專利名稱：重型肝炎相關基因hFas microRNA腺病毒表達質粒的構建方法及其藥學用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及構建一組基因生物制劑，即構建重型肝炎相關的人fgl2(Human Fibrinogen-Iike protein 2，hfgl2)凝血酶原酶、Fas 和腫瘤壞死因子受體 I (tumor necrosis factor, TNFR1)基因的microRNA腺病毒表達質粒，在重型肝炎中聯合應用三種質粒進行 治療，驗證其藥學用途。
背景技術：
由于病毒性肝炎發病率高、危害性大，已成為嚴重影響人民健康與生活水平、 制約經濟發展的重要疾病。迄今為止，國際上對于重型肝炎尚無確定有效的治療方法， 探索重型肝炎的發病機制和防治方法是應用基礎和臨床研究領域的重要課題。用鼠3型肝炎病毒(mouse hepatitis viras-3, MHV-3)感染不同種系近親繁殖小 鼠，我們已成功建立了類似人類各種不同臨床類型的肝炎，包括暴發型肝炎、慢性肝炎 及臨床健康病毒攜帶者(專利申請號02115980.7) ； MHV-3誘導產生的鼠fgl2 (mfgl2) 凝血酶原酶(纖維介素)基因在鼠病變肝組織中選擇性高度表達，其基因表達水平與肝組 織纖維蛋白沉積及廣泛肝細胞壞死密切相關；MHV-3感染小鼠接受鼠fgl2凝血酶原酶 中和抗體注射后可減輕肝臟疾病嚴重程度并顯著降低死亡率。以上結果表明，鼠fgl2凝 血酶原酶在鼠暴發型肝炎的發病過程中起重要作用。在上述研究的基礎上，我們進一步 研究發現重癥乙型肝炎病人肝臟組織的枯否氏細胞、血管內皮細胞和壞死、纖維化區域 發現人fgl2(hfgl2)凝血酶原酶高度表達，fgl2在病毒性肝炎中引發肝臟纖維蛋白沉積和 微血管內微循環障礙，導致肝細胞壞死，表明人fgl2凝血酶原酶在人病毒性肝炎的惡化 進展中起著關鍵性的作用。重型肝炎的肝細胞死亡包括細胞壞死和細胞凋亡。迅速發生的凋亡是引發暴發 性肝炎的重要機制之一。Fas基因廣泛表達于人體組織中，屬于腫瘤壞死因子受體超家族 (TNFRSF)，并被命名為CD95。Fas/FasL通過介導細胞凋亡，在感染性疾病、自身免疫 性疾病和腫瘤的發生中起重要的作用，是病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病、 急慢性肝衰竭和移植性排斥反應等造成肝組織細胞炎癥損傷的重要環節。肝細胞對Fas介 導的凋亡非常敏感。文獻報導，病毒抗原激活肝細胞表達Fas，局部大量浸潤的CTL表 達FasL，引起肝細胞凋亡，肝細胞Fas/FasL表達程度與病變活動性一致，Fas介導的肝 細胞凋亡在肝損傷中起非常重要的作用。腫瘤壞死因子(TNF)包括TNF α和TNF β，其中TNFa主要是由活化的單核
/巨噬細胞分泌，是具有廣泛的生物學活性的多肽調節因子，在內毒素性休克、炎癥、免疫調節、細胞毒性和抗病毒活動中起著重要作用。TNFci誘導的各種細胞反應是通過細 胞表面兩種特異性受體而產生的，即55KD的腫瘤壞死因子受體I (TNFR I)和75KD的腫 瘤壞死因子受體II (TNFR II)。TNF α的許多生物學效應包括細胞凋亡都是通過TNFR I 產生的，而TNFRII則起著輔助信號轉導的作用。TNFRI的高表達所致的肝細胞凋亡在 人類重型肝炎的發生發展中起著重要作用。臨床上多種病因可致重型肝炎，其發病兇險，患者短期內可出現大面積肝細胞 死亡，目前缺乏特異有效的治療手段。研究表明Fas、TNFRI系統介導的肝細胞凋亡與 重型肝炎的肝損傷有關，抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞大量激活并高度集中于患者肝 臟，通過Fas/FasL或TNFα/TNFRI誘導細胞凋亡，進而殺傷肝細胞。hfgl2凝血酶原 酶在病毒性肝炎中引發肝臟纖維蛋白沉積和微血管內微循環障礙，導致肝細胞壞死。上 述研究表明人fgl2凝血酶原酶、Fas/FasL和TNF α /TNFR I系統在人重型肝炎的惡化進 展中起著關鍵性的作用。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指導入特異性針對目標基因的同源雙鏈 RNA(double-strain RNA, dsRNA)，誘導產生的沉默復合體(RISC)將目標mRNA降解，
從而引起目標基因不表達或減效表達。MicroRNA是由機體內源基因轉錄的約70nt的發 夾狀結構前體(pre-microRNA)被Dicer酶切割后產生的約22nt的非編碼單鏈核苷酸片 段，可與目的基因mRNA的非翻譯區結合，抑制mRNA的翻譯而不影響其穩定性，也可 以RISC樣降解與之完全互補的靶RNA。microRNA作為一種新的基因干預工具，具有高 效、特異、快速等優點，為基因調控的研究和基因治療的發展帶來了新的視角。國際上 大量研究表明其基因表達干預效果優于反義技術，更具臨床應用價值。應用腺病毒載體 有如下優點1.宿主范圍廣，對人致病性低；2.可在增殖和非增殖細胞中感染和表達基 因；3.不整合到染色體中，無插入致突變性；4.與人類基因同源；5.能有效進行增殖， 滴度高；6.能同時表達多個基因。發明人構建了 hfgl2、hFas和hTNFRl基因的miRNA 表達質粒，并對其進行了體外細胞水平的實驗，結果證明了 hfgl2、hFas和hTNFRl基因 的miRNA表達質粒對相應基因有特異性地抑制作用，表明它們對病毒誘導的重型肝炎的 治療具有潛在的臨床應用價值。

發明內容
本發明基于重型肝炎暫無確定有效的治療方法，發明了一種用于治療多種病因 誘導的重型肝炎的基因藥物。發明人構建了一組新的生物制劑一 hfgl2凝血酶原酶、 hFas和hTNFRl的miRNA表達質粒，用以抑制重型肝炎相關的hfgl2凝血酶原酶、hFas 和hTNFRl的表達，阻止肝細胞死亡和異常凋亡，可望在臨床上提高重型肝炎患者的存 活率和生存質量。所以，本發明的第一個目的是提供構建hfgl2凝血酶原酶、hFas和 hTNFRl的miRNA表達質粒的方法；本發明的第二個目的是應用hfgl2凝血酶原酶、hFas 和hTNFRl的miRNA表達質粒特異性地抑制hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因 的表達，并驗證其藥學用途。我們通過細胞水平實驗，證實hfgl2凝血酶原酶、hFas和 hTNFRl的miRNA pcDNA表達質粒特異性地抑制細胞系中相應目的基因的表達。為了實現本發明的目的，發明人設計重型肝炎相關基因hfgl2、hFas和hTNFRl 的microRNA腺病毒表達質粒的構建方法，在于采用pAd/CMV/V5-DEST載體和 hfgl2、hFas、hTNFRl 的 pcDNA 表達質粒通過 Gateway 技術，構建 pAd_hfgl2、 pAd-hFas、pAd-hTNFRl。本發明所述的pcDNA表達質粒的構建是將產生hfgl2凝血酶原酶、hFas和 hTNFRl的miRNA的雙鏈寡核苷酸分別插入microRNA的表達載體pcDNATM6.2_GW/ EmGFP-miR 中。本發明所述的寡核甘酸如下產生hfgl2凝血酶原酶miRNA的單鏈寡核苷酸序列為5' -TGCTGTTCTTTGAACACCTCCTCGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCG AGGATGTTCAAAGAA-3 ‘產生hFas的miRNA的單鏈寡核苷酸序列為5' -TGCTGTTAAGTTGGAGATTCATGAGAGTTTTGGCCACTGACTGACTCTC ATGACTCCAACCTTA-3 ‘產生hTNFRl的miRNA的單鏈寡核苷酸序列為5' -TGCTGTTCAGGTGTCGATTTCCCACAGTTTTGGCCACTGACTGACTGTG GGAACGACACCTGAA-3 ‘。本發明所述的pcDNA表達質粒，它們保藏的培養物名稱為大腸桿菌Top 10/ phfgl2-miRNA/ 大腸桿菌 Top 10/phTNFRl-miRNA/ 大腸桿菌 ToplO/phFas-miRNA，已 保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號分別為CCTCC NO: 207188/CCTCC NO M207189/CCTCCNO M207187,保藏日期為 2007 年 11 月 30 日。下面發明人進一步展現本發明表達質粒構建的具體步驟是一、pcDNA表達質粒的構建構建表達hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA pcDNA表達質粒。1.利用Invitrogen公司miRNA設計軟件獲得針對hfg 12凝血酶原酶、hFas和 hTNFRl基因的miRNA模板，合成miRNA模板單鏈。2.將退火的hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因的miRNA模板雙鏈插入 miRNA 的表達載體 pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR。3.測序篩選未發生突變的hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因的miRNA表
達質粒。二、miRNA pcDNA表達質粒的細胞水平試驗分別檢測hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表達質粒特異性地抑 制細胞系中hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因表達的效果。采用red-time PCR 和western-blot方法，從基因水平和蛋白水平驗證hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的 microRNA表達質粒分別特異有效地抑制hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因在293T
細胞中的表達。三、miRNA腺病毒表達質粒的構建利用Gateway 技術，分別將 hfgl2、hFas 和 hTNFRl 的 miRNA pcDNA 表達質粒 和 pAd/CMV/V5-DEST 載體重組成 pAd_hfgl2、pAd-hFas、pAd-hTNFRl 腺病毒表達質 粒。測序篩選未發生突變的pAd_hfgl2、pAd-hFas、pAd-hTNFRl腺病毒表達質粒。


圖1是本發明實時熒光定量PCR檢測hFas-miRNA的干擾效果中，1.空白對照組(未轉染任何質粒的293T細胞)；2.陽性對照組(僅轉染pcDNA3.0-Fas)；3.非相關對照組(pcDNA3.0-Fas+irrelevantmiRNA)；4.實驗組(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNAl)；5.實驗組(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNA2)；6.實驗組(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNA3)。圖2是本發明western-blot檢測hFas-miRNA的干擾效果中，1.空白對照組(未轉染任何質粒的293T細胞)；2.陽性對照組(僅轉染pcDNA3.0-Fas)；3.非相關對照組(pcDNA3.0-Fas+irrelevantmiRNA)；4.實驗組(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNAl)；5.實驗組(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNA2)；6.實驗組(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNA3)。圖3是本發明實時熒光定量PCR檢測hfgl2_miRNA的干擾效果中，1 pcDNA3.1_hfgl2 ；2 phfg 12-miRNA 1+PcDNA3.1 -hfg 12 ；3 phfg 12-miRNA2+PcDNA3.1 -hfg 12 ；4 phfg 12-miRNA3+PcDNA3.1 -hfg 12 ；5 irrelevant miRNA+PcDNA3.1 -hfg 12 ；6 blank control。圖4是本發明western-blot檢測hfgl2_miRNA的干擾效果中，M: Marker, B Blank ；1 phfg 12-miRNA 1 +pcDNA3.1 -hfg 12 ；2 phfg 12-miRNA2+pcDNA3.1 -hfg 12 ；3 phfg 12-miRNA3+pcDNA3.1 -hfg 12 ；4 irrelevant miRNA+pcDNA3.1 -hfg 12 ；5 pcDNA3.1_hfgl2。圖5是本發明實時熒光定量PCR檢測hTNFRl-miRNA的干擾效果中，1.空白對照組(未轉染任何質粒的293T細胞)；2.陽性對照組(僅轉染 pcDNA3.1_TNFRl)；3.非相關對照組(pcDNA3.1-TNFRl+irrelevantmiRNA)；4.實驗組(pcDNA3.0-Fas+hTNFRl_miRNAl)；5.實驗組(pcDNA3.0-Fas+hTNFRl_miRNA2)；6.實驗組(pcDNA3.0-Fas+hTNFRl_miRNA3)。
具體實施例方式以下結合具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述。
本發明構建了 hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表達質粒，并在細 胞水平證實其干擾效應，包括以下步驟(以構建hFas-microRNA表達質粒為例)一、pcDNA表達載體的構建構建hFas-miRNA 表達質粒根據 PubMed 上 hFas cDNA 序列，利用 Invitrogen 公司miRNA設計軟件設計、合成3對互補寡核苷酸單鏈。按照分子克隆操作過程，將ds Oligo 插入 microRNA 的表達載體 pcDNATM6.2-GW/EmGFP_miR，構建 3 個 hFas-miRNA 質粒p-hFasmi-RNAl、p_hFasmiRNA2 和 p_hFasmiRNA3。測序篩選未發生突變的 hFas
基因的miRNA表達質粒。二、miRNA pcDNA表達質粒的細胞水平試驗研究microRNA表達體系在導入人體后是否能特異性結合到靶基因并有效表達，目前 國際上尚無能夠提供直接證據的相關實驗方法，只能通過體外干預試驗來間接反映上述 生物制劑的干預效果。發明人構建了 hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表達 質粒，并對其進行細胞水平的實驗，過程如下(以hFas-miRNA表達質粒體外抑制Fas基 因在293T細胞中的表達為例)材料miRNA 表達質粒p-hFasmiRNAl、p_hFasmiRNA2 和 p_hFasmiRNA3，能夠表 達hFas-miRNA，用于抑制hFas基因的表達。非相關對照質粒。pCDNA3.0-hFas hFas的真核基因表達載體，可通過轉染導入Fas基因使其在細 胞系中外源性表達。293T細胞人胚腎細胞。方法使用Iipofectamine2OOO 將 p-hFasmiRNAl、p_hFasmiRNA2 和 p_hFasmiRNA3 分 別與pcDNA3.0-hFaS共轉染293T細胞，作為試驗組；不轉染任何質粒作為空白對照組； 另僅轉染pcDNA3.0-hFas作為陽性對照組；共轉染非相關對照和pcDNA3.0_hFas作為非 相關對照組。轉染后48h提取細胞RNA，real-time PCR檢測Fas基因mRNA的表達情 況。裂解細胞提取蛋白，western-blot檢測Fas蛋白的表達情況。結果rea卜time PCR 禾口 western-blot 檢測到 293T 細胞內 p-hFasmiRNAl、 p-hFasmiRNA2和p_hFasmiRNA3在基因水平(附圖1)和蛋白水平對hFas的表達均具有 特異性抑制作用(附圖2)。系列體外試驗均表明本發明涉及的新的生物制劑hfgl2凝血酶原酶、hFas和 hTNFRl的miRNA表達質粒在細胞水平可有效地干預相應目的基因的表達(附圖3、4、 5)。在轉染 293T 細胞系 48 小時后，p-hfgl2miRNA 對 hfgl2、p-hFasmiRNA 對 hFas、 p-hTNFRI miRNA對hTNFRl在RNA水平上的抑制效率分別達到89.3 %、87.5 %和80 %。
聯合使用miRNA表達質粒也顯示了相似的很好的干預效果。本項發明對于重型肝炎的治 療，尤其是在提高重型肝炎患者的存活率、延長移植物存活時間等方面具有深遠而重大 的藥學意義。三、miRNA腺病毒表達質粒的構建
利用 Gateway 技術，分別將 hfgl2、hFas 和 hTNFRl 的 miRNA pcDNA 表達質粒 和 pAd/CMV/V5-DEST 載體重組成 pAd_hfgl2、pAd-hFas、pAd-hTNFRl 腺病毒表達質 粒。測序篩選未發生突變的pAd_hfgl2、pAd-hFas、pAd-hTNFRl腺病毒表達質粒。
權利要求
1.重型肝炎相關基因hFasmicroRNA腺病毒表達質粒的構建方法，采用pAd/ CMV/V5-DEST載體和hFas的pcDNA表達質粒通過Gateway技術，構建重組腺病毒 載體pAd-hFas，pcDNA表達質粒的構建是將產生hFas的miRNA的雙鏈寡核苷酸插入 microRNA的表達載體pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR中，其特征在于所述的寡核甘酸 如下，產生hFas的miRNA的單鏈寡核苷酸序列為 5 ‘ -TGCTGTTAAGTTGGAGATTCATGAGAGTTTTGGCCACTG ACTGACTCTCATGACTCCAACCTTA-3 ‘。
2.按權利要求1所述的重型肝炎相關基因hFasmicroRNA腺病毒表達質粒的構 建方法，其特征是pcDNA表達質粒，其保藏的培養物名稱為大腸桿菌ToplO/ phFas-miRNA,已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M207187。
全文摘要
重型肝炎相關基因hFas microRNA腺病毒表達質粒的構建方法及其藥學用途，本發明涉及構建了一組基因生物制劑，即構建了重型肝炎相關的hFas基因的microRNA腺病毒表達質粒，其產生hFasmiRNA的單鏈寡核苷酸序列為5′-TGCTGTTAAGTTGGAGATTCATGAGAGTTTTGGCCACTGACTGACTCTCATGACTCCAACCTTA-3′。在細胞水平檢測microRNA干擾質粒的有效性和特異性，建立hFasmicroRNA腺病毒表達質粒應用于治療重型肝炎。
文檔編號C12N15/861GK102010880SQ201010285909
公開日2011年4月13日 申請日期2008年7月18日 優先權日2008年7月18日
發明者嚴偉明, 習東, 寧琴, 朱傳龍, 王鳴, 羅小平, 郭健文, 高隨 申請人:華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院