專利名稱：雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種超強毒株的細胞適應株及其應用，特別涉及一種雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其在制備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的應用。屬于生物疫苗領域。
背景技術：
雞傳染性法氏囊病(IBD)是幼齡雞的一種急性、高度接觸性傳染病。其病原是雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)。IBDV屬雙RNA病毒科，禽雙RNA病毒屬病毒。它有兩個血清型，即血清I型和血清II型。I型毒對雞有致病性，又分為不同亞型，如經典株、變異株、 超強毒株和致弱株等。IBDV傾向于侵襲活躍的分離細胞，在雞體內，主要侵害中樞免疫器官-法氏囊中的前體B細胞，使其發生凋亡和壞死，進而使成熟B細胞減少，導致免疫抑制， 從而降低機體對其它疫病的易感性和對其它疫苗的反應性。本病現已遍布全球養禽地區， 在工業化養禽業發達的國家尤為嚴重。
我國于1979年先后在北京、廣州等地發生本病，初期病死率較低；八十年代末、 九十年代初，我國開始流行雞傳染性法氏囊病超強毒(wIBDV)，使IBD的發生有了新的變化病死率升高達100%和60%以上；雛雞易早期感染，急性發病；原有的經典株弱毒苗不能給免疫雞提供完全的保護；帶有較低母源抗體水平的雞群也常常不能抵抗wIBDV的攻擊。李樹根等發現，TAD(德國)、D78(荷蘭)、BV(美國)、CJ(北京)等弱毒疫苗對由廣東分離的6株血清I型IBDV毒株GF903、G^02、GN903、GS904、GB905、GD906等的保護率都不高。 由于wIBDV在抗原性上與經典株和經典疫苗株一致，只是在致病性上出現急劇增強的趨勢，理論上講，常規標準血清I型疫苗能夠提供對wIBDV的保護，但在臨床實踐中，vvIBDV 卻能突破母源抗體而感染雛雞。即使不致雛雞死亡，也使法氏囊組織受到嚴重損傷，導致嚴重后果。因此研制出能抵抗國內wIBDV分離株、免疫原性強、安全性好的疫苗，并將其推廣應用就迫在眉睫。目前認為適當提高疫苗的含毒量或選用中毒力疫苗株是提高疫苗免疫效力的兩個好辦法。Vandenberg等證明，D78疫苗免疫接種的規定含量較PBG98疫苗的高10 倍，前者抗wIBDV的效果就比后者好。而中毒力疫苗或殘毒疫苗雖然對IBD的控制效果較好，但不免使人對其毒力和使用后果有些擔心。因此本發明人認為，分離國內vvIBDV，篩選、培育出毒價高，抗原性強的毒株，研制IBD滅活苗，用于雛雞將引起主動免疫，且無毒負作用；用于種雞，將提高子代雞的母源抗體水平，防制早期感染，抵抗國內wIBDV的攻擊。
近幾年，本發明人將分離到的wIBDV-Gx株，經過鑒定、篩選、培育，將其5代細胞適應株(IBDV-G)作為種毒，經鑒定后，研制了超強毒滅活疫苗，并進行了一系列實驗室免疫效力試驗、安全性試驗、對國內wIBDV的攻毒保護試驗等，取得了良好的效果。發明內容
本發明的目的之一在于提供一種雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株。
本發明的目的之二在于提供所述的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株在制備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的應用。
本發明的目的之三在于提供一種預防雞傳染性法氏囊病的疫苗組合物。
本發明的目的是通過以下技術手段實現的
本發明人從廣西某地IBD免疫后發病雞群采取法氏囊組織，經標準化方法處理后，得到IBDV-foc株。對foe株進行了致病性試驗，克隆其主要保護性抗原基因VP2，并進行了序列分析和比較。結果表明，其與歐洲標準超強毒UK661的親緣關系較近，主要結構蛋白核苷酸同源性為99%，氨基酸同源性為100%，其對SPF雞胚半數感染量(EID5tl) 為106·25/0. 2ml,以2X IO3EID50/只的劑量接種9 11日齡的SPF雞，死亡率達40 %，以 2 X IO3EID50/只的劑量接種4周齡SPF雞，死亡率達64%。從而證實傳染性法氏囊病病毒 Gx為一株符合歐洲超強毒標準和特點的國內超強毒株。
對該foe毒株經SPF雞胚連續傳代5代后，又經SPF雞胚成纖維細胞連續傳代25 代，結果表明病毒在細胞上穩定地大量增殖。其中細胞5代毒在接種后72小時，毒價可達 4. 0Xl(fpFU/ml，病毒對 SPF 雞胚半數感染量(EID50)為 1081°/0. 2ml,以 2 X IO3EID50/ 只的劑量接種4周齡SPF雞，死亡率達60%，進而篩選得到了本發明的一種雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株，其為雞傳染性法氏囊病超強毒to株的細胞適應株，命名為IBDV-G株， 分類命名為雞傳染性法氏囊病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院，中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC No. 5553，保藏日期為2011年12月5日。
將本發明的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株IBDV-G以同步接毒的方式進行批量培養，收獲病毒，經甲醛滅活，以礦物油為佐劑制成油乳劑滅活苗。疫苗接種10日齡及36周齡SPF雞，注苗后均無不良反應。雛雞免疫后7天開始產生抗體，14天時對超強毒 IBDV-G (vvIBDV-G)的致死性攻擊，具有100%的保護率。免疫種雞后，觀天后直至8_10個月，子代雞均可獲得被動保護，10日齡時對wIBDV-G的致死性攻擊的保護率為100 %，同國內外部分同類疫苗進行的比較研究中，本超強毒滅活苗抗體陽性率、抗體滴度及對超強毒的保護率，在參與比較的疫苗中，均居于首位。
因此，本發明提出了所述的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株在制備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的應用。
本發明的一種預防雞傳染性法氏囊病的疫苗組合物，其特征在于所述的疫苗組合物中，其有效成分包含滅活后的本發明所述的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株。
在本發明的研究中將致死率作為本發明的疫苗免疫保護性的可靠性依據及判定標準。雞傳染性法氏囊超強毒株在我國的出現，使病死率已升高到60 100%，由于wIBDV 在致病性上出現了急劇增強的趨勢，使得傳染性法氏囊病具備了高死亡率的特征，所以使用嚴重發病及致死率作為免疫保護性指標，可以客觀地評價雞傳染性法氏囊病超強毒滅活疫苗對雞群遭受wIBDV致死性攻擊時的保護效率，具有極大的可靠性；免疫攻毒保護的雞應臨床不死亡、不發病、無精神沉郁、食欲廢絕現象。
自1962年Cosgrove首次報道雞傳染性法氏囊病的流行以來，世界各國相繼開展了 IBD疫苗免疫方面的研究，油佐劑滅活疫苗具有免疫保護期長、免疫效果確實等優點，目前各國使用較多的油佐劑疫苗的毒株包括IBDV的標準毒株和變異株。其對種雞的免疫可將母源免疫力提供給后代，這些母源抗體能保護雞免受早期感染而引起的免疫抑制，世界各國雞傳染性法氏囊病油乳劑滅活苗的研制成功和應用在對傳染性法氏囊病的控制上發揮了巨大的作用。在本研究中將本產品與部分國內外同類疫苗，包括已批準的雞傳染性法氏囊滅活苗(CJ-801-BKF株)在內進行了比較，結果表明，本疫苗抗體陽性率、抗體滴度及對超強毒的保護率，在參與比較的疫苗中，居于首位，已批準的CJ-801株雞傳染性法氏囊滅活苗的各項指標與超強毒滅活苗相比基本相同，但超強毒滅活苗有著免疫劑量小(超強毒滅活苗成雞免疫劑量為0. 6ml/只，CJ-801株法氏囊病滅活苗成雞免疫劑量為1. 2ml/ 只)的明顯優勢，分析其原因，可能是本滅活苗的毒種具有超強毒的特性，同時能在細胞中適應并大量增殖，易于提高疫苗中的抗原量。
因此，與現有技術相比，采用本發明的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株制成的疫苗具有如下優點
1、本發明的一種雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株具有超強毒的特性，能在細胞中適應并大量增殖，易于提高疫苗中的抗原量；
2、本發明的疫苗組合物其抗體陽性率、抗體滴度及對超強毒的保護率高；
3、本發明的超強毒滅活苗有著免疫劑量小(超強毒滅活苗成雞免疫劑量為 0. 6ml/只，CJ-801株法氏囊病滅活苗成雞免疫劑量為1. 2ml/只)的明顯優勢；
4、本研究結果表明，雞傳染性法氏囊病超強毒滅活苗具有免疫原性好、免疫保護持續期長、免疫劑量小等優點。
IBDV流行與分布較廣，加之病毒本身對外界抵抗力較強，感染舍的徹底消毒也十分困難，因此使用能夠抵抗國內wIBDV流行的高效疫苗對易感雞群進行免疫預防，減少甚至避免其對養禽業造成的危害勢在必行。本研究結果表明，雞傳染性法氏囊病超強毒滅活苗具有免疫原性好、免疫保護持續期長、免疫劑量小等優點，它的的推廣應用將有效地預防了我國局部地區vvIBD的暴發和流行，給免疫場帶來了明顯的經濟效益和社會效益，有利地促進了免疫地區乃至我國養禽業的持續、穩定、健康地發展。


圖1為IBDV-G在CEF上的生長曲線；
圖2為種毒IBDV-G的電鏡照片。
具體實施方式
下面通過實驗并結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。
實施例1雞傳染性法氏囊病超強毒滅活苗制苗用種毒IBDV-G的鑒定
1、材料和方法
1. 1疫苗用種毒的鑒定
1. 1. 1種毒的培養及毒價測定
以10日齡SPF雞胚制備雞胚成纖維細胞，以同步接毒方式接種5代細胞毒，即本發明的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株IBDV-G，37°C培養。不同時間收集病毒培養物，以病毒蝕斑形成方法測定病毒含量，繪制病毒生長曲線，并確定收毒時間和種毒毒價。
1. 1. 2電鏡觀察
種毒細胞培養物凍融后，直接負染法做電鏡觀察；經不連續蔗糖梯度離心純化后， 抽取40%蔗糖段的病毒帶，加PBS超速離心Q7000rpm，2. 5小時)，少量TNE懸浮后，直接負染法做電鏡觀察。
1. 1. 3外源病毒檢查
IBDV-G培養物，稀釋至1 X 104PFU/ml，將其與超強毒IBDV-G單特異血清等量混合并經37°C 1小時中和后，取10日齡SPF雞20只，以滴鼻、點眼的途徑進行接種，每只雞接種0. 2ml (1. 0 X IO3PFU/只)，20天后，采集血清，分別使用血凝抑制(HI)、瓊擴(AGP)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、中和試驗(VN)、免疫熒光(IFA)等方法，檢測血清中雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、雞馬立克病毒(MDV)、雞新城疫病毒(NDV)、禽網狀內皮組織增殖征病毒 (REV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(LLV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(LTV)、禽腦脊髓炎病毒(AEV)、雞痘病毒(POX)的抗體陽性率。
1. 1.4生物學特性
以1. OX IO3PFU/只劑量的IBDV-G接種12只10日齡SPF雞，于接種后3、5、7、10 天，各剖檢3只雞，觀察剖檢變化和病理組織學變化，并用ELISA方法檢測組織中的IBDV。
1. 2疫苗用種毒的特異性及免疫原性
1. 2. 1 特異性
取培養M小時的2個IOOml方瓶CEF，將種毒稀釋至1 X 104PFU/ml后與vvIBDV-G 單特異血清等量混合并經37°c 1小時中和后，每瓶接種0. anl，培養5日，觀察細胞病變； IBDV-G病毒培養物經27000轉/分，2. 5小時超速離心后，80倍濃縮，與雞傳染性法氏囊病 (IBD)、雞傳染性貧血病(CIA)、雞馬立克病(MD)、雞新城疫(ND)、雞傳染性支氣管炎(IB)、 禽流感(Al)、雞傳染性喉氣管炎(ILT)等陽性血清作瓊擴試驗。
1. 2. 2免疫原性
將毒價達4. 0 X 108PFU/ml的IBDV-G病毒培養物，經0. 2 %甲醛溶液滅活48小時后，與白油佐劑按1 1.5混合，制成油乳劑，分別以0.05ml/只、0. Iml/只、0. 2ml/只劑量肌肉注射接種20只10日齡SPF雞，免疫后14天和28天分別以4. 0 X IO4EID50/只wIBDV_G 株進行攻毒，確定超強毒攻毒保護率并分別在免疫后7、14、21、觀天采血，檢測AGP和ELISA 抗體，計算免疫后不同時間的血清抗體陽性率。
2.結果
2. 1疫苗用種毒鑒定
2. 1. 1種毒的培養及毒價測定
IBDV-G在CEF上可穩定而有規律地增殖，圖1從一定程度上反應出病毒增殖狀態。 接種后72小時左右，培養液中的病毒量最多，毒價達4. OX 108PFU/ml以上，因而，收毒時間定為72小時。
2. 1. 2電鏡觀察
種毒細胞培養物凍融后，直接負染法做電鏡觀察，可見視野中大量散在的、典型的 IBDV粒子，未見其它病毒粒子，如圖2所示。
2. 1. 3外源病毒檢查
以IBDV-G培養液經單特異血清中和，接種SPF雞后，血清中除檢測到傳染性法氏囊病毒抗體外，無其它病毒抗體，證明種毒較純，無其它外源病毒的污染；使用SPF雞進行實驗，結果可靠(見表1)。
表1種毒的外源病毒檢查
權利要求
1.雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株，其特征在于所述的細胞適應株為雞傳染性法氏囊病超強毒foe株的細胞適應株，命名為IBDV-G株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 5553。
2.權利要求1所述的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株在制備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的應用。
3.一種預防雞傳染性法氏囊病的疫苗組合物，其特征在于所述的疫苗組合物中，其有效成分包含滅活后的權利要求1所述的雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株。
全文摘要
本發明公開了一種雞傳染性法氏囊病超強毒的細胞適應株及其在制備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的應用。本發明的細胞適應株為雞傳染性法氏囊病超強毒Gx株的細胞適應株，命名為IBDV-G株，其菌種保藏編號為CGMCC 5553。將本發明的IBDV-G株滅活后制備成疫苗用于動物的免疫，結果證明本發明的疫苗安全，且對超強度IBDV-G的致死性攻擊，具有100％的保護率，本發明的超強毒滅活苗抗體陽性率、抗體滴度及對超強毒的保護率，在參與比較的疫苗中，均居于首位。因此，本發明的推廣應用將有效地預防了我國局部地區vvIBD的暴發和流行，有利地促進了免疫地區乃至我國養禽業的持續、穩定、健康地發展。
文檔編號C12N7/00GK102533673SQ201210014019
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月17日 優先權日2012年1月17日
發明者王永強, 王笑梅, 祁小樂, 秦立廷, 高宏雷, 高玉龍 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所