專利名稱：一種楊樹不定根發育關鍵基因PeWOX11a及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種楊樹不定根發育關鍵基因 PeTOXl Ia及其應用。
背景技術：
楊樹是世界中緯度平原地區栽培最為廣泛的樹種之一，也是我國重要的速生工業用材樹種和綠化造林樹種之一，對我國無性系林業可持續發展發揮了重要作用。隨著速生高產楊樹新品種的不斷推廣，各地楊樹種植產業迅猛發展，目前我國楊樹人工林面積已超過700萬公頃，居世界首位。一般而言，楊樹是適宜無性繁殖的樹種，在各種無性繁殖方法中，硬枝扦插最為普遍。插穗生根難易程度直接影響造林成活率，且事關無性系的適應性和抗逆性。盡管大多數楊樹都比較容易扦插生根，然而仍有許多優良無性系扦插生根困難。隨著林木遺傳改良工作和無性繁殖技術的發展，人們對于楊樹扦插繁殖的重要性有了新的認識，意識到從理論和實踐上加強對扦插生根的機理研究有其必要性和迫切性。“根深葉茂”，兩者是相輔相成的。在擬南芥、水稻、玉米等草本植物中，根系分子生物學研究引起廣泛關注，并取得顯著進展(Casson and Lindsey 2003 ；Hochholdinger and Zimmermann 2008 ；Peret et al. 2009)。然而,長期以來,楊樹遺傳改良研究更多的是集中在地上部分的表型性狀，而對根系發育性狀的缺乏研究，迄今鮮有楊樹扦插生根及其根系發育相關基因克隆及其功能研究的報道。楊樹扦插生根性狀屬于多基因控制的數量性狀， 受較強的遺傳控制(Zalesny et al. 2005 ；Zhang et al. 2009)。克隆控制這些重要性狀的主效基因是林木后基因組時代的主要研究內容，不僅在探索林木根系發育生物學發面有重要的理論意義，而且在無性系林業生產上有潛在應用價值。WUSCHEL-related homeobox(WOX)蛋白是同源異型盒蛋白家族中為植物所特有的一類轉錄因子，在植物胚胎發育、干細胞維持、器官發生及形態建成等過程中起著非常重要的作用(Deveauxet al. 2008 ；van der Graaffet al. 2009 ；Zhang et al. 2010)。擬南芥有 15個WOX轉錄因子成員，分屬3個進化分枝WUS分枝(WUS clade)包括AtWUS,AtWOXI-7 ； 中間分枝(intermediate clade)包括 AtW0X8,9,11,12 ;古老分枝(ancient clade)包括 AtffOXlO,13，14。AtWUS基因是植物WOX家族的創始成員，它的克隆代表著同源異型盒超基因家族一個新亞類的發現(Lauxet al. 1996 ；Mayer et al. 1998 ；Haeckeret al. 2004)。AtWUS 基因的編碼產物是維持干細胞數量的內源性信號分子，促進花藥和胚珠發育(Ikeda et al. 2009)。AtffOXl和PRESSED FLOffERl (PRSl/Atff0X3)基因作用在于從各分生組織細胞層招募創始細胞以形成營養器官和花器官(Shimizu et al. 2009 ；Vandenbussche et al. 2009)。AtW0X2、Atff0X8和AtW0X9基因在擬南芥胚胎發育過程中決定器官的特異性 (Breuningeret al. 2008 ；Palovaaraet al. 2010)。AtW0X2 和 AtW0X8 最初在卵細胞和合子中特異表達，隨后分別在合子第一次分裂產生的基細胞和頂細胞的子細胞中表達;AtW0X9 最初在合子第一次分裂產生的基細胞的子細胞中表達。AtW0X4基因在原形成層和維管形成層中特異表達，在次生生長過程中維持維管分生組織結構(Jiet al. 2010 ；Hirakawaet al. 2010) ο AtW0X5在根尖不活動中心特異表達(Haecker et al. 2004)，然而AtW0X5和 AtWUS在維持根尖和莖尖干細胞中的作用是可以互相替代的(Sarkaret al. 2007) oAtff0X6/ PRETTY FEWSEEDS2 (PFS2)基因表達是胚珠正常發育所必需的，主要作用是在胚珠的形成中阻止細胞過早的分化(Park et al. 2005)。OsWOXlI是AtWOXll的同源基因，受控于生長素和細胞分裂素共同作用，主要在水稻不定根根原基及成熟初生根的分生組織中表達(Zhao et al. 2009) 0 AtW0X13在雄蕊、初生根、側根及胚胎發育過程中大量表達，而AtW0X14基因局限于側根形成早期和花藥中表達(Deveauxet al. 2008)。上述結果表明高等植物WOX基因家族的表達都具有時空特異性，可能都以不同的作用機制參與植物頂端發育調控。它們與相關基因及植物激素之間的調控網絡尚不十分清楚，在楊樹中尚未有WOX基因家族功能研究的相關報道。不定根發生既是植物器官發生和形態建成中最為基本的理論問題，又是植物無性繁殖和離體器官再生方面重要的實踐問題，因此成為近年來植物功能基因組研究的一個熱點。WOX基因家族在根尖干細胞維持、不定根根原基啟動等過程中起著非常重要的作用，在楊樹中克隆和開發利用這些基因資源，不僅有助于闡明植物生長發育的分子調節機制，而且還能促進林業優良品系的快速繁殖，對農、林與園藝業的發展具有不可估量的價值。

發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla。本發明的另一目的是提供一種楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla 的應用。技術方案為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下一種楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla，其核苷酸序列如SEQ NOl所示。含有權利要求I所述的楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla的載體。含有權利要求I所述的楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla的宿主細胞。楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla在調控楊樹不定根的發生和發育中的應用。楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla的表達蛋白，其氨基酸序列如SEQ N02所示。本發明以南林895楊初生不定根為材料，通過RACE技術克隆了 PeWOXlla基因。 同時，采用通路克隆技術構建其楊樹過量表達載體pH35GS-PeW0Xlla，該基因位于啟動子 P35S之后，在啟動子P35S的驅動下，PeffOXlla可在楊樹體內高效表達，從而調控不定根的發生和發育。其中，所PeWOXlla基因是楊樹不定根發生發育關鍵基因。所述載體質粒，在PeWOXlla基因的5’端組裝組成型強表達啟動子P35S，它能使 PeffOXlla基因在楊樹體內高效表達。所述載體質粒，在PeWOXlla基因的3’端組裝了強終止子N0S，可有效終止 PeTOXlla基因的轉錄。所述載體質粒組裝HPT基因表達盒，作為轉基因楊樹的篩選標記，可以用潮霉素進行轉基因楊樹的篩選。所述載體質粒組裝LB和RB序列，促使組裝于其間的PeWOXl Ia基因表達框架和篩選標記基因HPT整合至楊樹受體細胞染色體中。
有益效果本發明通過將PeWOXlla基因轉入楊樹，過量表達PeWOXlla基因的轉基因楊不定根數目增多，莖上有不定根產生，而且在異位不定根上還能再生出新植株，說明 PeWOXlla基因是控制楊樹不定根發生發育的關鍵調節因子，在林木基因工程和無性系林業領域有重要應用價值。


圖I是植物表達載體pH5GS的結構示意圖；圖2是過量表達PeWOXlIa基因的轉基因楊半定量檢測電泳圖I %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3是過量表達PeWOXlla基因的轉基因楊與未轉基因楊的整體形態比較圖；圖中，左邊為未轉基因楊，右邊為轉基因楊；圖4是過量表達PeWOXlla基因的轉基因楊與未轉基因楊的根形態比較圖；圖中， 左邊為未轉基因楊，右邊為轉基因楊；圖5是過量表達PeWOXlla基因的轉基因楊繼代培養苗10周后莖上產生異位根圖；圖6是過量表達PeWOXlla基因的轉基因楊繼代培養苗莖上異位根再生出新植株圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。以下實施例所使用的主要試劑盒和藥品為=RNAplant Reagent (TIANGEN)，RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN),SuperScript First-Strand Synthesis System(Invitrogen), LR Clonase II enzyme Mix (Invitrogen), pCR 8/Gff/T0P0 vector (Invitrogen),TaKaRa LA Taq(TaKaRa), TaKaRa Taq (TaKaRa), pMD-19T(TaKaRa), 5’ -Full RACE Kit (TaKaRa), 3’-FulI RACE Core Set Ver. 2. 0 (TaKaRa),所有引物合成及測序工作均由 Invitrogen (上海)完成。其他未作出說明的均為常規要求。實施例1895楊cDNA模板的準備可按常規方法準備895楊cDNA，也可以采用如下方法準備總RNA的粗提吸取ImL RNAplant Reagent裂解液于2mL離心管中，將適量經液氮研磨精細的南林895楊根材料加入其中，渦旋并充分混勻；室溫水平放置離心管5-10min， 徹底裂解核蛋白；4°C 12000rmp離心2_5min，轉移上清液至新的離心管；加入O. 2mL 5M NaCl,輕輕混勻；再加入O. 3mL氯仿,上下顛倒混勻；4°C 12000rmp離心IOmin,轉移上清液至新的離心管；重復氯仿抽提；加與所得上清液等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置IOmin ； 4 °C 12000rmp離心IOmin,棄上清液；加入O. 5mL新鮮配置的RLT buffer (ImL RLT加 10 μ L β -巰基乙醇)，徹底渦旋；加入250 μ L無水乙醇，吹打混勻；將混合液轉移至收集柱RNeasy mini column (Pink)中，12000rmp離心15s,棄濾液,離心管可重復使用；在收集柱 RNeasy mini column 中加入 350 μ L RffI buffer, 12000rmp 離心 15s,棄濾液和離心管； 將新鮮配置的8% L DNase I incubation mix加入收集柱RNeasy mini colum膜中央，室溫靜置 15min ;在收集柱 RNeasy mini column 中加入 350 μ L RffI buffer, 12000rmp 離心15s,棄濾液和離心管；將收集柱RNeasy mini column放入新的離心管,加500 μ L buffer RPE, 12000rmp 離心 15s,棄濾液；重新加入 500 μ L buffer RPE, 12000rmp 離心 2min,棄濾液和離心管；將收集柱RNeasy mini column放入新的離心管，13000rmp離心Imin ;將收集柱RNeasy mini column放入新的RNA收集離心管,加入適量RNase-free water到膜中央， 靜置lmin, 12000rmp離心Imin ;將濾液重新加入收集柱RNeasy mini column, 12000rmp離心lmin，回收濾液，即得總RNA ;用紫外分光光度計檢測確定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA的完整性，確認質量完好。總RNA的純化將總RNA的體積用RNase-free水調整到100 μ L(確保RNA總量不超過100 μ g);加入350 μ L RLT工作液(ImL RLT加10 μ L β -巰基乙醇)，充分混勻； 加入250 μ L無水乙醇，充分混勻(不要離心)；將700 μ L混合液將到QIAGEN純化柱中， 12000rmp,離心15s ;棄濾液,加入500 μ L工作液(一份RPE加入4份無水乙醇混勻而成)， 12000rmp,離心15s ;棄濾液,重新加入500 μ L工作液(一份RPE加入4份無水乙醇混勻而成),12000rmp,離心2min ;將純化柱放入新的離心管,最大轉速離心Imin ;將純化柱重新放入新的RNA收集離心管，在純化柱膜中央加適量RNase-free水，室溫靜置lmin，最大轉速離心Imin ;回收濾液即得純化RNA樣品；第一鏈cDNA 合成米用 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System(Invitrogen),以 Oligo DT-Adaptor Primer 引物引發進行第一鏈 cDNA 的合成。具體操作如下準備RNA/Primer 混合液I μ g 南林 895 楊 Total RNA, I μ L Oligo DT-Adaptor Primer(50ng/μ L), I μ L IOmM dNTP mix,力卩 DEPC-treated water 到 10 μ L ；65 V 溫浴5min,而后迅速放置冰上至少Imin ;配制反轉錄混合液，依次加入試劑2 μ L 10XRT buffer,4y L 250nnM MgCl2、2yL 0. IM DTTU μ L RNase OUT (40U/μ L)、I μ L SuperScript RT (200U/ μ L);將 IOyL 反轉錄混合液加入 IOyL RNA/Primer 混合液中， 輕輕混勻，短暫離心；進行反轉錄程序25V, IOmin, 50°C, 50min, 85°C, 5min (終止反應)， 然后置于冰上；加IuL RNase H，混勻，短暫離心，37°C溫浴20min ;冰上冷卻后使用滅菌 Milli-Q水I :50稀釋后( 10ng/yL)-20°C保存備用。實施例2通過RACE技術克隆PeWOXl Ia基因以實施例I制備的895楊cDNA為模板，使用特異性引物來擴增PeWOXlIa基因短片段，其中，擴增PeWOXlla短片段正向引物為5’ TGGACTCCAAAGCCAGAGCAA 3 ;擴增PeWOXlla 短片段反向引物為5’ GCGAGATCTTGATCGTCGGTT 3 :高保真PCR反應體系如下10XLA PCR Buffer (Mg2+free) 5. O μ L ；2. 5mM dNTP Mixture 8. O μ L ；25mM Mg2+5. 0 μ L ;LA Taq DNA Poly merase(5U/y L)0. 5μ L ;正向引物(10 μ Μ) 2 μ L ;反向引物(10μΜ)2μ ;模板(895 楊 cDNA) I μ L ;加無菌 ddH20 補足 50 μ L。反應程序94°C，3min ；94°C，40s, 55°C，30s, 72°C， 30s，35個循環；72°C，10min。對產物測序，獲得的PeWOXlla基因短片段序列如SEQ N03所
/Jn ο依據SEQ N03的PeWOX 11 a基因短片段序列設計3 ’末端的RACE引物，進行3 ’ RACE， 獲得3’ cDNA末端片段，克隆入T-載體，對插入片段進行PCR篩選后進行測序，在NCBI數據庫(http://blast, ncbi. nlm. nih. rov/)中通過Blast確認上述片段與其它植物相關的基因同源。以相同的方法，根據獲得的正確的3’ cDNA末端片段序列設計5’末端的RACE引物，進行5’ RACE,獲得5’ cDNA末端片段，克隆入T-載體，對插入片段進行PCR篩選后進行測序，主要的引物和方法如下(未特別提及的均為常規操作)3’ RACE 弓I 物3 1 RACE gene-specific outer primer 5 ' TGAAACTGTGAGAATAAGGAAAC3’，3 ' RACE gene specific inner primer 5 ' TGGTTCTGTTGGTGATGCAAATG3J ；3 ' RACE Outer Primer 5' GCGAGCACAGAATTAATACGACT3J, 3; RACE Inner Primer 5/ CGCGGATCCGAATTAATACGACT CACTATAGG3，。3' RACE 反應程序根據3，Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (TaKaRa) Protocol 進行。反轉錄(Reverse Transcription):將表I的成分加入到一個置于冰上的 RNase-free的小離心管中，輕輕混勻，短暫離心，42 V溫育lh，72 V溫育15min ；進入
RACE巢式PCR步驟。表I反轉錄體系
南林895楊Total RNA (實施例I制備)lU gdNTP Mix(10mM each)IuL31 RACE Adapter(5 μ Μ)IuL5XM-MLV Buffer2μ LRNase Inhibitor(40U/μ L)0. 25μ LReverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(200U/μ L)0. 25μ LNuclease-free Waterto 10 μ LRACE巢式PCR:反應體系如表2所示，反應程序為94°C，3min;94°C，30s， 60°C，30s, 72°C，lmin, 35 個循環；72°C, 7min。表2 3' RACE巢式PCR的反應體系
Outer 3r RACE ComponentAmountInner 3' RACE Component10XLA PCR Buffer (Mg2+Free)5. 0μ L10XLA PCR Buffer(Mg2+Free)MgCl2 (25mM)5. 0μ LMgCl2 (25mM)dNTP Mixture(each 2. 5mM)8. 0μ LdNTP Mixture(each 2. 5mM)3' RACE gene-specific outer primer2. 0μ L31 RACE gene specific inner primer3' RACE Outer Primer(10 μ M)2. 0μ L3' RACE Inner Primer(10 μ M)
權利要求
1.一種楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlIa，其核苷酸序列如SEQ NOl所示。
2.含有權利要求I所述的楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla的載體。
3.根據權利要求2所述的載體，其特征在于所述載體在PeWOXlla基因的5’端組裝組成型強表達啟動子P35S。
4.根據權利要求2所述的載體，其特征在于所述載體在PeWOXlla基因的3’端組裝了強終止子NOS。
5.根據權利要求2所述的載體，其特征在于所述載體組裝HPT基因表達盒，作為轉基因楊樹的篩選標記，可以用潮霉素進行轉基因楊樹的篩選。
6.根據權利要求2所述的載體，其特征在于所述載體組裝LB和RB序列，促使組裝于其間的PeWOXlla基因表達框架和篩選標記基因HPT整合至楊樹受體細胞染色體中。
7.含有權利要求I所述的楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla的宿主細胞。
8.權利要求I所述的楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla在調控楊樹不定根的發生和發育中的應用。
9.權利要求I所述的楊樹不定根發育關鍵基因PeWOXlla的表達蛋白，其氨基酸序列如 SEQ N02 所示。
全文摘要
本發明公開了一種楊樹不定根發育關鍵基因PeWOX11a，其核苷酸序列如SEQNO1所示。本發明通過將PeWOX11a基因轉入楊樹，過量表達PeWOX11a基因的轉基因楊不定根數目增多，莖上有不定根產生，而且在異位不定根上還能再生出新植株，說明PeWOX11a基因是控制楊樹不定根發生發育的關鍵調節因子，在林木基因工程和無性系林業領域有重要應用價值。
文檔編號C12N15/29GK102586273SQ20121001778
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月19日 優先權日2012年1月19日
發明者徐立安, 潘惠新, 王光萍, 王明庥, 胥猛, 謝雯凡, 陳英, 黃敏仁 申請人:南京林業大學