專利名稱：抑制CYP3A4的shRNA表達(dá)質(zhì)粒及構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及抑制藥物代謝酶CYP3A4表達(dá)的三種shRNA表達(dá)質(zhì)粒及構(gòu)建，以及三種shRNA表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)或混合使用時對CYP3A4基因和蛋白抑制作用，能夠有效地降低CYP3A4的表達(dá)，用于新藥研發(fā)中的成藥性評價，以提高藥物研發(fā)的成功率；用于臨床使用藥物的相互作用的預(yù)測，以減少或避免不良反應(yīng)。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)現(xiàn)象是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外來病毒侵犯的防御機(jī)制，是指內(nèi)源性或外源性與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)特異地降解該mRNA,從而致使特異性的基因有效封閉的過程，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。RNAi技術(shù)是利用RNAi原理，在體外利用化學(xué)或酶促合成siRNA，也可構(gòu)建在體內(nèi)合成siRNA的質(zhì)粒或病毒表達(dá)載體，然后利用傳統(tǒng)微注射磷酸鈣法、電穿孔轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞從而致使靶基因沉默的技術(shù)。RNA干擾有很多方法①化學(xué)合成法.級siRNA表達(dá)載體；@ dsRNA表達(dá)載體。多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴三種RNA聚合酶 III啟動子(pol III)中的一種,操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人Hl啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子 RNA,而且它是通過添加一串(3到6個)U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的pol III啟動子下游。siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長期研究，這是因?yàn)閹в锌股貥?biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。RNAi作為一種簡單快速、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、效果可預(yù)測的技術(shù)，具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，它比反義核酸技術(shù)優(yōu)越，比基因敲除簡單，具有很好的應(yīng)用前景。藥物代謝性質(zhì)是藥物開發(fā)過程中，化合物成藥性的重要指標(biāo)。而藥物代謝酶在藥物的代謝轉(zhuǎn)化過程中扮演了重要的角色。其中細(xì)胞色素P450 (CYP450)酶參與的氧化代謝是藥物消除的主要途徑。CYP3A4是人體含量最豐富的P450酶，參與市場上50%以上的藥物代謝。在藥物的代謝性相互作用中，由酶的抑制引起的相互作用約占全部相互作用的70%。 針對CYP3A4的化學(xué)抑制劑的研究已十分廣泛，但由于化學(xué)抑制劑特異性差，因此有關(guān)抑制劑選擇性的全面信息有待進(jìn)一步探討。與化學(xué)抑制劑相比，RNAi技術(shù)則能夠?qū)崿F(xiàn)基因表達(dá)的高效率阻斷，特異性更強(qiáng)，從而避免對其他藥物代謝酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響。目前針對CYP3A4 的RNA干擾多采用針對某一位點(diǎn)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，而采用作用于多靶點(diǎn)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒混合物尚無報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抑制CYP3A4的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，通過以下方法構(gòu)建
(I)在Genebank中查找CYP3A4的序列(匪.017460)，根據(jù)干擾片段設(shè)計原則(http:// www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. html)，具體原則如下從轉(zhuǎn)錄本(mRNA)的 AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，以GC含量在45%— 55%左右的siRNA作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。并依據(jù)CYP3A4的序列，利用設(shè)計軟件，并通過Blast軟件排除與基因組其他基因(人、小鼠、大鼠等)具有同源性的序列，獲得三個符合要求的shRNA模板序列，作用位點(diǎn)分別為773、923和1191。(1) 773位點(diǎn)的shRNA模板正義鏈序列為
5’-GATCCAGTCGCCTCGAAGATACACTTCAAGAGAGTGTATCTTCGAGGCGACTTTA-3，
773位點(diǎn)的shRNA模板反義鏈序列為
5’-AGCTTAAAGTCGCCTCGAAGATACACTCTCTTGAAGTGTATCTTCGAGGCGACTG-3’
其中序列兩端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分別為BamHI和HindiII酶切位點(diǎn)， 用于與pSilencer4. I CMV neo載體連接；序列中間的5’ -TTCAAGAGA-3’為loop序列； 5’ -AGTCGCCTCGAAGATACAC-3’ 和 5’ -GTGTATCTTCGAGGCGACT-3’ 分別為 773 靶點(diǎn)的正義和反義序列。用無菌水將化學(xué)合成的773正義和反義shRNA模板粉末分別稀釋至50 μ M，在 95°C至25°C逐步降溫的條件下退火成雙鏈shRNA模板，然后克隆至經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切的pSilencer4. I CMV neo載體上，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐抗生素篩選陽性克隆， 選取若干長出的菌落至LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒(天根)提取質(zhì)粒(結(jié)果參見圖2，其中773 1-6: shRNA表達(dá)質(zhì)粒773克隆1-6)，選取773 2號進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果正確后于_80°C保存。773 2號命名為SI。(2 ) 923位點(diǎn)的shRNA模板正義鏈序列為
5’-GATCCACCACGAGCAGTGTTCTCTTTCAAGAGAAGAGAACACTGCTCGTGGTTTA-3’
923位點(diǎn)的shRNA模板反義鏈序列為
5’-AGCTTAAACCACGAGCAGTGTTCTCTTCTCTTGAAAGAGAACACTGCTCGTGGTG-3’
其中序列兩端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分別為BamHI和HindiII酶切位點(diǎn)， 用于與pSilencer4. I CMV neo載體連接；序列中間的5’ -TTCAAGAGA-3’為loop序列； 5’ -ACCACGAGCAGTGTTCTCT-3’ 和 5’ -AGAGAACACTGCTCGTGGT-3’ 分別為 923 靶點(diǎn)的正義和反義序列。用無菌水將化學(xué)合成的923正義和反義shRNA模板粉末分別稀釋至50 μ M，在 95°C至25°C逐步降溫的條件下退火成雙鏈shRNA模板，然后克隆至經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切的pSilencer4. I CMV neo載體上，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐抗生素篩選陽性克隆， 選取若干長出的菌落至LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒(天根)提取質(zhì)粒(結(jié)果參見圖2，其中923 1-6: shRNA表達(dá)質(zhì)粒923克隆1-6)，選取923 2號進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果正確后于_80°C保存。923 2號命名為S2。(3) 1191位點(diǎn)的shRNA模板正義鏈序列為
5’-GATCCGCTATGCTCTTCACCGTGATTCAAGAGATCACGGTGAAGAGCATAGCTTA-3’
1191位點(diǎn)的shRNA模板反義鏈序列為
5’-AGCTTAAGCTATGCTCTTCACCGTGATCTCTTGAATCACGGTGAAGAGCATAGCG-3’其中序列兩端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分別為BamHI和HindiII酶切位點(diǎn)， 用于與pSilencer4. I CMV neo載體連接；序列中間的5’ -TTCAAGAGA-3’為loop序列； 5’-GCTATGCTCTTCACCGTGA-3’ 和 5’-TCACGGTGAAGAGCATAGC-3’ 分別為 1191 靶點(diǎn)的正義和反義序列。用無菌水將化學(xué)合成的1191正義和反義shRNA模板粉末分別稀釋至50 μ M，在 95°C至25°C逐步降溫的條件下退火成雙鏈shRNA模板，然后克隆至經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切的pSilencer4. I CMV neo載體上，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐抗生素篩選陽性克隆， 選取若干長出的菌落至LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒(天根)提取質(zhì)粒(結(jié)果參見圖2，其中1191 1-6: shRNA表達(dá)質(zhì)粒1191克隆1-6)，選取1191 I號進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果正確后于_80°C保存。1191 I號命名為S3。本發(fā)明的另一個目的是提供所述的抑制CYP3A4的三種shRNA質(zhì)粒單獨(dú)或等比例混合物在制備CYP3A4的特異性抑制劑中的應(yīng)用，在新藥研發(fā)和藥物合理應(yīng)用研究中，用于 CYP3A4底物和誘導(dǎo)劑的篩選和確證。本發(fā)明構(gòu)建的三種新的分別作用于CYP3A4不同位點(diǎn)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，單獨(dú)或等比例混合能夠有效地抑制CYP3A4的表達(dá)，與單獨(dú)作用相比，這三種shRNA表達(dá)質(zhì)粒的等比例混合物作用更強(qiáng)，且對與CYP3A4同源性非常高的CYP3A5的表達(dá)無影響。因此，該shRNA 表達(dá)質(zhì)粒混合體系可以作為CYP3A4的特異性抑制劑，用于新藥研發(fā)和藥物合理應(yīng)用研究中，CYP3A4底物和誘導(dǎo)劑的篩選和確證。在CYP3A4底物確證中的應(yīng)用。在利福平誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫， TCHu 72)中，本發(fā)明的shRNA質(zhì)粒的等比例混合物能夠逆轉(zhuǎn)GA(15:1)對H印G2細(xì)胞的毒性作用。綜上說明，在新藥研發(fā)中(1)本發(fā)明構(gòu)建的三種shRNA表達(dá)質(zhì)粒的有效作用形式為等比例混合物，該混合物能夠特異性地抑制CYP3A4基因和蛋白的表達(dá)，可以作為CYP3A4的專屬性抑制劑使用；(2)本發(fā)明中的shRNA質(zhì)粒的等比例混合物能夠降低CYP3A4的活性， 在CYP3A4底物和誘導(dǎo)劑的篩選和確證中有重要用途；(3)本發(fā)明中的shRNA質(zhì)粒的等比例混合物可以用于篩選和確證經(jīng)過CYP3A4代謝增加活性或增加毒性的藥物；(4)本發(fā)明中的 shRNA質(zhì)粒的等比例混合物可以用于CYP3A4參與的信號通路的研究。本發(fā)明在完成shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建后，通過三種不同的細(xì)胞模型，檢測shRNA 表達(dá)質(zhì)粒對CYP3A4基因和蛋白表達(dá)的抑制作用。(I)在CHL (中國科學(xué)院細(xì)胞庫，GNHa 2) -CYP3A4瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞模型中，shRNA表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)作用時抑制效果較弱，而三種質(zhì)粒的等比例混合物對CYP3A4的抑制率達(dá)到60%，該應(yīng)用說明三種質(zhì)粒的等比例混合物能夠?qū)YP3A4 的基因表達(dá)產(chǎn)生更為有效的抑制，從而確定了 shRNA表達(dá)質(zhì)粒的有效作用形式，因此后續(xù)的應(yīng)用均采用混合物形式的shRNA表達(dá)質(zhì)粒；(2)在HEK293 (中國科學(xué)院細(xì)胞庫，GNHu D-CYP3A4瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞模型中，shRNA表達(dá)質(zhì)粒等比例混合物對CYP3A4基因的抑制率為55%， 同時對CYP3A4蛋白的表達(dá)也有明顯的抑制作用，該應(yīng)用進(jìn)一步驗(yàn)證了三種shRNA質(zhì)粒的等比例混合物對CYP3A4表達(dá)有顯著的抑制作用；(3)在利福平誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫，TCHu 72)中，shRNA表達(dá)質(zhì)粒等比例混合物對CYP3A4基因和蛋白的抑制率均為 50%左右，并對與其同源性較高的CYP3A5基因無影響，該應(yīng)用在外源性導(dǎo)入CYP3A4結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測三種shRNA質(zhì)粒的等比例混合物對內(nèi)源性CYP3A4基因和蛋白表達(dá)的影響，證實(shí)該shRNA質(zhì)粒的等比例混合物明顯降低內(nèi)源性CYP3A4的表達(dá)，并對其他與CYP3A4同源性高的基因無抑制作用。本發(fā)明提供的CYP3A4 shRNA表達(dá)質(zhì)粒與已報道的干擾質(zhì)粒比較，具有(I)本發(fā)明構(gòu)建的shRNA表達(dá)質(zhì)粒與miRNA質(zhì)粒相比，能夠作用于CYP3A4的編碼區(qū)序列，直接降解 CYP3A4的mRNA，效果更顯著，而miRNA質(zhì)粒作用于非編碼區(qū)，對CYP3A4 mRNA的降解作用較弱；(2)本發(fā)明采用shRNA表達(dá)質(zhì)粒混合物進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)，該混合物針對CYP3A4不同的位點(diǎn)，抑制效果較單一質(zhì)粒更強(qiáng)；(3)本發(fā)明的shRNA混合表達(dá)質(zhì)粒與化學(xué)抑制劑相比，具有良好的專屬性，對其它藥物代謝酶或轉(zhuǎn)運(yùn)體無抑制作用，從而排除非特異性抑制干擾，可以作為CYP3A4的特異性抑制劑來使用。


圖I質(zhì)粒PGL3/CYP3A4的PCR鑒定電泳圖。圖2 shRNA表達(dá)質(zhì)粒電泳圖。圖3雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測各組shRNA表達(dá)質(zhì)粒對CHL-CYP3A4瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞的CYP3A4基因表達(dá)的影響(means ± SD, n=3)。圖4 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測shRNA表達(dá)質(zhì)粒等比例混合物對 HEK293-CYP3A4 瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞 CYP3A4 基因表達(dá)的影響(means 土 SD, n=3)。 圖5免疫熒光化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測shRNA表達(dá)質(zhì)粒等比例混合物對HEK293-CYP3A4瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞CYP3A4蛋白表達(dá)的影響。圖6利福平誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞高表達(dá)CYP3A4的條件(means 土 SD, n=3)。圖7 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測shRNA表達(dá)質(zhì)粒等比例混合物對利福平誘導(dǎo)的H印G2細(xì)胞 CYP3A4基因表達(dá)的影響。圖8 Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測shRNA表達(dá)質(zhì)粒等比例混合物對利福平誘導(dǎo)的 H印G2細(xì)胞CYP3A4蛋白表達(dá)的影響。圖9 Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測shRNA表達(dá)質(zhì)粒等比例混合物對利福平誘導(dǎo)的 H印G2細(xì)胞CYP3A5蛋白表達(dá)的影響。圖10 MTT實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)質(zhì)粒等比例混合物后，GA (15:1)對利福平誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的存活性變化。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。通過下列實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)特征做詳細(xì)的描述，但不限制本發(fā)明。實(shí)施例I pGL3/CYP3A4重組質(zhì)粒的構(gòu)建
設(shè)計含XbaI和FseI酶切位點(diǎn)的PCR引物，從原重組載體(PGEMT-CYP3A4)上擴(kuò)增 CYP3A4⑶S基因，連接至載體pGL3 promoter中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、挑菌、搖菌、提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR 鑒定(結(jié)果參見圖1，其中I:克隆I質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，2:克隆2質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，3:克隆3質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物大小為1512bp)，取I號進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果正確，鑒定正確后_80°C 保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。實(shí)施例2 shRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
I.CYP3A4干擾靶位點(diǎn)序列的篩選及shRNA模板的設(shè)計在Genebank中查找CYP3A4的序列，根據(jù)干擾片段設(shè)計原則(http://www. ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder. html)和 CYP3A4 的序列，利用設(shè)計軟件，并通過Blast 軟件排除與基因組其他基因具有同源性的序列，獲得三個符合要求的shRNA模板序列，針對 CYP3A4的位點(diǎn)分別為773,923和1191。
權(quán)利要求
1.抑制CYP3A4的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，通過以下方法構(gòu)建(1)在Genebank中查找CYP3A4的序列匪.017460，根據(jù)干擾片段設(shè)計原則從轉(zhuǎn)錄本 mRNA的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，以GC含量在45%-55%左右的siRNA作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)，并依據(jù)CYP3A4的序列，利用設(shè)計軟件， 并通過Blast軟件排除與基因組其他基因具有同源性的序列，獲得三個符合要求的shRNA 模板序列，作用位點(diǎn)分別為773、923和1191 ；(2)用無菌水將化學(xué)合成的773正義和反義shRNA模板粉末分別稀釋至50μ Μ，在95°C 至25°C逐步降溫的條件下退火成雙鏈shRNA模板，然后克隆至經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切的pSilencer4. I CMV neo載體上，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，氨芐抗生素篩選陽性克隆，選取若干長出的菌落至LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，其中773 1-6: shRNA表達(dá)質(zhì)粒773克隆1-6)，選取773 2號進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果正確后于_80°C保存，773 2號命名為SI ；其中用923正義和反義shRNA模板粉末和1191正義和反義shRNA模板粉末代替773 正義和反義shRNA模板粉末，923 1-6: shRNA表達(dá)質(zhì)粒923克隆1_6，923 2號命名為S2， 1191 1-6: shRNA表達(dá)質(zhì)粒1191克隆1-6，1191 I號命名為S3 ;773位點(diǎn)的shRNA模板正義鏈序列為5’-GATCCAGTCGCCTCGAAGATACACTTCAAGAGAGTGTATCTTCGAGGCGACTTTA-3，反義鏈序列為5’-AGCTTAAAGTCGCCTCGAAGATACACTCTCTTGAAGTGTATCTTCGAGGCGACTG-3’其中序列兩端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分別為BamHI和HindiII酶切位點(diǎn)， 用于與pSilencer4. I CMV neo載體連接;序列中間的5’ -TTCAAGAGA-3’為loop序列； 5’ -AGTCGCCTCGAAGATACAC-3’ 和 5’ -GTGTATCTTCGAGGCGACT-3’ 分別為 773 靶點(diǎn)的正義和反義序列；923位點(diǎn)的shRNA模板正義鏈序列為5’-GATCCACCACGAGCAGTGTTCTCTTTCAAGAGAAGAGAACACTGCTCGTGGTTTA-3’反義鏈序列為5’-AGCTTAAACCACGAGCAGTGTTCTCTTCTCTTGAAAGAGAACACTGCTCGTGGTG-3’其中序列兩端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分別為BamHI和HindiII酶切位點(diǎn)， 用于與pSilencer4. I CMV neo載體連接;序列中間的5’ -TTCAAGAGA-3’為loop序列； 5’ -ACCACGAGCAGTGTTCTCT-3’ 和 5’ -AGAGAACACTGCTCGTGGT-3’ 分別為 923 靶點(diǎn)的正義和反義序列；1191位點(diǎn)的shRNA模板正義鏈序列為5’-GATCCGCTATGCTCTTCACCGTGATTCAAGAGATCACGGTGAAGAGCATAGCTTA-3’反義鏈序列為5’-AGCTTAAGCTATGCTCTTCACCGTGATCTCTTGAATCACGGTGAAGAGCATAGCG-3’其中序列兩端的5’ -GGATCC-3’和5’ -AAGCTT分別為BamHI和HindiII酶切位點(diǎn)， 用于與pSilencer4. I CMV neo載體連接;序列中間的5’ -TTCAAGAGA-3’為loop序列； 5’-GCTATGCTCTTCACCGTGA-3’ 和 5’-TCACGGTGAAGAGCATAGC-3’ 分別為 1191 靶點(diǎn)的正義和反義序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抑制CYP3A4的shRNA質(zhì)粒在制備CYP3A4的特異性抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于，用于CYP3A4底物和誘導(dǎo)劑的篩選和確證。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的三種抑制CYP3A4的shRNA質(zhì)粒單獨(dú)或等比例混合使用。
全文摘要
本發(fā)明提供抑制CYP3A4的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，根據(jù)干擾片段設(shè)計原則和CYP3A4的序列，通過Blast軟件排除與基因組其他基因具有同源性的序列，獲得三個符合要求的shRNA模板序列，將合成的上述shRNA模板分別克隆，通過氨芐抗性篩選和測序，成功獲得三種shRNA表達(dá)質(zhì)粒。在不同的細(xì)胞模型中，shRNA單獨(dú)或混合表達(dá)質(zhì)粒均能夠較好地抑制CYP3A4mRNA表達(dá)(55％)和蛋白表達(dá)(50％)，且無脫靶效應(yīng)，具有良好的專屬性。因此，本發(fā)明提供的三種shRNA表達(dá)質(zhì)粒可以作為CYP3A4的特異性抑制劑，用于CYP3A4底物和誘導(dǎo)劑的篩選和確證。
文檔編號C12N15/66GK102586325SQ20121001717
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者余露山, 周慧, 徐思云, 曾蘇, 王鷺, 胡海紅, 蔣惠娣 申請人:浙江大學(xué)