對光、熱穩(wěn)定的特點(diǎn)，在環(huán)境中半衰期較長，很難在自然條件下快速降解，加之長期頻繁使用，有關(guān)其殘留的問題及危害日趨嚴(yán)重。 大量研究表明，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥低劑量殘留具有顯著的生物毒性，對多種動物，包括人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生嚴(yán)重危害。另外，部分?jǐn)M除蟲菊酯類農(nóng)藥還具有蓄積毒性，長期接觸可引起某些慢性疾病。因此，聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO) 和世界貿(mào)易組織(WTO)對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留作出嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟、 美國、日本等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)相應(yīng)的要求更為嚴(yán)格，使我國農(nóng)產(chǎn)品出口面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。 鑒于擬除蟲菊酯類農(nóng)藥應(yīng)用的廣泛性及其潛在危害，人們迫切需要尋找擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留控制新技術(shù)。利用微生物降解劑處理農(nóng)產(chǎn)品，是農(nóng)藥殘留控制處理的新領(lǐng)域、新途徑，具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是國際上殘留農(nóng)藥處理技術(shù)研究的前沿和熱點(diǎn)。目前許多發(fā)達(dá)國家和大公司企業(yè)都投入巨資以從事農(nóng)藥殘留高效降解菌的研究開發(fā)。實(shí)驗(yàn)室和實(shí)際應(yīng)用研究都表明利用微生物降解產(chǎn)品降解土壤和果蔬中的農(nóng)藥殘留，生產(chǎn)無公害的綠色食品是可行的。但是，利用微生物實(shí)現(xiàn)對農(nóng)藥進(jìn)行降解，機(jī)理十分復(fù)雜，具有很強(qiáng)的針對性。溴氰菊酯等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥近年來使用非常廣泛，目前還沒有發(fā)現(xiàn)專門針對這類農(nóng)藥的降解菌以及相關(guān)生物制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的生物降解技術(shù)的空白，提供一株擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌，其具有很好的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的生物制劑，應(yīng)用所述擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌制備得到一種新的菌劑。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供所述菌劑的應(yīng)用，所述菌劑可以應(yīng)用于使溴氰菊酯、 甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其主要中間產(chǎn)物間苯氧基苯甲酸的殘留量降低75%以上，具有較高的降解效果，生產(chǎn)和使用成本低。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
提供一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌，是革蘭氏染色陽性菌DG-02，2011年11月8 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址為湖北武漢市武昌珞珈山)，菌種保藏號為CCTCC M 2011382，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬sp.)，細(xì)胞桿狀，呈鏈狀排列，有芽孢；菌落白色，不透明，表面較粗糙，菌落較大，邊緣不整齊；接觸酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)陽性；氧化酶試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、絡(luò)氨酸水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)陰性；可以利用葡萄糖和檸檬酸鹽；該菌株的16S rDNA的GenBank登錄號為JN700990。所述擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌可應(yīng)用于去除擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其中間物殘留。具體可用于制備去除去除擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其中間物殘留的降解菌劑。所述擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌劑的生產(chǎn)工藝流程為斜面種一搖瓶種一種子罐培養(yǎng)一生產(chǎn)罐培養(yǎng)一包裝為液體劑型。具體地，所述降解菌劑的制備方法包括以下步驟
(I)將擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌DG-02的菌種接種于LB培養(yǎng)基搖瓶中，30 °C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；
所述LB培養(yǎng)基質(zhì)量百分比組成為酵母膏0.5%，蛋白胨l%，NaCl 1%。(2)將步驟(I)培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的體積比的8% 10%的接種量接種入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用質(zhì)量百分比培養(yǎng)基配方為酵母膏0.5%，蛋白胨 1%，NaCl 1%，pH 值為 7. 2 7. 5 ;
(3)將達(dá)到對數(shù)期的種子液按照8% 10%的接種量接種入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；
在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中，無菌空氣的通氣量為O. 45 O. 60 m3/min，攪拌速度為200 300 r/min，溫度30°C，全流程培養(yǎng)時(shí)間為36 48小時(shí)，經(jīng)生產(chǎn)罐培養(yǎng)所獲培養(yǎng)液即為菌劑。本發(fā)明所述擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌可以用于降解擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其主要中間產(chǎn)物的殘留，可較好地應(yīng)用于降解溴氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、間苯氧基苯甲酸等。優(yōu)選地，應(yīng)用量每平方米農(nóng)田施用50 mL濃度為I. OX IO8 CFU/mL的降解菌菌液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(I)本發(fā)明提供了一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌DG-02，有效解決了溴氰菊酯、 甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、間苯氧基苯甲酸等的降解難題，可使所述農(nóng)藥的殘留量降低75%以上。(2)本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用本發(fā)明降解菌生產(chǎn)制備得到的菌劑，高效安全，具有生產(chǎn)成本低，使用方便，降解效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在全國果蔬生產(chǎn)出口基地或有綠色食品標(biāo)志的地方大面積使用，為生產(chǎn)出無毒、無公害的綠色食品做出貢獻(xiàn)；
(3)本發(fā)明促進(jìn)協(xié)調(diào)統(tǒng)一病蟲害防治用藥與食品安全，對于大規(guī)模推廣使用果蔬農(nóng)藥微生物處理，生產(chǎn)無公害果蔬、綠色食品具有重要的意義。


圖I降解菌DG-02對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和間苯氧基苯甲酸的降解曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非特別說明，實(shí)施例中所采用的材料試劑和方法，為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的材料試劑和方法。實(shí)施例I降解菌DG-02的獲得
本發(fā)明人在2010年6月從中國廣東省東莞市土壤中通過常規(guī)的富集培養(yǎng)法分離得到一株降解菌菌株DG-02，于2011年11月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址為湖北武漢市武昌珞珈山)，菌種保藏號為CCTCC M 2011382，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬{Bacillus sp.)，細(xì)胞桿狀，呈鏈狀排列，有芽孢；菌落白色，不透明，表面較粗糙，菌落較大，邊緣不整齊；接觸酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)陽性；氧化酶試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、絡(luò)氨酸水解試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)陰性；可以利用葡萄糖和檸檬酸鹽；該菌株的16S rDNA的 GenBank 登錄號為 JN700990。實(shí)施例2降解菌劑的制備
將本發(fā)明的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌DG-02的菌種在固體平板上活化，并測定降解性能，接種于試管斜面上備用。將擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌DG-02的試管種接種于含250 mL的LB培養(yǎng)基1000 mL搖瓶中，恒溫振蕩至對數(shù)期，準(zhǔn)備接種種子罐，所述LB培養(yǎng)基質(zhì)量百分比組成為酵母膏0.5%，蛋白胨l%，NaCl 1%;種子罐100 L，投料量80 L，培養(yǎng)基配方為酵母膏O. 5%，蛋白胨1%，NaCl 1%，pH值為7. 2 7. 5。投料完成后在I. I Kg/ cm3的壓力下、121 °C條件下高壓濕熱滅菌，冷卻至30 1后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按 8% 10%的接種量接種于100 L種子罐，無菌空氣的通氣量為O. 45 O. 60 m3/min，攪拌速度為200 300 r/min，培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。將到達(dá)對數(shù)期的種子液按照8% 10%的接種量投入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量I噸,投料量為O. 08 O. I噸。投料后的生產(chǎn)罐，在I. I Kg/cm3的壓力下、121 1條件下高壓濕熱滅菌，冷卻至30 1后，通無菌空氣，通氣量為0.45 0.60 m3/min，攪拌速度為200 300 r/min，培養(yǎng)溫度控制在30 35 °C，整個(gè)工藝培養(yǎng)流程時(shí)間為36 48 h。所獲培養(yǎng)液直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型。實(shí)施例3對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的降解實(shí)驗(yàn)
在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(組分為NH4NO3 1.0 g，NaCl 0.5 g, K2HPO4 1.5 g, KH2PO4 0.5 g, MgSO4 ■ 7H20 O. 5 g，水1000 mL，pH值為7. 5)中分別加入溴氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯和間苯氧基苯甲酸，使其終濃度為50 mg/L ;接種降解菌DG-02濃度為I. OX IO8 CFU/mL菌液，并設(shè)不接菌的培養(yǎng)基為對照，搖床培養(yǎng)0_72小時(shí)， 定期取樣，應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)檢測農(nóng)藥的殘留量，結(jié)果見表I所示。降解曲線圖如附圖I所示。對照樣品殘留量-a理樣品殘留量
汪: 譯鋅率=-:V 100%
對照樣品殘留量表I降解菌DG-02對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和間苯氧基苯甲酸的降解效果
漠a(chǎn)菊麵甲氣菊雖高效氳氣氰菊酣高效氳S 菊畫高效織氛菊雖間苯氧基苯甲酸降解率(=.3)P4.1P3.5S2.7S9.2S5.695.6
結(jié)果表明，降解菌DG-02可有效去除溴氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和其主要中間產(chǎn)物間苯氧基苯甲酸的殘留，具有較好的降解效果。實(shí)施例4應(yīng)用本發(fā)明的菌劑進(jìn)行土壤模擬農(nóng)藥殘留降解試驗(yàn)
在田間選取未經(jīng)施藥的表層土壤(O 20 cm)，準(zhǔn)確稱取每份200 g土壤，在每一份中分別加入溴氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯和間苯氧基苯甲酸，使其質(zhì)量終濃度分別為25、50和100 mg/kg，接種降解菌劑，濃度為1.0X108 CFU/g 土壤，并設(shè)不接菌的土壤為對照，置于30 °C培養(yǎng)箱中黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，15天后測定其在土壤中的殘留量，結(jié)果見表2所示。結(jié)果表明，降解菌劑可以有效去除土壤中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其主要中間產(chǎn)物的殘留，具有較好的去除效果。表2降解菌劑去除土壤中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和間苯氧基苯甲酸殘留的效果
度譯-驛率25 mg'kg50 mg/kg100 mg.,kg溴氧菊蓮86.382,681.0甲攝菊酉I84,583,280,7高效氯氟氰菊酯Si,9S2.4TT O ,· .· ,O高效氯氰菊黯85.1S7.084,31 效W\最最15 Sg75,4S0.578,0Λ苯氧基苯+甲該86,885,582,1
實(shí)施例5應(yīng)用本發(fā)明的菌劑進(jìn)行蔬菜模擬農(nóng)藥殘留降解試驗(yàn)
選取未經(jīng)施藥的菜心(4 5葉期)，置于30 1光照培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，生長過程中噴施溴氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯和間苯氧基苯甲酸，處理濃度分別為25、50和100 mg/L。噴施農(nóng)藥I天后接種降解菌劑，接種量為每株菜心5 mL (I.OXlO8 CFU/mL)，并以噴灑等量清水的菜心為對照。噴施菌液5天后，按5 點(diǎn)取樣法取菜心樣品，用氣相色譜法(GC)測定農(nóng)藥殘留量，結(jié)果見表3所示。結(jié)果表明，降解菌劑可以有效去除菜心中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其主要中間產(chǎn)物的殘留，具有較好的去除效果。表3降解菌劑去除菜心中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和間苯氧基苯甲酸殘留的效果
權(quán)利要求
1.一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌,所述菌株為芽孢桿菌屬(feci/AAs· sp. )DG-02, 于2011年11月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為CCTCC M 2011382。
2.權(quán)利要求I所述擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌在去除擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其中間物殘留方面的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于制備去除擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其中間物殘留的降解菌劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解菌劑的制備方法包括以下步驟(1)將擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留降解菌DG-02的菌種接種于LB培養(yǎng)基搖瓶中，30°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；所述LB培養(yǎng)基質(zhì)量百分比組成為酵母膏O. 5%，蛋白胨1%，NaCl 1% ；(2)將步驟(I)培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的體積比的8% 10%的接種量接種入種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用質(zhì)量百分比培養(yǎng)基配方為酵母膏0.5%，蛋白胨1%， NaCl 1%，pH 值為 7. 2 7. 5 ;(3)將達(dá)到對數(shù)期的種子液按照8% 10%的接種量接種入生產(chǎn)罐培養(yǎng)即得所述降解菌劑；生產(chǎn)罐所用質(zhì)量百分比培養(yǎng)基配方為酵母膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 1%，ρΗ值為 7. 2 7. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于步驟(2)所述培養(yǎng)條件為無菌空氣的通氣量為O. 45 O. 60 m3/min，攪拌速度為200 300 r/min，溫度30°C， 全流程培養(yǎng)時(shí)間為36 48小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于步驟(3)所述培養(yǎng)條件為無菌空氣的通氣量為O. 45 O. 60 m3/min，攪拌速度為200 300 r/min，溫度30°C， 全流程培養(yǎng)時(shí)間為36 48小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于制備去除溴氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯或間苯氧基苯甲酸的殘留的降解菌劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用的應(yīng)用量是每平方米農(nóng)田施用50 mL濃度為I. OX IO8 CFU/mL的降解菌菌液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的降解菌及菌劑和應(yīng)用。所述菌株為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)DG-02，菌種保藏號為CCTCCM2011382。應(yīng)用所述芽孢桿菌屬(Bacillussp.)DG-02制備得到的降解菌劑生產(chǎn)成本低，使用方便，降解效果好，直接施用可使土壤和作物中溴氰菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、間苯氧基苯甲酸的殘留量降低75%以上，解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題，適合在全國果蔬生產(chǎn)出口基地或有綠色食品商標(biāo)標(biāo)志的地方大面積使用，對促進(jìn)生產(chǎn)無公害農(nóng)產(chǎn)品、綠色食品具有重要的意義。
文檔編號C12N1/20GK102604859SQ201210013359
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者羅建軍, 胡美英, 鐘國華, 陳少華 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)