專利名稱：雙組分系統基因dtrA和dtrB的用途與利用方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及耐輻射異常球菌Rl中一對雙組分系統基因dtrA和dtrB在提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性上的用途和利用方法。
背景技術：
耐福射異常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl)具有超強的電離福射、紫外線、DNA損傷試劑及干燥的抗性，備受各國科學家的關注和重視。如宋道軍、余增亮的《耐輻射異常球菌抗輻射機理的研究新進展》中報道了各國在耐輻射異常球菌生理生化和遺傳學特性、特殊的細胞膜結構、各種誘變因素所致的DNA損傷與其高效的修復機制方面的研究；基因組分析顯示，耐輻射球菌Rl中含有20種組氨酸激酶和26種反應調控蛋白，存在多個 雙組分系統，其中二號染色體上的dr_a0009 (dtrA)和dr_a0010 (dtrB)基因分別編碼組氨酸激酶和反應調控蛋白，與枯草芽孢桿菌的同源性為40%以上。當外界或內部環境發生變化吋，組氨酸激酶的傳感器結構域能夠感應環境的刺激并迅速ニ聚化，導致催化ATP依賴的特定的組氨酸殘基自我磷酸化，然后反應調控蛋白催化組氨酸的磷酸基團轉移到它自身的天門冬氨酸殘基上，反應調控蛋白的磷酸化激活效應器結構域，從而與下游基因的啟動子或與蛋白作用，產生調控應答反應。細胞內有一系列的信號轉導途徑應對外界環境刺激，其中熱激和UV輻射是ー種重要的逆境脅迫。熱激反應是細胞和有機體應對溫度升高時的ー種保守反應，能保護細胞和有機體免受熱損傷，使得細胞恢復正常的生理活動，從而達到ー個更高的耐熱性水平。熱激能迅速誘導ー套基因的表達，同時使細胞膜的流動性發生變化。UV輻射能夠產生嘧啶ニ聚體，造成的DNA損傷。目前，耐福射異常球菌 Rl (Deinococcus radiodurans Rl)中 dtrA (dr a0009,GeneID:1798204)基因和 dtrB (dr aOOlO, Gene ID: 1798154)基因對于熱激反應和 UV輻照的研究尚未見報道。而在發酵行業中，需要高溫發酵殺死蟲卵及ー些有害細菌，可以提高發酵的質量，因此發酵行業對于熱敏感菌株具有較大需求。紫外線(ultravioletradiation, UV)對人體皮膚造成損傷已日益得到人們的重視，隨之產生多種針對皮膚的防曬產品，在化妝品行業對抗UV輻射菌株的需求也與日俱增，因此利用基因工程研究基因在菌株熱敏感性和UV輻射抗性中的應用是非常重要并具有經濟價值的。

發明內容
為解決以上技術問題，本發明提供了一種雙組分系統基因dtrA和dtrB的用途，用于提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性。雙組分系統基因dtrA和dtrB的序列如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示。本發明還提供了ー種利用雙組分系統基因dtrA和dtrB提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的方法,包括克隆雙組分系統基因dtrA和dtrB的步驟，雙組分系統基因的序列如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示，還包括構建具有熱敏感性和UV輻射抗性的Λ dtrA和AdtrB突變株的步驟。克隆雙組分系統基因dtrA和dtrB的步驟包括設計dtrA和dtrB基因的PCR擴增特異性引物。從Deinococcus radiodurans基因組DNA中擴增出完整的dtrA和dtrB核苷酸序列。構建具有熱敏感性和UV輻射抗性的Λ dtrA和Λ dtrB突變株的步驟包括I).用SacII酶和EcoRV酶將分別連接在載體上的dtrA基因和dtrB基因從中間切開；2).插入兩端加了同一酶切位點的卡那抗性盒，測序驗證克隆基因；3).通過PCR將插入卡那抗性盒的目的片段擴增出來；
4).將插入卡那抗性盒的DNA片段通過同源重組的方法直接轉化到耐輻射異常球菌Rl中。優選的是,所述連接dtrA和dtrB基因的載體為T載體。進ー步優選的是，所述連接dtrA基因的載體為pMD19T載體。進ー步優選的是,所述連接dtrB基因的載體為pGEM_T Easy載體。具體將DNA片段轉化到耐輻射異常球菌Rl中的步驟如下I)挑取耐輻射異常球菌Rl單菌落于TGY液體培養基中，30°C培養至對數期；2)按1:100轉接至新鮮的TGY液體培養基中，30°C培養至對數期(0D_ ^ O. 4);3)取2111し菌液6000\8離心2111丨11，去上清，用20(^し含301111 CaCl2的TGY液體培養基重懸菌體，30°C水浴80min ；4)吸50 μ L上述菌懸液于一新的EP管中，加入10 μ L冰上放置的DNA片段，振蕩混勻后，30°C水浴90min ；5)加800 μ L新鮮TGY液體培養基混勻，于30°C搖床中培養4h ；6)取100 μ L培養好的菌液涂布于不含抗生素的TGY固體培養基上，30°C培養約2d ；7)挑取單菌落，提取其基因組，用驗證引物進行PCR驗證，獲得AdtrA和AdtrB
突變株。對該突變株進行一系列生理生化分析，實驗結果顯示，本發明所述的dtrA基因和dtrB基因突變后，導致在高溫(42°C )下生長時兩突變株較野生型Rl敏感，同時突變株的UV輻射抗性增強。該雙組分系統基因dtrA和dtrB的提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的功能可以被利用在發酵行業，將該雙組分系統基因的突變AdtrA和AdtrB作為發酵用菌株，可提聞菌株耐聞溫的能力，提聞聞溫細菌的分解代謝能力，縮短發酵時間，提聞生廣能力，減少染菌的機會，提高發酵的產量和質量；將該雙組分系統基因dtrA和dtrB應用到生產抗UV輻射的化妝品行業，可利用轉化了該系統基因的菌株生產的可吸收紫外光輻射的代謝產物生產抗紫外線輻射化妝品，具有良好的應用前景。


圖I是含有D. radiodurans Rl中dtrA基因序列的PCR產物驗證電泳圖譜；圖2是含有D. radiodurans Rl中dtrB基因序列的PCR產物驗證電泳圖譜；圖3是野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB生長到對數期后，經30°C正常溫度處理3h后的生長情況的照片，圖中a為野生型Rl ；b 為 Λ dtrA 突變株；c 為 AdtrB 突變株；圖4是野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB生長到對數期后，經42°C高溫熱激處理3h后的生長情況的照片，圖中a為野生型Rl ；b 為 Λ dtrA 突變株；c 為 Λ dtrB 突變株； 圖5是野生型Rl和突變株AdtrA和Λ dtrB在42°C高溫處理下的生長曲線，其中a為野生型Rl ；b 為 Λ dtrA 突變株；c 為 Λ dtrB 突變株；圖6是UV輻照前野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB的生長情況的照片，圖中a為野生型Rl;b 為 Λ dtrA 突變株；c 為 Λ dtrB 突變株；圖7是UV輻照處理7min后野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB的生長情況的照片，圖中a為野生型Rl ；b 為 Λ dtrA 突變株；c 為 Λ dtrB 突變株；
具體實施例方式下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解為這些實施例僅用于舉例說明本發明的方法，而不用于限制本發明的范圍。凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規條件。實施例IdtrA和dtrB核苷酸序列SEQ ID NO: I的克隆根據已公布的Deinococcus radioduransRl菌株的基因組序列，設計dtrA和dtrB基因的PCR擴增特異性引物。從Deinococcus radiodurans基因組DNA中擴增出完整的dtrA和dtrB核苷酸序列dtrA-Up 5， CGCCACGAACACGGTCAG 3，dtrA-Down 5’ CACTCAGCGGCACGAAGG 3’dtrB-up 5’ CACCGGCCTGAACTCCAT 3’dtrB-down 5’ TCGCACCGTTCCTACACC 3’PCR 反應條件為 95°C、5min，[%で 30sec,57°C 30sec,72°C 90sec]30 個循環，72°C延伸10min，PCR產物過柱純化，dtrA克隆于pMD19T載體上，dtrB克隆于pGEM-T Easy載體上。
實施例2構建Λ dtrA和Λ dtrB突變株dtrA基因含有ー個SacII酶切位點，dtrB基因含有ー個EcoRV酶切位點，分別用SacII酶和EcoRV酶將連在pMD19T載體和pGEM_T Easy載體上的dtrA基因和dtrB基因從中間切開，插入兩端加了同一酶切位點的卡那抗性盒，測序驗證克隆基因正確；通過PCR將插入卡那抗性盒的目的片段擴增出來；將插入卡那抗性盒的DNA片段通過同源重組的方法直接轉化到耐輻射異常球菌Rl中，提取其基因組，用驗證引物擴增目的片段并電泳，驗證圖譜見圖I和圖2。具體轉化方法如下I)挑取耐輻射異常球菌Rl單菌落于TGY液體培養基中，30°C培養至對數期；2)按1:100轉接至新鮮的TGY液體培養基中，30°C培養至對數期(OD6tltl ^ O. 4); 3)取2111し菌液6000\8離心2111丨11，去上清，用20(^し含301111 CaCl2的TGY液體培養基重懸菌體，30°C水浴80min ；4)吸50 μ L上述菌懸液于一新的EP管中，加入IOyL冰上放置的DNA片段，振蕩混勻后，30°C水浴90min ；5)加800 μ L新鮮TGY液體培養基混勻，于30°C搖床中培養4h ；6)取100 μ L培養好的菌液涂布于不含抗生素的TGY固體培養基上，30°C培養約2d ；7)挑取單菌落，提取其基因組，用驗證引物進行PCR驗證，獲得AdtrA和AdtrB
突變株。實施例3野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB的熱激反應實驗I、實驗方法將野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB活化后，按1%的接菌量分別接種于不含任何抗生素的TGY液體培養基(Rl)和含8 μ g/mL卡那霉素的TGY液體培養基(Δ dtrA和AdtrB)中，30°C振蕩培養IOh，培養至對數期(OD6tltl ^ O. 8)，用于熱激處理。I)各取20mT,野生型Rl和突變株Δ dtrA和Δ dtrB的菌液,6000 X g離心IOmin,收集菌體，菌體分別用IOmM的pH 7. O的磷酸緩沖液洗滌2次，重懸于20mL磷酸緩沖液中，30°C正常培養3h，各取ImL于I. 5mL EP管中，用無菌的去離子水倍比稀釋(10—1到10_5)，分別取IOyL稀釋至10—1到10_5的野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB菌液，滴加在不含任何抗生素的TGY固體培養基上，觀察野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB的生長情況。2)各取20mL野生型Rl和突變株Δ dtrA和Δ dtrB的菌液,6000 X g離心IOmin,收集菌體，菌體分別用IOmM的pH 7. O的磷酸緩沖液洗滌2次，重懸于20mL磷酸緩沖液中，42°C熱激培養3h，各取ImL于I. 5mL EP管中，用無菌的去離子水倍比稀釋(10—1到10_5)，分別取IOyL稀釋至10—1到10_5的野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB菌液，滴加在不含任何抗生素的TGY固體培養基上，觀察野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB的生長情況。2、實驗結果I)已培養至對數期的野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB在30°C正常培養3h后，菌株均能正常生長，生長狀況一致，沒有差異(見圖3，表I )。2)已培養至對數期的野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB在42°C高溫熱激3h后，野生型Rl和突變株Λ dtrA和AdtrB的生長表現出明顯的差異(見圖4，表I)。
表I野生型Rl和突變株Λ dtrA和Λ dtrB在42°C熱激條件下的生長情況
權利要求
1.一種雙組分系統基因dtrA和dtrB的用途，其特征在于用于提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性。
2.如權利要求I所述的雙組分系統基因dtrA和dtrB的用途，其特征在于雙組分系統基因dtrA和dtrB的序列如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示。
3.一種利用雙組分系統基因dtrA和dtrB提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的方法，包括克隆雙組分系統基因dtrA和dtrB的步驟，雙組分系統基因的序列如SEQ ID NO: I和SEQID N0:2所示，其特征在于還包括構建具有熱敏感性和UV輻射抗性的A dtrA和A dtrB突變株的步驟。
4.根據權利要求3所述的利用雙組分系統基因dtrA和dtrB提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的方法，其特征在于克隆雙組分系統基因dtrA和dtrB的步驟包括設計dtrA和dtrB基因的PCR擴增特異性引物。
5.根據權利要求4所述的利用雙組分系統基因dtrA和dtrB提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的方法，其特征在于克隆雙組分系統基因dtrA和dtrB的步驟包括從Deinococcusradiodurans基因組DNA中擴增出完整的dtrA和dtrB核苷酸序列。
6.如權利要求5所述的利用雙組分系統基因dtrA和dtrB提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的方法，其特征在于構建具有熱敏感性和UV輻射抗性的A dtrA和A dtrB突變株的步驟包括 1).用SacII酶和EcoRV酶將分別連接在載體上的dtrA基因和dtrB基因從中間切開； 2).插入兩端加了同一酶切位點的卡那抗性盒，測序驗證克隆基因； 3).通過PCR將插入卡那抗性盒的目的片段擴增出來； 4).將插入卡那抗性盒的DNA片段通過同源重組的方法直接轉化到耐輻射異常球菌Rl中。
7.如權利要求6所述的利用雙組分系統基因dtrA和dtrB提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的方法，其特征在于所述連接dtrA和dtrB基因的載體為T載體。
8.如權利要求7所述的利用雙組分系統基因dtrA和dtrB提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的方法，其特征在于所述連接dtrA基因的載體為PMD19T載體。
9.如權利要求8所述的利用雙組分系統基因dtrA和dtrB提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的方法，其特征在于所述連接dtrB基因的載體為pGEM-T Easy載體。
10.如權利要求6至9中任一項所述的利用雙組分系統基因dtrA和dtrB提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的方法，其特征在于具體將DNA片段轉化到耐輻射異常球菌Rl中的轉化方法如下 1)挑取耐輻射異常球菌Rl單菌落于TGY液體培養基中，30°C培養至對數期； 2)按1:100轉接至新鮮的TGY液體培養基中，30°C培養至對數期(0D600^ 0. 4)； 3)取21^菌液6000\8離心2111111，去上清，用2001^含301111CaCl2的TGY液體培養基重懸菌體，30°C水浴80min ； 4)吸50ii L上述菌懸液于一新的EP管中，加入IOuL冰上放置的DNA片段，振蕩混勻后，30°C水浴 90min ； 5)加800ii L新鮮TGY液體培養基混勻，于30°C搖床中培養4h ；6)取100ii L培養好的菌液涂布于不含抗生素的TGY固體培養基上，30°C培養約2d ；7)挑取單菌落，提取其基因組，用驗證引物進行PCR驗證，獲得AdtrA和AdtrB突變株。
11.通過權利要求10的利用雙組分系統基因dtrA和dtrB提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的方法構建的突變菌株。
全文摘要
本發明提供了一種雙組分系統基因dtrA和dtrB的用途，用于提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性。還提供了一種雙組分系統基因dtrA和dtrB的利用方法，包括克隆雙組分系統基因dtrA和dtrB的步驟，雙組分系統基因的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，進一步構建具有熱敏感性和UV輻射抗性的ΔdtrA和ΔdtrB突變株；該雙組分系統基因dtrA和dtrB的提高菌株熱敏感性和UV輻射抗性的功能可以被利用在發酵行業和生產抗UV輻射的化妝品行業，具有良好的應用前景。
文檔編號C12N1/20GK102676585SQ20121016026
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月22日 優先權日2012年5月14日
發明者張維, 林敏 , 王文濤, 趙鵬, 郝艷華, 陳明 申請人:中國農業科學院生物技術研究所