專利名稱：通過clec-6激活人抗原呈遞細胞的制作方法
技術領域：
一般而言，本發明涉及抗原呈遞和免疫細胞激活領域，具體地，涉及通過CLEC-6C 型凝集素激活免疫細胞。
背景技術：
不限制本發明的范圍，描述與樹突細胞相關的發明背景。樹突細胞通過提供可溶性細胞間信號繼而病原菌識別而在控制先天性和獲得性免疫的界面中起著關鍵作用。樹突細胞的這些功能主要依賴于特定的表面受體，“模式識別受體(PRR) ”，最為典型的例子是toll樣受體(TLR)和C型凝集素或凝集素樣受體(LLR) (1-3)。在目前的模式中，TLR的主要作用是提醒DC以產生白細胞介素12 (IL-12)和其它炎癥細胞因子以起始免疫應答。C-型LLR作為巨噬細胞和DC中強大的抗原捕獲和攝取機制的組成部分發揮作用(I)。然而，與TLR相比，LLR可能具有更寬泛的生物功能，包括細胞遷移(4)、細胞間相互作用(5)。LLR的這些多重功能可以是由于不同于TLR，LLR能夠識別自身和非自身的事實。然而，LLR的復雜性，包括免疫細胞中表達的眾多LLR的冗余性，是對各個LLR的詳細功能理解的主要障礙之一。此外，大多數這些受體的天然配體仍然沒有被鑒定出來。雖然如此，最近研究的證據表明LLR與TLR協同在微生物感染過程中可以對激活免疫細胞起作用(6-14)。發明概述本發明包括利用抗人CLEC-6單克隆抗體(mAb)以及鑒定它們的生物功能的組合物和方法，其中這些生物功能是預期的抗CLEC-6mAb及其替代物的治療應用的基礎。本發明包括接觸抗原呈遞細胞，例如樹突細胞(DC)，所述細胞表達CLEC-6并在與特定的DC激活相關的攝取抗原而導致改變的體液和細胞免疫應答中發揮作用。本發明的發明人開發并鑒定了特異的能夠激活具有CLEC-6的細胞的試劑(agent)，以及在接受這些信號的細胞中導致的變化對免疫系統中其它細胞的影響。這些影響(單獨，或者與其它信號協同(即共激活))高度預測對特定疾病狀態的治療效果或者在接種免疫中增強的保護性效果。發現作為LLR成員之一的CLEC-6單獨或與其它細胞信號協作在激活細胞(包括 DC)方面發揮功能。CLEC-6介導的細胞激活受抗CLEC-6mAb的誘導，因而抗人CLEC_6mAb 或其替代物在開發針對疾病的試劑中是有用的。本發明包括用于增加表達CLEC-6的抗原呈遞細胞的抗原呈遞效力的組合物和方法，通過使抗CLEC-6特異性抗體或其片段與抗原呈遞細胞接觸來進行，其中抗原呈遞細胞被激活。所述抗原呈遞細胞可以是分離的樹突細胞、外周血單核細胞、單核細胞、髓樣樹突細胞及它們的組合。在一個具體實施方案中，抗原呈遞細胞是已在體外與GM-CSF和IL-4、 干擾素α、抗原及其組合一起培養的分離的樹突細胞、外周血單核細胞、單核細胞、B細胞、 髓樣樹突細胞及這些細胞的組合。所述方法還可包括用GM-CSF和IL-4激活抗原呈遞細胞的步驟，其中與CLEC-6特異性抗體或其片段的接觸增加抗原呈遞細胞上的CD86和HLA-DR的表面表達。發現可以使用本發明用CLEC-6特異性抗體或片段激活抗原呈遞細胞，以增加抗原呈遞細胞上的⑶86、⑶80和HLA-DR的表面表達。如果抗原呈遞細胞是樹突細胞(⑶)， 用CLEC-6特異性抗體和GM-CSF和IL-4激活的DC具有圖4的基因表達譜。用CLEC-6特異性抗體激活的抗原呈遞細胞分泌IL-6、MIP-la、MCP-l、IP-10、TNFa及其組合，而如果APC 是樹突細胞，則它們分泌 IL-6、MIP-la, MCP-U IP-10、TNFa, IL_12p40、IL-la, IL-Ib 及其組合。當激活已與GM-CSF和IL-4或干擾素α接觸的樹突細胞時，CLEC-6特異性抗體或其片段以及⑶40配體進一步增強對樹突細胞的激活。當與GM-CSF和IL-4或干擾素α以及CLEC-6特異性抗體或其片段接觸時，DC增加其共刺激活性。在另一個實施方案中，可以使用本發明的方法通過經TLR9受體和CLEC-6凝集素共激活抗原呈遞細胞來激活抗原呈遞細胞，其中所述細胞增加細胞因子和趨化因子的產生，甚至觸發B細胞增殖。還發現在B細胞存在下，用CLEC-6和L0X-1共激活抗原呈遞細胞，誘導B細胞免疫球蛋白類別轉換。TLR9受體可被TLR9配體、抗TLR9抗體或其片段、抗 TLR9-抗CLEC-6雜交抗體或其片段、抗TLR9-抗CLEC-6配體結合物所激活。CLEC-6特異性抗體或其片段的例子可選自克隆12H7、12E3、9D5、20H8及它們的組合。用CLEC-6特異性抗體或其片段通過CLEC-6-受體激活的樹突細胞也激活單核細胞、樹突細胞、外周血單核細胞、B細胞及它們的組合。本發明的再一個實施方案包括與粘附蛋白(Cohesin)/錨定蛋白(Dockerin)對的一半(half)結合的CLEC-6特異性抗體或其片段。CLEC-6特異性抗體或其片段可以與粘附蛋白/錨定蛋白對的一半結合，而互補性一半(complementary half)可以與抗原結合。抗原可以是分子、肽、蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、細胞、病毒或其部分、細菌或其部分、真菌或其部分、寄生蟲或其部分。在另一個實施方案中，CLEC-6特異性抗體或其片段與粘附蛋白/錨定蛋白對的一半結合，而該對的另一半與一種或多種細胞因子結合，所述細胞因子選自白細胞介素，轉化生長因子(TGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(TOGF)，表皮生長因子(EGF)，結締組織活性肽(CTAP)，成骨因子，以及這些生長因子的生物活性類似物、片段和衍生物，B/T細胞分化因子，B/T細胞生長因子，促有絲分裂細胞因子，趨化細胞因子和趨化因子，集落刺激因子，血管生成因子，IFN-α，IFN-β，IFN- y , ILl， IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18 等，瘦素(I印tin)，肌肉生長抑制素(myostatin)，巨噬細胞刺激蛋白，血小板衍生生長因子，TNF-α，TNF-β，NGF，CD40L, CD137L/4-1BBL，人淋巴毒素-β，G-CSF, M-CSF, GM-CSF, PDGF，IL-Ia，ILl-β，IP-10，PF4，GRO，9Ε3，促紅細胞生成素，內皮抑素(endostatin)，血管抑素(angiostatin)，VEGF，包括β轉化生長因子(例如TGF-β 1、TGF_ β 2、TGF_ β 3)在內的轉化生長因子(TGF)超基因家族；骨形態發生蛋白(例如BMP-I、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、 BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、ΒΜΡ-9);肝素結合生長因子(成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、胰島素樣生長因子(IGF));抑制素(例如抑制素A、抑制素B);生長分化因子(例如GDF-1);以及活化素(例如活化素A、活化素B、 活化素AB)。本發明還包括用于將髓樣樹突細胞與漿細胞樣樹突細胞分開的方法，該方法通過利用CLEC-6表達將表達CLEC-6的髓樣樹突細胞、B細胞或單核細胞與不表達CLEC-6的漿
4細胞樣樹突細胞分離來進行。本發明包括表達CLEC-6特異性抗體或其片段的雜交瘤，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段激活抗原呈遞細胞表達新的表面標記物、分泌一種或多種細胞因子或者既表達新的表面標記物又分泌一種或多種細胞因子，所述雜交瘤例如克隆12H7、12E3、9D5、20H8 及其組合。抗CLEC-6雜交瘤產生的抗體可用于增強B細胞免疫應答的方法中，通過觸發B 細胞上的CLEC-6受體以增加抗體的產生、分泌細胞因子、增加B細胞激活表面標記物的表達及其組合。B細胞分泌IL-8、MIP-Ia及其組合，和/或增加IgM、IgG和IgA的產生。本發明還包括用于增強T細胞活化的方法，通過用CLEC-6特異性抗體或其片段觸發樹突細胞上的CLEC-6受體并使T細胞與CLEC-6活化的樹突細胞接觸來進行，其中T細胞的活化被增強。所述T細胞可以是原初CD8+T細胞，而所述樹突細胞可以與GM-CSF和 IL-4、干擾素α、抗原及其組合相接觸。發現由CLEC-6活化的DC激活的T細胞增強T細胞分泌的IL-10、IL-15，和4-1BBL的表面表達，及其組合。T細胞在暴露于用抗CLEC-6特異性抗體或其片段激活的樹突細胞時也增殖。本發明還包括由哺乳動物細胞分泌的抗CLEC-6免疫球蛋白或其部分和與免疫球蛋白結合的抗原。所述抗CLEC-6抗原特異性結構域可以是全長抗體、抗體可變區結構域、 Fab片段、Fab’片段、F(ab) 2片段、以及Fv片段、以及Fabc片段和/或具有部分Fe結構域的Fab片段。所述抗CLEC-6抗體還可用于制備疫苗，所述疫苗包含用CLEC-6特異性抗體或其片段活化的樹突細胞。本發明還包括單獨或與共激活劑一起結合(engage)免疫細胞上的CLEC-6受體，組合活化抗原呈遞細胞的試劑用于治療性目的的應用；免疫細胞上的CLEC-6結合劑用于制備疫苗的應用，該CLEC-6結合劑與或不與激活劑一起與一種或多種抗原連接；抗 CLEC-6劑作為免疫細胞的共激活劑用于增強通過免疫細胞上表達的除CLEC-6外的細胞表面受體引起的免疫應答的用途；能夠通過CLEC-6受體結合并活化免疫細胞的抗CLEC-6 抗體V區序列的用途；和/或與一種或多種毒性劑連接的DC-CLEC-6結合劑用于在已知或懷疑由經CLEC-6的免疫細胞的不適當激活導致的疾病的情況下或在表達CLEC-6的病理 (pathogenic)細胞或組織的情況下的治療性目的的用途。另外一個實施方案包括模塊式rAb載體，其包含CLEC-6特異性抗體結合結構域， 該結合結構域與一個或多個含有粘附蛋白-錨定蛋白結合對的一半的抗原載體結構域連接。所述抗原特異性結合結構域可包含抗體的至少一部分和/或與粘附蛋白-錨定蛋白結合對的一半構成融合蛋白的抗體的至少一部分。在一個實施方案中，所述rAb還可包含與抗原結合的粘附蛋白-錨定蛋白結合對的互補性一半，其中所述與抗原結合的粘附蛋白-錨定蛋白結合對的互補性一半與所述的模塊式rAb載體形成復合物，或者與抗原構成融合蛋白的粘附蛋白-錨定蛋白結合對的互補性一半。rAb的抗原特異性結構域可以是全長抗體、抗體可變區結構域、Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段、以及Fv片段、以及Fabc片段和/或具有部分Fe結構域的Fab片段。附圖簡述為了更完全的理解本發明的特征和優點，現參考發明詳細以及附圖進行說明，在附圖中圖IA和IB顯示體內和體外培養的DC表達CLEC-6。圖IA顯示來自正常供體的PBMC用抗⑶11c、⑶14、⑶19和⑶3以及抗CLEC mAb進行染色。對各個抗體染色的細胞作門以檢測CLEC-6的表達水平。圖IB顯示來自正常供體的單核細胞在GM-CSF存在下用IL-4(IL-4DC)或IFNa(IFNDC)培養，并用抗CLEC_6mAb或同型對照抗體染色。C.髓樣 DC(Lin-HLA-DR+CDllc+CD123_)是用FACS分選儀從血中純化得到，并用抗CLEC_6mAb染色。 空的和實的柱狀圖代表分別用同型對照和抗CLEC-6mAb染色的細胞。圖2顯示抗CLEC-6mAb活化DC。IFNDC (lxl05/200ul/孔)在用不同mAb克隆包被的培養板中培養18小時。用Luminex分析培養物上清液以測量細胞因子和趨化因子。圖3A 和 3B 顯示抗 CLEC_6mAb 活化 DC。圖 3A 顯示 IL-4DC (IxlO5/ 孔 /200ul)用抗CLEC-6刺激18小時，然后細胞用抗⑶86和HLA-DR染色。圖3B顯示用FACS分選儀從血中純化得到的髓樣DC。mDC(lxl05/孔/200ul)用抗CLEC-6刺激18小時，然后細胞用抗 CD86、CD80 和 HLA-DR 染色。圖4顯示用抗CLEC-6或對照mAb刺激12小時的IL-4DC的基因表達譜。用 RNeasy 柱(Qiagen)提取總 RNA，并用 2100Bioanalyser (Agilent)進行分析。用 Illumina totalprep labeling試劑盒(Ambion)制備生物素標記的cRNA祀標,并與Sentrix Human6 BeadChips (46K轉錄本)雜交。這些微陣列由附著在裝于硅片表面上蝕刻的微孔內的 50mer寡聚核苷酸探針組成。用鏈霉抗生物素_Cy3染色后，微陣列表面用Illumina制造的亞微米分辨掃描儀成像(Beadstation 500X)。數據分析采用基因表達分析軟件程序-GeneSpring, Version 7. I (Agilent)進行。圖5A和5B顯示用抗CLEC-6激活的DC產生的細胞因子和趨化因子的量增加。如圖I圖注所述的體外培養的IL-4DC和純化的mDC(lxl05/200ul)在用抗CLEC_6mAb (2ug/ 孔)包被的培養板中培養18小時。用Luminex分析培養物上清液以測量細胞因子和趨化因子。圖6A 和 6B 顯示 CLEC-6 和 CD40 協同激活 DC。IL-4DC (2xl05/200ul/ 孔)在可溶性⑶40L(20ng/ml)存在或不存在下在抗CLEC-6包被的96孔板中培養18小時。對照mAb 也進行測試。18小時后，用抗CD83染色細胞，并用Luminex分析培養物上清液以測量細胞因子和趨化因子。圖7A至7C顯示DC上表達的CLEC-6導致增強的體液免疫應答。6天的GM/ IL-4DC(5xl03/孔)在用抗CLEC-6或對照mAb包被的96孔板中培養16-18小時，然后與用CFSE染色的IxlO5自體同源的CD19+B細胞在20單位/ml IL-2和50nM CpG存在下共培養。圖7A :第6天細胞用熒光標記抗體染色。⑶3+和7-AAD+細胞被作門去除(gated out)。⑶38+和CFSE-細胞用FACS分選儀純化，并進行吉姆薩染色。圖7B顯示對第13天的培養物上清液進行ELISA，以分析總IgM、IgG和IgA。圖7C顯示在mAb包被的培養板中培養48小時的6天GM/IL-4DC，并通過細胞內染色測定APRIL的表達水平。虛線是用對照的抗體染色的細胞。細線和粗線代表分別在用抗CLEC-6和對照mAb包被的培養板中培養的細胞。數據代表采用每次來自三個不同的正常供體的細胞所進行的兩次單獨實驗。圖8A和8B顯示B細胞上表達的CLEC-6導致B細胞的活化和免疫球蛋白的產生。 圖8A顯示⑶19+B細胞(2xl05/孔/200ul)在mAb包被的培養板中培養16-18小時，然后用 Luminex分析培養物上清液以測量細胞因子和趨化因子。圖8B顯示IxlO5⑶19+B細胞在用 mAb包被的培養板中培養13天。用ELISA測量總Ig水平。數據代表采用來自三個不同的正常供體的細胞所進行的兩次單獨實驗。圖9A至9E顯示DC上表達的CLEC-6導致增強的抗原特異性T細胞應答。圖9A 顯示5xl03的6天IFNDC在用抗CLEC-6或對照mAb包被的培養板中培養16-18小時，然后與純化的同種異源T細胞進行共培養。在收集前用3[H]-胸腺嘧啶脫氧核苷，IuCi/孔進行脈沖細胞18小時。3[H]-胸腺嘧啶脫氧核苷的攝取用β計數器進行測量。圖9Β顯示 IL-4DC(5xl03/孔)在IOOnM Flu Ml肽(HLA-A2表位)(上部兩個圖形)或重組Flu Ml蛋白(下部兩個圖形)存在下在mAb包被的培養板中溫育16小時。與2xl06純化的自體同源⑶8T細胞共培養7天。第2天在培養物中添加20單位/ml IL-2和10單位/ml IL-I0 用抗CD8和Flu Ml-四聚體染色細胞。圖9C顯示，IL-4DC (5xl03/孔)在20uM Mart-I肽 (HLA-A2表位)(上部兩個圖片)或重組Mart-I蛋白(下部兩個圖片)存在下在用mAb包被的培養板中溫育16小時。與2xl06純化的自體同源⑶8T細胞共培養10天。第2天在培養基中添加20單位/ml IL-2和10單位/ml IL-7。用抗CD8和Mart-I-四聚體染色細胞。圖9D顯示，IL-4DC用IOnM抗CLEC-6_Mart_l復合物或對照Ig-Mart-I復合物負載2 小時。與2xl06純化的自體同源⑶8T細胞共培養10天。用抗⑶8和Flu Ml特異性四聚體染色細胞。下部兩個圖片中的細胞用來自大腸桿菌(E.mii)的20ng/mlLPS進行刺激。圖 9E顯示純化的mDC用IOnM抗CLEC_6_Flu HAl或對照Ig-Flu HAl復合物負載2小時。與 2xl06用CFSE標記的純化自體同源⑶4 T細胞共培養7天。用抗⑶4染色細胞，并通過分析CFSE稀釋測量細胞增殖。下部兩個圖片中的細胞用來自大腸桿菌的20ng/ml LPS進行刺激。

圖10顯示來自非人靈長類(食蟹猴)的PBMC用抗CLEC_6mAb和細胞表面標記物的抗體染色，并用FACS分析。發明詳述盡管以下詳細討論本發明的多種實施方案的制備及使用，但是應該理解本發明提供了許多可以在多種特定情況下具體實施的可應用的發明構思。本文討論的特定實施方案僅僅是說明制備和使用本發明的特定方法，而不限定本發明的范圍。為便于理解本發明，許多術語定義如下。本文定義的術語具有與本發明相關的領域中的普通技術人員通常理解的含義。術語諸如"一個"、"一種"、"該"等不意欲僅僅指單數實體，而是包括其中特定實例可以用于例證的總的類別。本文術語用于描述本發明的特定實施方案，但是它們的用法并不限制本發明，除非在權利要求中概述的。Dectin-I基因簇包括凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體(L0X)_1、C型凝集素樣受體(CLEC)-I和2，以及MICL。CLEC-I當轉染到培養細胞中時胞內表達，因此預測需要一些接頭分子用于其表面表達(M. Colonna等,Eur JImmunol 30 (2000),第697-704頁)。然而，在它的跨膜部分不含有陽離子氨基酸。相反，在其胞質部分存在一個酪氨酸殘基，但是通過該酪氨酸的信號傳導效應是未知的。CLEC-2的胞質區包含一個DxYxxL (天冬氨酸-任意-酪氨酸-任意-任意-亮氨酸)基序，并且在轉染細胞表面表達。該基序已知可激勵有效的胞吞作用和ASGPR-I的基底外側表達，并與dectin-Ι的第二類酪氨酸為基礎的基序高度同源。事實上，Syk在其配體蛇毒rhodocytin(aggretin)的誘導下被募集到CLEC-2 的磷酸酪氨酸(K. Suzuki-Inoue等,Blood 107 (2006)，第542-549頁)。該研究確認了在C 型凝集素受體中獨特的單個YxxL序列的存在，其在酪氨酸磷酸化時提供Syk的停泊位點。MICL(CLEC12A)被確定為與 dectin-Ι 和 L0X-1 同源的含 Ι Μ 分子(A. S. Marshall 等，J BiolChem 279 (2004)，第14792-14802頁)。它的表達基本上局限在單核細胞、粒細胞和未成熟DC。功能上，MICL在受到刺激時募集SHP-I和2，并且用含胞質MICL的嵌合受體觀察到 ITIM 依賴性抑制效應(A. S. Marshall 等，JBiol Chem 279(2004)，第 14792-14802 頁)。 然而，最近報道，在MICL連接到未成熟DC上時，觀察到改變的蛋白質酪氨酸磷酸化形式，以及p38MAPK和ERK的絲氨酸磷酸化，而且注意到CCR7的表達和細胞因子的產生而沒有成熟標記物如 CD83、86 和 DC-LAMP 的上調(C. H. Chen 等，Blood 107 (2006)、第 1459-1467 頁)。 確實，如CCR7+共刺激低半成熟表型(costimulation low semi-mature phenotype)被認為代表穩定狀態的遷移DC (L. Ohl等，Imunity21 (2004)，第279-288頁)。雖然還沒有表征，但是 CLEC9A 和 CLEC12B 編碼基因也定位在 dectin-Ι 基因簇中(G. D. Brown，Nat Rev Immunol 6 (2006)，第33-43頁)。CLEC12B的胞質尾區含有Ι Μ，而CLEC9A具有ExYxxL (谷胺酸-任意-酪氨酸-任意-任意-亮氨酸)序列，其可能起到激活基序的作用。這些分子的功能仍然需要進一步研究。Arce 等，Eur. J. Immunol. (2004)鑒定并表征了與小鼠 Mcl/Clecsf8 相關的人 CLEC-6蛋白。人CLEC-6編碼了有215個氨基酸的II型膜糖蛋白，其屬于人鈣依賴性凝集素家族(C型凝集素)。CLEC-6的胞外區具有單個的碳水化合物識別結構域(CRD)。對 CLEC-6瞬時轉染細胞的生化分析表明30kDa的糖蛋白和所述受體的交聯導致迅速內在化， 提示 CLEC-6 是胞內受體(Arce 等，2004)。不同于 CLEC-1、-2、_9A、-12A 和 _12B，CLEC_6 不含有YxxL基序或其它共有的信號傳導基序。還沒有進行研究以表征CLEC-6的生物功能。DC 能夠交叉呈遞蛋白抗原(Rock KL Immunol Rev. 20050ct ;207 :166-83)。在體內，DC通過許多受體來攝取抗原，并呈遞I和II類形式的抗原肽。在本文中，DC凝集素作為模式識別受體有助于抗原的有效攝取以及抗原的交叉呈遞。如本文所用，術語"模塊式rAb載體"用于描述重組抗體系統，該系統被工程化以提供不同的抗原、活化蛋白質或其它抗體以受控的模塊式方式加入單一重組單克隆抗體 (mAb),在本案中,抗CLEC-6單克隆抗體。rAb可以是使用標準雜交瘤技術、重組抗體展示、 人源化單克隆抗體等制備的單克隆抗體。模塊式rAb載體可用于，例如，(通過一種針對例如人樹突細胞受體的內在化受體的原發重組抗體)靶向多個抗原和/或抗原與活化的細胞因子至樹突細胞(DC)。模塊式rAb載體還可以用于以受控且確定的方式首尾相連地連接兩種不同的重組mAb。"模塊式rAb載體"的抗原結合部分可以是一種或多種可變結構域、一種或多種可變結構域與第一恒定結構域，Fab片段、Fab'片段、F(ab)2片段和Fv片段，以及Fabc片段和/或具有部分Fe結構域的Fab片段，同源的模塊式結合部分添加到氨基酸序列和/或與其結合。模塊式rAb載體中使用的抗體可以是任何同型或類別、亞類或者來自任何來源 (動物和/或重組體)。在一個非限制性實施例中，模塊式rAb載體被工程化為具有一種或多種模塊式粘附蛋白-錨定蛋白蛋白質結構域，用于制備在工程化的重組mAb情況下的特異且明確的蛋白質復合物。mAb是包括一種或多種來自mAb的抗原結合結構域的模塊式粘附蛋白-錨定蛋白蛋白質結構域羧基的融合蛋白的一部分。粘附蛋白-錨定蛋白蛋白質結構域甚至可以在翻譯后，例如使用化學交聯劑和/或二硫鍵連接。
本文使用的術語"抗原"指的是可以在該抗原的接受者中啟動體液和/或細胞免疫應答的分子。抗原可以用于本發明的兩種不同情況中作為抗體或rAb的其它抗原識別結構域的目標或者作為分子，該分子通過模塊式rAb載體的錨定蛋白/粘附蛋白-分子補體的一部分的rAb運送到和/或進入細胞或目標。抗原通常是引起疾病的試劑，對于該疾病，疫苗接種可能是有益的治療。當抗原被呈遞在MHC上時，該肽通常是約8到約25個氨基酸。抗原包括任何類型的生物分子，包括，例如，簡單的中間代謝物、糖、脂質和激素以及大分子諸如復合碳水化合物、磷脂、核酸和蛋白質。抗原的常見種類包括但不限于病毒抗原，細菌抗原，真菌抗原，原生動物及其他寄生蟲抗原，腫瘤抗原，自身免疫性疾病、過敏癥和移植排斥中涉及的抗原，及其他各種抗原。模塊式rAb載體能夠運載許多活化劑，例如抗生素、抗感染藥、抗病毒藥、抗腫瘤藥、解熱藥、鎮痛藥、抗炎藥、骨質疏松癥的治療劑、酶、細胞因子、抗凝血藥、多糖、膠原、細胞及兩種或更多前述活化劑的組合。使用本發明遞送的抗生素的實例無限制地包括四環素、氨基糖苷類、青霉素、頭孢菌素、磺胺類藥物、氯霉素琥珀酸鈉、紅霉素、萬古霉素、林可霉素、克林霉素、制霉菌素、兩性霉素B、金剛烷胺、碘苷、對氨基水楊酸、異煙肼、利福平、放線菌素D、光輝霉素、道諾霉素、阿霉素、博來霉素、長春堿、長春新堿、甲基芐肼、咪唑甲酰胺
坐坐寸寸ο使用本發明遞送的抗腫瘤藥的實例無限制地包括阿霉素、柔紅菌素、紫杉醇、氨甲喋呤等等。解熱藥和鎮痛藥的實例包括阿司匹林、美林(Motrin )布洛芬<Ibuprofen )、
萘普生、醋氨酚等等。使用本發明遞送的抗炎藥的實例無限制地包括NSAIDS、阿司匹林、留族化合物、地塞米松、氫化可的松、潑尼松龍、雙氯芬酸鈉等等。使用本發明遞送的治療骨質疏松癥的治療劑和作用于骨和骨骼的其它因子的實例無限制地包括鈣，阿侖膦酸鹽，骨GLa肽，甲狀旁腺激素及其活性片段，組蛋白H4相關骨形成和增殖肽及其突變體、衍生物和類似物。使用本發明遞送的酶和酶輔因子的實例無限制地包括胰酶(pancrease)、L-天冬酰胺酶、透明質酸酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、tPA、鏈激酶、尿激酶、胰酶制劑、膠原酶、 胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、血纖維蛋白溶酶原、鏈激酶、腺苷酸環化酶、過氧化物歧化酶 (SOD)等等。使用本發明遞送的細胞因子的實例無限制地包括白細胞介素，轉化生長因子 (TGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，血小板衍生生長因子(I3DGF)，表皮生長因子(EGF)，結締組織活化肽(CTAP)，成骨因子及這些生長因子的生物活性類似物、片段和衍生物。細胞因子可以是B/T細胞分化因子、B/T細胞生長因子、促有絲分裂細胞因子、趨化細胞因子、集落刺激因子、血管生成因子、IFN- α、IFN- β、IFN- Y、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、 IL9、IL10、ILlU IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18 等、瘦素、肌肉生長抑制素、巨噬細胞刺激蛋白、血小板衍生生長因子、TNF-α、TNF-β、NGF,⑶40L、⑶137L/4-1BBL、人淋巴毒素-β、G-CSF、M-CSF、GM-CSF、PDGF、IL-1 α、ILl-β、IP-10, PF4、GR0、9E3、促紅細胞生成素、內皮抑素、血管抑素、VEGF或其任何片段或組合。其它細胞因子包括轉化生長因子 (TGF)超基因家族成員，包括β轉化生長因子(例如TGF-β I、TGF-β 2、TGF-β 3);骨形態發生蛋白質(例如，BMP-I、ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7、ΒΜΡ-8、ΒΜΡ-9);肝素結合生長因子(例如成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)、胰島素樣生長因子(IGF));抑制素(例如，抑制素A、抑制素B);生長分化因子 (例如，GDF-1);以及活化素(例如，活化素A、活化素B、活化素AB)。使用本發明遞送的生長因子的實例無限制地包括可以從天然或自然的來源諸如從哺乳動物細胞分離的，或可以合成地制備諸如通過重組DNA技術或通過多種化學方法制備的生長因子。此外，可以使用這些因子的類似物、片段或衍生物，只要它們顯示天然分子的至少一些生物活性。例如，可以通過表達位點特異性突變或其它遺傳工程技術改變的基因來制備類似物。使用本發明遞送的抗凝血藥的實例無限制地包括華法林、肝素、水蛭素等等。使用本發明遞送的作用于免疫系統的因子的實例無限制地包括控制炎癥和惡性贅生物的因子以及攻擊感染性微生物的因子，諸如趨化肽和緩激肽。病毒抗原的實例包括但不限于，例如，逆轉錄病毒抗原，諸如來自人免疫缺陷病毒 (HIV)的逆轉錄病毒抗原，諸如gag、Po I和env基因的基因產物，Nef蛋白，逆轉錄酶及其他 HIV元件；肝炎病毒抗原，諸如乙型肝炎病毒的S、M和L蛋白，乙型肝炎病毒和其它肝炎例如甲、乙和丙型肝炎病毒的pre-S抗原，病毒元件諸如丙型肝炎病毒RNA ;流感病毒抗原，諸如血球凝集素和神經氨酸酶及其他流感病毒元件；麻疹病毒抗原，諸如麻疹病毒融合蛋白及其他麻疹病毒元件；風疹病毒抗原，諸如蛋白El和E2及其他風疹病毒元件；輪狀病毒抗原，諸如VP7sc及其他輪狀病毒元件；巨細胞病毒抗原,諸如包膜糖蛋白B及其他巨細胞病毒抗原元件；呼吸道合胞體病毒抗原，諸如RSV融合蛋白、M2蛋白及其他呼吸道合胞體病毒抗原元件；單純性皰疹病毒抗原，諸如立即早期蛋白質、糖蛋白D及其他單純性皰疹病毒抗原元件；水痘帶狀皰疹病毒抗原，諸如gpl、gpll及其他水痘帶狀皰疹病毒抗原元件；日本腦炎病毒抗原，諸如蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A、80% E及其他日本腦炎病毒抗原元件；狂犬病病毒抗原，諸如狂犬病糖蛋白、狂犬病核蛋白及其他狂犬病病毒抗原元件。關于病毒抗原的其他實例，參見Fundamental Virology,第二版,編著Fields, B. N.和Knipe, D. M. (Raven Press, New York,1991)。 可以使用本發明的rAb-DC/DC-抗原疫苗遞送的抗原目標包括編碼抗原諸如病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原的基因。病毒包括微小核糖核酸病毒、冠狀病毒、披蓋病毒、黃病毒、桿狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、呼腸孤病毒、逆轉錄病毒、乳頭瘤病毒、細小病毒、皰疫病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒和海綿狀病毒。其它病毒目標包括流感、單純皰疹病毒I和2、麻疹、登革熱、天花、脊髓灰質炎或HIV。病原體包括錐蟲、絳蟲、蛔蟲、蠕蟲、瘧疾。腫瘤標記物諸如胚胎抗原或前列腺特異性抗原可以以這個方法靶向。其它實例包括HIV env蛋白和乙型肝炎表面抗原。根據本發明用于疫苗接種目的的載體的給予可能要求載體結合的抗原是足夠非免疫原性的以使得轉基因能夠長期表達，對此可期望強烈的免疫應答。在一些情況下，個體的疫苗接種可僅是不經常地需要，諸如每年或每兩年一次，并提供對傳染物的長期免疫保護。本發明用于載體中并最終作為抗原的生物體、過敏原及核酸和氨基酸序列的特定實例可以在美國專利6，541，011中找到，該專利的相關部分引入本文作為參考，尤其是可以用于本發明的匹配生物體和特定序列的表格。用于本文公開的rAb疫苗的細菌抗原包括但不限于，例如，細菌抗原，諸如百日咳毒素、絲狀血球凝集素、百日咳桿菌粘附素、FIM2、FM3、腺苷酸環化酶及其他百日咳細菌抗原元件；白喉細菌抗原，諸如白喉毒素或類毒素及其他白喉細菌抗原元件；破傷風細菌抗原，諸如破傷風毒素或類毒素及其他破傷風細菌抗原元件；鏈球菌細菌抗原，諸如M蛋白及其他鏈球菌細菌抗原元件；革蘭氏陰性桿菌細菌抗原，諸如脂多糖及其他革蘭氏陰性細菌抗原元件；結核分枝桿菌細菌抗原，諸如霉菌酸、熱休克蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌性蛋白、抗原85A及其他分枝桿菌抗原元件；幽門螺桿菌細菌抗原元件；肺炎球菌細菌抗原， 諸如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌莢膜多糖及其他肺炎球菌細菌抗原元件；流感嗜血桿菌細菌抗原，諸如莢膜多糖及其他流感嗜血桿菌細菌抗原元件；炭疽細菌抗原，諸如炭疽保護性抗原及其他炭疽細菌抗原元件；立克次氏體細菌抗原，諸如rompA及其他立克次氏體細菌抗原元件。本文描述的細菌抗原還包括任何其它細菌、分枝桿菌、支原體、立克次體或衣原體抗原。部分或完整的病原體還可以是流感嗜血桿菌；鐮狀瘧原蟲；腦膜炎奈瑟氏球菌； 肺炎鏈球菌；淋病奈瑟氏菌；傷寒沙門氏菌血清型；志賀氏菌；霍亂弧菌；登革熱；腦炎；日本腦炎；萊姆病；鼠疫耶爾森氏菌；西尼羅河病毒；黃熱病；兔熱病；肝炎(病毒性；細菌性);RSV(呼吸道合胞病毒);HPIV I和HPIV 3 ;腺病毒；天花；過敏物和癌癥物質。用于本發明的組合物和方法的真菌抗原包括但不限于，例如，念珠菌屬真菌抗原元件；組織胞漿菌屬真菌抗原，諸如熱休克蛋白60(HSP60)及其他組織胞漿菌屬真菌抗原元件；隱球菌真菌抗原，諸如莢膜多糖及其他隱球菌真菌抗原元件；球孢子菌真菌抗原，諸如小球體抗原及其他球孢子菌真菌抗原元件；以及癬真菌抗原，諸如發癬菌素及其他球孢子囷真囷抗原兀件。原生動物及其他寄生蟲抗原的實例包括但不限于，例如，惡性瘧原蟲抗原，諸如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、環子孢子抗原、配子母細胞/配子表面抗原、紅內期抗原 PH55/RESA及其他瘧原蟲抗原元件；弓形體屬抗原，諸如SAG-I、p30及其他弓形體屬抗原元件；血吸蟲屬抗原，諸如谷胱甘肽-S轉移酶、副肌球蛋白及其他血吸蟲屬抗原元件；利什曼原蟲主要及其他利什曼原蟲抗原，諸如gp63、磷脂聚糖及與其相關的蛋白質及其他利什曼原蟲抗原元件；以及克氏錐蟲抗原，諸如75-77kDa抗原、56kDa抗原及其他錐蟲抗原元件。可以使用本發明的rAb靶向的抗原通常基于許多因素選擇，所述因素包括內在化的可能性、免疫細胞特異性的水平、靶向的免疫細胞種類、免疫細胞成熟的水平和/或活化等等。用于樹突細胞的細胞表面標記物的實例包括但不限于，MHC I類、MHC II類、B7-2、 CD18、CD29、CD31、CD43、CD44、CD45、CD54、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR 和 / 或DECTIN-I等等；而在一些情況下還缺失CD2、CD3、CD4、CD8、⑶14、⑶15、⑶16、CD 19、 ⑶20、⑶56和/或⑶57。抗原呈遞細胞的細胞表面標記物的實例包括但不限于，MHC I類、 MHC II 類、CD40、CD45、B7-1、B7-2、IFN-Y 受體及 IL-2 受體、ICAM-1 和 / 或 Fe Y 受體。用于T細胞的細胞表面標記物的實例包括但不限于，⑶3、⑶4、⑶8、⑶14、⑶20、⑶I lb、⑶16、 CD45 和 HLA-DR。用于遞送的細胞表面上的目標抗原包括通常來源于腫瘤組織細胞的細胞表面、細胞質、細胞核、細胞器等的腫瘤抗原特征性的那些抗原。用于本發明的抗體部分的腫瘤目標的實例無限制地包括血液癌諸如白血病和淋巴瘤；神經腫瘤諸如星形細胞瘤或惡性膠質瘤；黑色素瘤；乳癌；肺癌；頭和頸癌；胃腸腫瘤諸如胃或結腸癌；肝癌；胰腺癌；泌尿生殖器腫瘤如宮頸、子宮、卵巢癌，陰道癌，睪丸癌，前列腺癌或陰莖癌；骨腫瘤；血管腫瘤；或唇、鼻咽、咽和口腔、食道、直腸、膽囊、膽道、喉、肺和支氣管、膀胱、腎、腦及神經系統的其他部分、甲狀腺的癌癥；霍奇金氏病；非霍奇金氏淋巴瘤；多發性骨髓瘤和白血病。可以使用本發明單獨或組合地遞送至免疫細胞用于抗原呈遞的抗原的實例包括腫瘤蛋白，例如突變的癌基因；與腫瘤相關的病毒蛋白；以及腫瘤粘蛋白和糖脂。抗原可以是與腫瘤相關的病毒蛋白，其可以是來自上文指出的各類別病毒的病毒蛋白。某些抗原可以是腫瘤特征性的(一個亞集，是腫瘤前體細胞通常不表達的蛋白質)，或者可以是腫瘤前體細胞中通常表達的蛋白質，但是具有腫瘤特征性的突變。其它抗原包括具有改變的活性或亞細胞分布的正常蛋白質的突變型變體，例如，產生腫瘤抗原的基因突變。腫瘤抗原的特定的非限制性實例包括CEA，前列腺特異性抗原(PSA)，HER-2/ neu,BAGE,GAGE,MAGE 1-4,6 和 12，MUC(粘蛋白)(例如 MUC_1、MUC_2 等)，GM2 和 GD2 神經節苷脂，ras, myc,酪氨酸酶，MART (黑色素瘤抗原)，Pmel 17 (gplOO)，GnT-V內含子V序列 (N-乙酰葡糖氨基轉移酶V內含子V序列)，前列腺Ca psm, PRAME (黑色素瘤抗原)，β -連環蛋白，MUM-I-B (黑色素瘤遍在突變基因產物)，GAGE (黑色素瘤抗原)1，BAGE (黑色素瘤抗原)2-10，C-ERB2 (Her2/neu),EBNA(EB 病毒核抗原)1-6，gp75，人乳頭瘤病毒(HPV) E6 和 E7，p53，肺抗性蛋白(LRP)，Bcl-2，以及Ki-67。此外，免疫原性分子可以是自身免疫性疾病的起始和/或進展中涉及的自身抗原，該自身免疫性疾病的病理學主要是由于相關目標器官、組織或細胞表達的分子特異性的抗體的活性所引起，例如SLE或MG。在這些疾病中， 可能期望將進行中的針對相關自身抗原的抗體介導的(即Th2型)免疫應答指向細胞(即 Thl型)免疫應答。或者，可能期望在沒有感染，但是疑似易感染相關自身免疫性疾病的受試者中通過預防性誘導針對適當的自身抗原的Thl反應來防止針對自身抗原的Th2反應的起始或降低其水平。目標自身抗原無限制地包括(a)對于SLE，Smith蛋白、RNP核糖核蛋白、及SS-A和SS-B蛋白；以及(b)對于MG，乙酰膽堿受體的抗原。在一種或多種類型的自身免疫應答中涉及的其它各種抗原的實例包括，例如，內源性激素，諸如黃體生成素、卵泡刺激素、睪丸激素、生長激素、催乳素及其他激素。在自身免疫疾病、過敏癥和移植排斥中涉及的抗原可被用于本發明的組合物和方法。例如，在任何一種或多種下列自身免疫疾病或障礙中涉及的抗原可被用于本發明糖尿病(diabetes、diabetes mellitus),關節炎(包括類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、骨關節炎、銀屑病關節炎)，多發性硬化，重癥肌無力，系統性紅斑狼瘡，自身免疫性甲狀腺炎，皮炎(包括特應性皮炎和濕疹性皮炎)，銀屑病，斯耶格倫氏綜合征，包括繼發于斯耶格倫氏綜合征的干燥性角膜結膜炎，斑禿，由于節肢動物叮咬反應的過敏反應，克羅恩氏病，口瘡性潰瘍，虹膜炎，結膜炎，角膜結膜炎，潰瘍性結腸炎，哮喘，過敏性哮喘，皮膚紅斑狼瘡，硬皮病，陰道炎，直腸炎，藥疹，麻瘋病逆向反應，麻風結節性紅斑，自身免疫性葡萄膜炎,過敏性腦脊髓炎,急性壞死性出血性腦病,特發性雙側累進性感覺神經性聽力喪失， 再生障礙性貧血，單純性紅細胞貧血，特發性血小板減少，多軟骨炎，韋格納氏肉芽腫病，慢性活動型肝炎，斯-約二氏綜合征，自發性口炎性腹瀉，扁平苔癬，克羅恩氏病，格雷夫斯眼病，結節病，原發性膽汁性肝硬化，后葡萄膜炎和間質性肺纖維化。在自身免疫性疾病中涉及的抗原的實例包括谷氨酸脫羧酶65 (GAD 65)、天然DNA、髓磷脂堿蛋白、髓磷脂蛋白脂質蛋白、乙酰膽堿受體元件、甲狀腺球蛋白和促甲狀腺激素(TSH)受體。在過敏癥中涉及的抗原的實例包括花粉抗原諸如日本柳杉花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麥草花粉抗原，動物來源
12的抗原諸如灰塵螨抗原和貓科抗原，組織相容性抗原和青霉素及其他治療性藥物。在移植排斥中涉及的抗原的實例包括移植入移植物接受者的移植物的抗原性元件，諸如心臟、肺、 肝臟、胰、腎和神經的移植物元件。抗原可以是對治療自身免疫性疾病有用的改變的肽配體。如同本文使用的，術語"表位"指的是包括與位于由病原體DNA或RNA編碼的多種病原體多肽之任何一種中的表位相似的一級、二級或三級結構的肽或蛋白質抗原。相似性的水平通常達到這樣的程度，即針對上述多肽的單克隆或多克隆抗體也會與該肽或蛋白質抗原結合、反應或識別該肽或蛋白質抗原。多種免疫測定方法可以和上述抗體一起使用， 例如蛋白質印跡法、ELISA、RIA等，所有這些都為本領域技術人員所知。適于在疫苗中使用的病原體表位和/或它們的功能等價物的鑒定是本發明的一部分。一旦分離和鑒定，可以容易地獲得功能等價物。例如，可以使用如美國專利號4，554，101中講授的Hopp的方法， 其教導根據親水性從氨基酸序列鑒定和制備表位，該文獻引入本文作為參考。其它一些論文中描述的方法及基于其的軟件程序也可以用于鑒定表位核心序列(參見，例如，Jameson 和Wolf，1988 ；ffolf等，1988 ;美國專利號4，554，101)。然后可以容易地通過運用肽合成或重組技術把這些"表位核心序列"的氨基酸序列引入肽中。可以把包含編碼本發明的抗原的核酸作為活性成分的疫苗組合物制劑制備為注射劑，為液體溶液或懸浮液；也可以制備適于在注射之前溶解或懸浮于液體中的固體形式。 可以把制劑乳化，包封在脂質體中。通常把活性免疫原性成分與藥學上可接受并與活性成分相容的載體混合。術語"藥學上可接受的載體"指的是在給予的受試者中不引起過敏反應或其它副作用的載體。合適的藥學上可接受的載體包括，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合中的一種或多種。此外，如果需要，疫苗可以包含少量的輔助性物質，諸如潤濕或乳化劑、PH緩沖劑和/或增強疫苗效力的佐劑。可能有效的佐劑的實例包括但不限于氫氧化鋁、N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、 N-乙酰-nor-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺、MTP-PE和RIBI，其包含在2 %鯊烯/ Tween 80乳劑中的三種細菌提取成分，單磷酰脂質A、海藻糖二霉菌酸酯和細胞壁骨架 (MPL+TDM+CWS)。佐劑的其它實例包括DDA(溴化二甲基雙十八烷基銨)、弗氏完全和不完全佐劑以及QuilA。此外，免疫調節物質，諸如淋巴因子(例如，IFN-γ、IL-2和IL-12)或合成的IFN-Y誘導物(諸如聚I :C)可以和本文描述的佐劑聯合使用。如本發明所描述的，藥品可以包括具有單一或多拷貝的特定核苷酸序列的裸多核苷酸，該特定核苷酸序列與存在于血漿脂蛋白上的載脂蛋白的特定DNA結合位點結合。多核苷酸可以編碼生物活性肽、反義RNA或核酶并以生理學上可接受的可給藥形式提供。可來自本發明的另一種藥品以生理學上可接受的可給藥形式包括根據本文描述的方法從患者血液或其它來源分離的高度純化的血漿脂蛋白部分和預先結合到純化的脂蛋白部分的、 包含與存在于血漿脂蛋白上的載脂蛋白的特定DNA結合位點結合的單一或多拷貝的特定核苷酸序列的多核苷酸。另一種藥品以生理學上可接受的可給藥形式包括高度純化的血漿脂蛋白部分，該血漿脂蛋白部分包括含有單一或多拷貝的特定DNA結合基序的重組載脂蛋白片段，其預先結合到包括單一或多拷貝的特定核苷酸序列的多核苷酸上。另一種藥品以生理學上可接受的可給藥形式包括高度純化的血漿脂蛋白部分，該血漿脂蛋白部分包括含有單一或多拷貝的特定DNA結合基序的重組載脂蛋白片段，其預先結合到包括單一或多拷貝的特定核苷酸序列的多核苷酸上。給藥劑量在很大程度上取決于治療的受試者的體重和身體健康狀態以及給藥途徑和治療頻率。包括預先結合到高度純化的脂蛋白部分的裸多核苷酸的藥物組合物可以按 I μ g到Img多核苷酸和I μ g到IOOmg蛋白質的量給藥。rAb和rAb復合物給予患者可以遵循用于化學療法給藥的一般方案，如果有的話， 考慮載體的毒性。預料根據需要重復治療周期。還考慮，多種標準治療以及外科干預可以與所述的基因治療聯合施用。在考慮基因治療臨床應用的情況下，需要制備復合物作為適于目的應用的藥物組合物。通常這需要制備基本上不含熱原以及任何其它對人或動物有害的雜質的藥物組合物。通常還期望使用適當的鹽和緩沖液以使復合物穩定和允許復合物被目標細胞攝取。本發明的水性組合物可以包括有效量的化合物，其溶解或分散在藥學上可接受的載體或水介質中。這些組合物也可以稱作接種物。用于藥物活性物質的介質和試劑的使用在本領域中為大家所熟知。任何常規介質或試劑除非與活性成分不相容，否則其在治療組合物中的使用被考慮。補充性活性成分也可以加入組合物中。本發明的組合物可以包括典型的藥物制劑。也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中和在油類中制備分散體。在通常的儲存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物的生長。疾病狀態。取決于要治療的特定疾病，根據本發明的治療組合物的給予可以經任何常規途徑進行，只要經該途徑可達到目標組織以使最大化遞送抗原到位點來達到最大的 (或在一些情況下最小的)免疫應答。通常可以經原位、皮內、皮下、肌內、腹膜內或靜脈內注射給藥。遞送的其它部位包括口、鼻、頰、直腸、陰道或局部的。局部給藥對于皮膚癌的治療可能是特別有益的。所述組合物通常作為包括生理學上可接受的載體、緩沖液或其它賦形劑的藥學上可接受的組合物給藥。本發明的疫苗或治療組合物可以經注射胃腸外例如皮下或肌內給予。適于其它給藥方式的另外的制劑包括栓劑，以及在一些情況下口服制劑或適于分配的制劑如氣霧劑。 對于口服制劑，使用佐劑的T細胞亞型操作，抗原包裝或添加單獨的細胞因子到多種制劑中產生具有最佳化免疫應答的改良口服疫苗。對于栓劑，常規的粘合劑和載體可以包括，例如，聚亞烷基二醇或甘油三脂；這些栓劑可以由包含O. 5%到10%，優選1% -2%范圍內的活性成分的混合物形成。口服制劑包括通常使用的賦形劑，例如藥物級的甘露糖醇、乳糖、 淀粉硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物采取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、 緩釋制劑或散劑的形式并且包含10% -95%的活性成分，優選25-70%。本發明的編碼抗原的核酸可以作為中性的或鹽的形式配制入疫苗或治療組合物中。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽(與肽的游離氨基形成的)，其為與無機酸例如鹽酸或磷酸或與有機酸諸如醋酸、草酸、酒石酸、馬來酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可以源自于無機堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵和有機堿諸如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。疫苗或治療組合物以與給藥制劑相容的方式，以及以預防和/或治療有效的量給予。要給予的量取決于要治療的受試者，包括例如受試者的免疫系統對合成抗體的容量，以及期望保護或治療的程度。合適的劑量范圍為每次疫苗接種具有約幾百微克級的活性成分，范圍為約O. Img到IOOOmg,諸如約Img到300mg的范圍，以及優選約IOmg到50mg的范圍。合適的初始給藥和強化注射方案也是變化的，但是典型的是初始給藥然后是后續的接種或其他給藥。給藥要求的活性成分的精確量取決于醫師的判斷且可能為每個受試者所特有。本領域技術人員清楚，本發明的核酸分子或融合多肽的治療有效量尤其取決于給藥方案，給藥抗原的單位劑量，核酸分子或融合多肽是否和其它治療劑聯合給藥，接受者的免疫狀態和健康狀態，以及特定核酸分子或融合多肽的治療活性。組合物可以以單一劑量方案或以多次劑量方案提供。多次劑量方案中疫苗接種的初始時程可以包括，例如1-10個單獨的劑量，隨后在以維持和或加強免疫應答要求的后續時間間隔給予其它劑量，例如在1-4個月給予第二劑量，以及如果需要在數月之后給予后續劑量。需要每隔1-5年，通常3年的定期加強劑量來維持需要的保護性免疫水平。免疫時程可以繼之以與ESAT6或ST-CF共培養的外周血淋巴細胞(PBL)的體外增殖測定，以及測量致敏淋巴細胞釋放的IFN-Y水平。可以使用常規的標記物諸如放射性同位素、酶、熒光標記物等進行測定。這些技術為本領域技術人員所知并且可以在美國專利號3，791，932、 4，174，384和3，949，064中找到，這些文獻的相關部分通過引用并入本文。模塊式rAb載體和/或結合的rAb載體_(粘附蛋白/錨定蛋白和/或錨定蛋白-粘附蛋白)_抗原復合物(rAb-DC/DC-抗原疫苗)可以以一種或多種"單位劑量"提供，這取決于是否使用核酸載體，最終純化的蛋白質，或使用的最終的疫苗形式。把單位劑量定義為包含計算以產生與該治療組合物給藥即適當的途徑和治療方式相關的期望反應的預定量的治療組合物。給藥量以及特定的途徑和制劑在臨床領域技術人員的范圍之內。 還可以評估待治療的受試者，尤其是，受試者免疫系統的狀態和需要的保護。單位劑量不需要以單一注射給藥，而是可以包括經設定的一段時間內的連續輸注。本發明的單位劑量可以方便地用DNA/kg(或蛋白質/Kg)體重來描述，以約O. 05,0. 10,0. 15,0. 20,0. 25、0. 5、1、 10、50、100、1，000或更多mg/DNA或蛋白質/kg體重的范圍給藥。同樣地，遞送的rAb_DC/ DC-抗原疫苗的量可以從約O. 2到約8. Omg/kg體重變化。因此，在特定實施方案中，可以把 O. 4mg、0. 5mg、0. 8mg> I. Omg> I. 5mg、2. 0mg、2. 5mg、3. 0mg、4. 0mg、5. 0mg、5. 5mg、6. Omg> 6. 5mg、7. Omg和7. 5mg的疫苗遞送到個體體內。給藥的rAb-DC/DC-抗原疫苗的劑量在很大程度上取決于治療的受試者的體重和身體健康狀態以及給藥途徑和治療頻率。包括預先結合到脂質體或病毒遞送載體上的裸多核苷酸的藥物組合物可以按從I μ g到Img多核苷酸到I μ g到IOOmg蛋白質的量給藥。因此，特定組合物可以包括在約I μ g、5 μ g、10 μ g、 20 μ g、30 μ g、40 μ g、50 μ g、60 μ g、70 μ g、80 μ g、100 μ g、150 μ g、200 μ g、250 μ g、500 μ g、 600 μ g、700 μ g、800 μ g、900 μ g或1，000 μ g之間的多核苷酸或蛋白質，該多核苷酸或蛋白質獨立地與 I μ g、5 μ g、10 μ g、20 μ g、3. O μ g、40 μ g、50 μ g、60 μ g、70 μ g、80 μ g、100 μ g、 150 μ g、200 μ g、250 μ g、500 μ g、600 μ g、700 μ g、800 μ g、900 μ g、Img、I. 5mg、5mg、10mg、 20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg 或 IOOmg 載體結合。在體外細胞系統中測試本發明，該體外細胞系統測量Flu抗原靶向的樹突細胞對人Flu特異性T細胞的免疫刺激。本文顯示的結果證明在該系統中單獨使用無效的抗原劑量下這些抗原特異性細胞的特異性擴增。本發明還可以用于制備模塊式rAb載體，該模塊式rAb載體例如是與來自蓖麻毒素、炭疽毒素和葡萄球菌B腸毒素的保護性抗原復合的重組人源化mAb (抗特異性人樹突細胞受體)。該實體的潛在市場是所有軍事人員的疫苗接種和儲備待用給大居民點服藥以應對任何與這些試劑相關的生物威脅的存儲疫苗。本發明對通常用于人和動物兩者的疫苗設計具有廣泛的應用。感興趣的工業包括制藥和生物技術工業。本發明包括包含疫苗的組合物和方法，其特異性靶向(遞送)抗原至抗原呈遞細胞(APC)以引發針對該抗原的有效且廣泛的免疫應答。這些組合物誘發針對衍生所述抗原的活性劑(病原體或癌癥)的保護性或治療性免疫應答。此外，本發明產生了這樣的試劑， 其直接或與其他試劑一起通過它們與在抗原呈遞細胞上表達的CLEC-6受體的特異性結合而具有治療性作用。材料和方法抗體和四聚體-用于DC和B細胞表面染色的抗體(Ab)，包括同型對照 Ab，購自 BD Biosciences(CA)。用于 ELISA 的 Ab 購自 Bethyl (TX)。抗-BLyS 和抗-APRIL 來自 P印roTech (NJ)。四聚體 HLA-A*0201_GILGFVFTL(Flu Ml)和 HLA-A*0201-ELAGIGILTV (Mart-I)購自 Beckman Coulter (CA) 細胞和培養物-來自正常供體的單核細胞(I X 106/ml)在含有GM-CSF (100ng/ml) 和IL-4(50ng/ml) (R&D, CA)的Cellgenics(France)培養液中培養。對于第3天和第6天的DC，分別在第I天和第3天將相同量的細胞因子添加到培養液中。B細胞用陰性分離試劑盒(BD)純化。⑶4和⑶8T細胞用包被抗⑶4或⑶8的磁珠(Milteniy，CA)純化。使用 Percoll 梯度(GEHealthcare UK Ltd,Buckinghamshire,UK)通過密度梯度離心從血沉掠黃層中分離PBMC。對于DC活化，將I X IO5DC在用mAb包被的96孔平板中培養16-18h。在碳酸鹽緩沖液PH 9. 4中的mAb (1-2 μ g/孔)在37°C下培養至少3h。收集培養物上清液， 細胞因子/趨化因子通過Luminex (Biorad, CA)測定。對于基因分析，DC在mAb包被的平板中培養 8h。在一些實驗中，將可溶性 50ng/ml CD40L(R&D，CA)或 50nM CpG(InVivogen, CA)添加到培養液中。在DC和B細胞共培養中，將重懸在含有10% FCS和抗生素的RPMI 1640 (Biosource, CA)中的5 X IO3DC首先在mAb包被的平板中培養至少6h，然后加入I X IO5 用CFSE(Molecular Probes,OR)標記的純化自體B細胞。在一些實驗中,DC用5moi (感染復數)熱滅活流感病毒(A/PR/8H1N1)脈沖攻擊2h，然后與B細胞混合。對于DC和T細胞共培養，將5 X IO3DC與I X IO5純化的自體⑶8T細胞或者混合的同種異體T細胞一起培養。 在培養的最后18h，用I μ Ci/孔3 [H]-胸苷脈沖攻擊同種異體T細胞，然后通過用β -計數儀(WalIac，MN)測定cpm。以5 X IO5PBMC/孔在mAb包被的平板中培養。分別在第10天和第7天，通過用抗⑶8和四聚體染色細胞來測定Mart-I和Flu Ml特異性⑶8T細胞的頻率。將10 μ M的Mart-I肽(ELAGIGILTV)和20ηΜ的含Mart-I肽的重組蛋白(參見下文) 添加到DC和⑶8Τ細胞培養物中。將20ηΜ純化的重組Flu Ml蛋白(參見下文)加到PBMC 培養物中。單克隆抗體-通過常規技術制備小鼠mAb。簡而言之,用含有Ribi佐劑的20 μ g 受體胞外結構域.hIgGFc融合蛋白對6周齡的BALB/c小鼠進行i. p.免疫，然后在第10天和第15天，用20 μ g抗原進行加強免疫。3個月后，在取出脾臟的前3天，再對小鼠加強免疫。或者，在30天至40天的期間內，每3-4天用在Ribi佐劑中的1-10 μ g抗原注射小鼠足墊。在最后加強免疫后的3-4天，收集引流的淋巴結，將來自脾臟或淋巴結細胞的B細胞與SP2/0_Ag 14細胞融合。對雜交瘤上清液進行篩選，與單獨的融合伴侶或與堿性磷酸酶融合的受體胞外結構域(15)相比，分析受體胞外結構域融合蛋白的Ab。然后在FACS中使用用編碼全長受體cDNA的表達質粒瞬時轉染的293F細胞對陽性孔進行篩選。被選的雜交瘤是在CELLine瓶(Intergra, CA)中克隆和擴增的單個細胞。雜交瘤上清液與等體積的 1.5M甘氨酸、3MNaCl、lx PBS, pH 7. 8混合，并用MabSelect樹脂滾動。用結合緩沖液洗滌樹脂，并用O. IM甘氨酸，pH 2. 7洗脫。接著用2M Tris中和，用PBS透析mAb。ELISA-進行夾心ELISA來測量總IgM、IgG和IgA以及flu特異性免疫球蛋白 (Ig)。含有已知量的Ig的標準人血清(Bethyl)和人AB血清分別用作總Ig和flu特異性 Ig的標準。樣本中的Flu特異性Ab滴度，單位被確定為具有相同的光密度的AB血清的稀釋系數。用ELISA試劑盒(BenderMedSystem, CA)測定BAFF和BLyS的量。RNA純化和基因分析-用RNeasy柱(Qiagen)提取總RNA，并用2100 Bioanalyser (Agilent)分析。生物素標記的cRNA祀標用Illumina totalprep標記試劑盒 (Ambion)制備并雜交到Sentrix Human6 BeadChips (46K的轉錄本)上。這些微陣列由附著在3 μ m珠上的50mer寡核苷酸探針組成，所述珠固定在硅片表面上蝕刻的微孔中。用鏈霉抗生物素-Cy3染色后,用Illumina (Beadstation 500X)生產的亞微米分辨掃描儀成像。 用基因表達分析軟件程序GeneSpring, Version 7. I (Agilent)進行數據分析。重組Flu Ml和MART-I蛋白的表達和純化-用PCR擴增流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai (HlNl)Ml基因的0RF，同時加入起始密碼子遠端的Nhe I位點以及終止密碼子遠端的Not I位點。將消化片段克隆到pET-28b(+) (Novagen)中，并在Ml ORF 讀框內插入His6標簽，從而編碼His. Flu Ml蛋白質。編碼插入在Nco I和Nhe I之間的來自熱纖梭菌(C. thermocellum)(未公開)的N端169個殘基粘附蛋白結構域的pET28b (+) 衍生物表達Coh. His。為表達粘附蛋白-Flex-hMART-Ι-肽Α-His，序列GACACCACCGAGGCCC GCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATC GGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCC ATCACACTGGCGGCCG (SEQ ID NO. :1)(編碼 DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAEELAGIGILTVILGGKRT NNSTPTKGEFCRYPSHWRP (SEQ ID NO. :2)-帶陰影的殘基是免疫顯性的HLA-A2-限制性肽，而該肽周圍帶下劃線的殘基來自MART-1)被插入到上述載體的Nhe I位點和Xho I位點之間。 蛋白在大腸桿菌菌株BL21(DE3) (Novagen)或者T7Express (NEB)中表達，這些菌株在37°C 下在LB中培養，以卡那霉素抗性(40 μ g/ml)選擇，并以200轉/分鐘搖瓶直至生長到對數中期，同時添加120mg/L IPTG0 3h后，通過離心收集細胞，保存在_80°C下。將來自每IL發酵物中的大腸桿菌細胞重懸在30ml含有O. Iml蛋白酶抑制劑Cocktail II (Calbiochem, CA)的冰冷的50mM Tris7ImM EDTA pH 8. 0(緩沖液B)中。在冰上超聲處理細胞2次，每次 5分鐘,設定值為18 (Fisher SonicDismembrator 60),其中有5分鐘靜止期,然后在4°C下以 17, OOOr. p. m. (Sorval 1SA-600)離心 20 分鐘。為了純化 His. Flu M1，使 50ml 細胞裂解物上清液部分通過5ml Q瓊脂糖珠，將6. 25ml 160mM Tris、40mM咪唑、4M NaCl pH7. 9添加到Q瓊脂糖流動液中。將其以4ml/分鐘速度上樣到5ml帶有Ni++的HiTrap螯合HP柱上。 結合柱的蛋白質用20mM NaPO4, 300mM NaCl pH7. 6(緩沖液D)洗滌，接著用IOOmM H3COONa pH 4. O再洗滌一次。結合的蛋白質用IOOmM H3COONa pH 4. O洗脫。合并峰值餾分，以4ml/ 分鐘的速度上樣到用IOOmM H3COONa pH 5. 5平衡的5ml HiTrap S柱上，用平衡緩沖液洗滌，接著用在50mM NaPO4 pH 5. 5中的梯度為O-IM的NaCl洗脫。合并用約500mM NaCl洗脫的峰值餾分。為了純化Coh.Flu Ml. His，如上所述將來自2L培養物的細胞裂解。離心后，將2.5ml Triton 29X114加到上清液中，在冰上培育5分鐘。在25°C下再溫育5分鐘后,在25°C下進行離心,從Triton )(114中分離上清液。重復提取操作,將上清液通過5ml 的Q瓊脂糖珠，在Q瓊脂糖流動液中添加6. 25ml 160mM Tris、40mM咪唑、4M NaClpH 7.9。 如上所述，用Ni++螯合的層析柱純化蛋白質，并用在緩沖液D中的0-500mM咪唑洗脫。抗CLEC_6mAb的L和H可變區對應的具體序列-本發明包含如下所示相應于抗 CLEC-6單克隆抗體的具體氨基酸序列，所述抗體是治療性或保護性產品的期望組分(在例如人源化重組抗體情況下)。下面是嵌合小鼠V區(下劃線)-人C區(粗體)重組抗體中的所述序列。rAB-pIRES2[mAnti_hCLEC_6_9B9. 2G12_Kv-V-hIgGK-C]PIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNffYQQKPDGTVKLLIYYTSILQLGVPSRFSGSGSET DYSLTISNLEQEDIATYFCQQGDSLPFTFGSGTKLE IKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO. :3)
rAB-pIRES2[mAnti_hCLEC_6_9B9. 2G12_Hv-LV-hIgG4H-C]QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMSVGfflRQPSGKGLEffLAHIffffN DDKYYNPVLKSRLTISKETSNNQVFLKIASVVSADTATYYCARFYGNCLDYffGQGTTLTVSSAKT
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VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK AS (SEQ
ID NO. 4)。本發明包括V區序列和相關序列的用途，該相關序列由本領域熟練技術人員修飾以例如增強對CLEC-6的親和性和/或被整合到人V區閱讀框序列中以工程化入表達載體中以指導能夠結合到抗原呈遞細胞上的CLEC-6的蛋白形式的表達。此外，本發明中公開的 (或者使用用于本文公開的獨特生物學的相似方法和篩選獲得的)其它mAb可以通過相似的方式(最初通過PCR克隆和測序小鼠雜交瘤V區)以導入編碼相似的重組抗體(rAb)的表達載體中。這種抗CLEC-6V區可進一步由本領域熟練技術人員“人源化”(即鼠-特異性結合序列移植到人V區閱讀框序列中)以使治療性rAb的潛在的免疫反應性最小化。工程化重組抗CLEC-6重組抗體-抗原融合蛋白(rAb.抗原)是有效的體外原型疫苗-可用不同的蛋白編碼序列，如與H鏈編碼序列框內融合，來構建表達載體。例如，抗原如流感病毒HA5、流感病毒Ml、HIV gag或來自癌抗原的免疫顯性肽、或者細胞因子之后可表達為rAb.抗原或rAb.細胞因子融合蛋白，其在本發明的情況下，可具有利用抗CLEC-6V 區序列以將抗原或細胞因子(或毒素)直接帶到具有CLEC-6的抗原呈遞細胞的表面的用處。這可以允許例如抗原的內在化-有時與受體的激活以及之后的啟動治療或保護性作用 (例如通過啟動有效的免疫應答或者殺死靶標細胞)相關。根據該構思的疫苗可以采用如下所示的H鏈載體編碼序列。本發明提供了用于臨床前體外分析的rAb的一個實例rAB-pIRES2[mAnti_hCLEC_6_9B9.2G12(下劃線)_Hv-LV-hIgG4H_C(粗體)-Flex-FluHAl-I-(斜體)6xHis]QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMSVGfflRQPSGKGLEffLAHIffffN DDKYYNPVLKSRLTISKETSNNQVFLKIASVVSADTATYYCARFYGNCLDYffGQGTTLTVSSAKT
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DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKKHNGKLCDLDGVKP
LILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHF
EKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNWWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVL
WGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPND
AINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIG
ECPKYVKSNRLVLA HHHHHH (SEQ ID NO. :6)rAB-pIRES2 [mAnti_hCLEC_6_9B9. 2G12_ (下劃線)Hv-LV-hIgG4H_C (粗體)-錨定蛋白(斜體)]
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMSVGfflRQPSGKGLEffLAHIffffN DDKYYNPVLKSRLTISKETSNNQVFLKIASVVSADTATYYCARFYGNCLDYffGQGTTLTVSSAKT KGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA
PEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQ VYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWOEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSLGK AS NS
PQNEVLYGDVNDDGKVNSTDLTLLKRYVLKAVSTLPSSKAEKNADVNRDGRVNSSDVTILSR
YLIRVIEKLPI (SEQ ID NO. :7)與基于抗CLEC-6重組抗體的原型疫苗的構建相關的方法嵌合小鼠/人mAb的 cDNA克隆和表達-從雜交瘤細胞制備總RNA (RNeasy試劑盒，Qiagen)，并用于cDNA合成和 PCR(SMART RACE試劑盒，BD Biosciences)，采用提供的5’引物和基因特異性3’引物mlgG κ ,5，ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3，(SEQ ID NO. :8)；mlgGλ ,5， ctaggaacagtcagcacgggacaaactcttctccacagtgtgaccttc3， (SEQ ID NO. 9)；mlgGl,5， gtcactggctcagggaaatagcccttgaccaggcatc3’ (SEQ ID NO. :10)；mIgG2a, 5，ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3’ (SEQ ID NO. :11)，以及mIgG2b,5，ggtgctggaggggacagtcactgagctgctcatagtgt3，(SEQ ID NO. :12)。對PCR產物進行克隆(pCR2. ITA試劑盒，Invitrogen)，并通過DNA測序表征。用來自小鼠H和L鏈V區cDNA的序列，采用特異性引物以進行PCR擴增信號肽和V區，同時插入側翼限制性位點以克隆到編碼下游人IgGK或IgG4H區的表達載體中。表達嵌合 mVK -hlgK的載體通過擴增由Xho I和Not I位點側翼的殘基401-731 (gi | 63101937 |)， 并將其插入到pIRES2-DsRed2(BD Biosciences)的Xho I-Not I間隔中來構建。使用PCR 擴增mAb Vk區，從起始密碼子開始，附加Nhe I或Spe I位點，接著是CACC，然后是編碼區(例如，gi I 76779294的殘基126)，并附加Xho I位點。然后將PCR片段克隆到上述載體的Nhe I-Not I間隔中。采用mSLAM前導區(leader)的嵌合mVK-hlgK載體通過將序列 5，ctagttgctggctaatggaccccaaaggctccctttcctggagaatacttctgtttctctccctggct tttgagttgtcgtacggattaattaagggcccactcgag3’ (SEQ ID NO. :13)插入到上述載體的 Nhe I-XhoI間隔中來構建。使用PCR擴增預期成熟N末端密碼子(用SignalP 3. OServer確定)(Bendtsen, Nielsen等,2004)和mV κ區的末端(如上所定義)之間的間隔，并附加 5’tcgtacgga3’。用Bsi WI和Xho I酶切的片段插入到上述載體的相應位點中。對照hlgK 序列相應gi I 49257887 |殘基26-85和gi | 21669402 |殘基67-709。對照hIgG4H載體相應 gi 119684072 |的殘基12-1473，具有S229P和L236E取代，其穩定二硫鍵并消除殘基FcR結合(Reddy, Kinney 等,2000),插入到 pIRES2_DsRed2 載體的 Bgl II 和 Not I 位點之間，同時添加序列5’ gctagctgattaattaa3’ (SEQ ID NO. :14)代替終止密碼子。采用PCR擴增 mAb的VH區，從起始密碼子開始，附加CACC，接著是Bgl II位點，然后是編碼gi 119684072 的殘基473。將PCR片段克隆到上述載體的Bgl II-Apa I間隔中。采用mSLAM前導區的嵌合 mVH_hIgG4 序列的載體通過將下述序列5’ ctagttgctggctaatggaccccaaaggctcccttt cctggagaatacttctgtttctctccctggcttttgagttgtcgtacggattaattaagggccc3>(SEQ ID NO. 15)插入到上述載體的Nhe I-Apa I間隔中來構建。使用PCR擴增預期成熟N末端密碼子和mVH區的末端之間的間隔區,通過附加5，tcgtacgga3，。將用Bsi WI和Apa I酶切的片段插入到上述載體相應的位點中。將不同抗原編碼序列插入到H鏈載體的Nhe I-Pac I-Not I間隔中，該抗原編碼序列兩側為近端Nhe I位點和終止密碼子后的遠端Not I位點。FluHAl-I由近端為5' gcta gcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgtaacaa3'(Nhe I , ^ jpcipA 附蛋白-粘附蛋白接頭殘基)和遠端為5' caccatcaccatcaccattgagcggccgc3'序列(編碼His6、終止密碼子和Not I位點)的甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8/34 (HlNl))紅細胞凝集素 gi I 216931681 殘基 82-1025 (C982T 改變)編碼。Flu HA5-1 由結合有與 Flu HAl-I 相同序列的gi I 50296052甲型流感病毒(A/Viet Nam/1203/2004(H5N1))紅細胞凝集素殘基49-990編碼。Doc由具有近端Nhe I位點和遠端Not I位點的gi | 406711 celD殘基 1923-2150 編碼。PSA 由具有近端序列 5' gctagcgatacaacagaacctgcaacacctacaacacctgta acaacaccgacaacaacacttctagcgc31 (SEQ ID NO. :16) (Nhe I 位點和 cipA 間隔區)和遠端 Not I位點的gi I 34784812 |前列腺特異性抗原殘基101-832編碼。Flu Ml-PEP由5' get agccccattctgagccccctgaccaaaggcattctgggctttgtgtttaccctgaccgtgcccagcgaacgcaaggg tatacttggat tcgttttcacacttacttaagcggccgc3! (SEQ ID NO. :17)編碼。這個以及所有其他肽編碼序列通過具有適于克隆入Nhe I和Not I限制性H鏈載體或Nhe I-Xho I限制性Coh. His載體的末端的互補合成DNA片段的混合物來產生。總是使用優選的人密碼子， 除了限制性位點需要加入或在Cip A間隔區序列中的情況。采用L鏈和H鏈構建體各 2. 5yg和上述的方案，在5ml瞬時轉染物中檢測 rAb表達構建體的生產水平。用抗hlgG ELISA(親和純化的山羊抗人IgG(H+L)，Jackson ImmunoResearch)分析上清液。在該方案的檢測中，分泌的rAb產生不依賴于H鏈和L鏈載體濃度，各DNA濃度在 2倍的范圍內(即系統是DNA飽和的)。本發明包括新的抗人CLEC-6劑的研發、鑒定和應用，以及它們用于揭示作為本發明以及預想的應用的基礎的新生物學。總而言之，開發了新的抗CLEC-6單克隆抗體(mAb)， 并用于揭示與存在于抗原呈遞細胞上的該細胞表面受體相關的先前未知的生物學。該新的生物學高度預期激活該受體的抗CLEC-6活性劑用于各種治療型和保護性應用的用途。下述數據強有力地支持了最初的預期，并闡述了將本文揭示的發現轉化成臨床應用的途徑。針對人CLEC-6高親和力單克隆抗體的開發-制備受體胞外結構域.hIgG(人 IgGlFc)和AP(人胎盤堿性磷酸酶)融合蛋白，以分別用于小鼠免疫和mAb篩選。DCIR 胞外結構域.IgG的表達構建體以前已描述(15)，并利用小鼠SLAM (mSLAM)信號肽引導分泌(16)。制備類似的hDCIR胞外結構域.AP表達載體，用PCR擴增AP殘基 133-1581 (gb IBC009647 |)，并添加近端閱讀框內Xho I位點和遠端TGA終止密碼子和Not I位點。用該Xho I-NotI片段代替上述DCIR胞外結構域.IgG載體中的IgG編碼序列。 在相同的Ig和AP載體系列中的CLEC-6胞外結構域構建體含有編碼CLEC-6(bp317-838， gi I 37577120 I 插入片段。米用 FreeStyleTM 293Expression System(Invitrogen),根據產商操作方案(在I. 3ml Fectin試劑/L轉染物中Img總質粒DNA)制備CLEC-6融合蛋白。為產生rAb，等量的編碼H和L鏈的載體進行共轉染。將轉染細胞培養3天，收集培養物上清液，添加新鮮的培養基繼續培養2天。通過過濾澄清合并的上清液。受體胞外結構域.hlgG 的純化采用HiTrap蛋白A親和層析，用O. IM甘氨酸pH 2. 7洗脫，然后用PBS進行透析。 rAb (之后將描述的重組抗體)用HiTrap MabSelectTM柱作類似地純化。小鼠mAb通過常規細胞融合技術制備。簡而言之，6周齡BALB/c小鼠用20 μ g受體胞外結構域.hlgGFc融合蛋白和Ribi佐劑腹膜內注射免疫，然后在10天和15天后用20 μ g抗原強化免疫。3月后，在取出小鼠脾臟前3天再次強化免疫。或者，在足墊中每隔3-4天用在Ribi佐劑中的 1-10 μ g抗原對小鼠進行注射，持續30-40天。在最后強化免疫后的3-4天，收集引流的淋巴結。采用常規技術將來自脾臟或淋巴結細胞的B細胞與SP2/0-Ag 14細胞(17)融合。與單獨的融合伴侶比較，或與AP融合的受體胞外結構域(15)比較，用ELISA篩選雜交瘤上清液中針對受體胞外結構域融合蛋白的抗體。陽性孔然后使用編碼全長受體cDNA的表達質粒瞬時轉染的293F細胞，用FACS進行篩選。選擇出的雜交瘤是單細胞克隆，適應無血清培養基，并在CELLine瓶(Intergra)中擴增。雜交瘤上清液與等體積的I. 5M甘氨酸，3MNaCl， Ix PBS, pH 7. 8混合，并用MabSelect樹脂混勻。用結合緩沖液洗滌所述樹指，并用O. IM甘氨酸，pH 2. 7洗脫。然后用2M Tris進行中和，用PBS透析mAb。采用直接或間接ELISA鑒定純化的抗CLEC-6單克隆抗體用ELISA檢測雜交瘤克隆的幾種抗CLEC mAb的相對親和性(即CLEC-6. Ig蛋白固定到微量滴定板表面，以一系列劑量滴定檢測抗體結合CLEC-6. Ig的能力(用抗小鼠IgG. HRP結合物試劑進行檢測))。 各圖片分別是mAb對CLEC-6. Ig蛋白的反應性(A和D) ；mAb對hlgGFc蛋白的反應性(B 和E)以及mAb對CLEC-6.堿性磷酸酶融合蛋白的反應性(C和F)。在后種情況中，mAb被滴定板結合(通過抗小鼠IgG試劑)并且結合恒量的在溶液中的CLEC-6. AP。結果表明抗 CLEC-6mAb與CLEC-6胞外結構域具有高度親和性的特異反應。鑒定純化的抗CLEC-6單克隆抗體FACS對表達全長CLEC-6的293細胞通過FACS 進行幾種抗CLEC-6mAb的相對親和性的檢測(即不同濃度的CLEC-6. mAb與表達CLEC-6 的293F細胞一起溫育；洗滌后，用PE衍生的抗小鼠IgG試劑染色；結果是用染色的不表達CLEC-6的293F細胞進行校正的平均熒光強度)。所示的所有4種mAb特異性地染色含 CLEC-6細胞，染色能力的等級次序是12H7 12E3 > 9D5 > 20H8。體內和體外培養DC表達CLEC-6-用FACS測定來自正常供體的PBMC上的CLEC-6 的表達水平。如圖Ia所示，抗原呈遞細胞，包括⑶llc+DC、⑶14+單核細胞以及⑶19+B細胞，表達CLEC-6。然而，⑶3+T細胞不表達CLEC-6。⑶56+NK也不表達CLEC-6 (數據沒有顯示)。還測定體外培養的DC以及純化的血髓樣DC (mDC)和漿細胞樣DC(pDC)上的CLEC-6 表達水平。圖Ib中的數據表明IL-4DC和IFNDC均表達顯著水平的CLEC-6。體外培養的 DC上的CLEC-6表達水平是顯著的，因此可以利用這些細胞進行實驗以揭示CLEC-6的功能。 mDC也表達高水平的CLEC-6，但pDC不表達CLEC-6 (數據沒有顯示)。后一觀察結果尤其重要，因為它們適用于直接從血中分離的細胞，并表明CLEC-6并不是所有DC類型中均存在-因此表明通過CLCE-6的生物學可針對特定的DC類型，而已知這些特定的DC類型具有不同的免疫功能。選擇能夠激活DC的抗CLEC-6mAb-分離了 12種不同的產生小鼠抗人CLEC_6mAb雜交瘤克隆，并檢測所產生的mAb的激活DC的能力，通過測量DC表型和DC分泌的細胞因子和趨化因子來檢測。圖2中的數據顯示可以鑒定激活DC的mAb的實例。在4種抗CLEC-6mAb 中，Ab49可以激活DC，并誘導DC產生顯著量的分泌性IL-6、MIP-la、MCP-l、IP-10以及 TNFa0這些抗CLEC-6mAb也刺激DC產生IL-12p40、IL-Ia以及IL-Ib (數據沒有顯示)。其它3種抗CLEC-6mAb也激活DC，并且各mAb刺激DC產生不同水平的細胞因子和趨化因子。這些數據表明只有某些高親和性的抗CLEC_6mAb才能激活人DC-這是以前不為所知的生物學。這種引發DC分泌細胞因子的能力表明這種抗CLEC-6劑可在體內影響免疫應答。通過CLEC-6信號傳導激活DC細胞表面標記物-DC是決定免疫應答結果的主要免疫細胞，即免疫誘導或耐受依賴于它們是否被激活(18)。本研究中制備的某些抗 CLEC-6mAb可激活在體外培養的IFNDC(圖2)，還檢測了 CLEC-6在激活不同的DC亞型 (IL-4DC和血mDC. IL-4DC)中的作用。IL-4DC用抗CLEC_6mAb進行刺激，圖3a中的數據表明通過CLEC-6的信號傳導激活IL-4DC，導致細胞表面標記物⑶86和HLA-DR的增強表達。 抗CLEC-6mAb也激活體內DC-純化的mDC用抗CLEC-6刺激18小時，然后細胞用抗⑶86、 CD80和HLA-DR染色。如圖3b所示，抗CLEC_6mAb激活mDC而使CD86、CD80和HLA-DR的表達水平增加。圖3A和3B中的數據表明由特異性抗CLEC-6mAb激活DC，包括上調已知在 DC功能中重要的細胞表面分子。通過CLEC-6的信號傳導特異性激活DC基因-同樣地，用抗CLEC_6mAb刺激的DC 的多種基因的表達水平增加，包括共刺激分子以及趨化因子和細胞因子相關基因(圖4)。 與通過其它凝集素，包括DC-ASGPR和L0X-1的信號傳導(數據未顯示)相比，抗CLEC_6mAb 以獨特的方式激活DC，表明通過CLEC-6激活的DC導致獨特的體液和細胞免疫應答。通過CLEC-6的信號激活不同DC亞型中的基因-當用抗CLEC_6mAb刺激時，體外培養的IL-4DC和mDC均產生顯著增加量的分泌性IL-12p40、MCP-l和IL-8。在用抗CLEC_6mAb 刺激的DC的培養物上清液中也觀察到其它細胞因子和趨化因子，包括TNFa、IL-6、MIP-la、 IL-Ia和IL-Ib的水平增加(數據未顯示)。這些細胞因子已知是免疫應答的關鍵介質，而發現特異性抗CLEC-6活性劑激發它們的產生為這些試劑可能的治療性應用提供支持。通過CLEC-6的信號傳導增強通過⑶40的信號傳導-通過CLEC-6的信號與通過 ⑶40的信號協同用于增強DC的激活(圖6)。在⑶40-⑶40L相互作用中CLEC-6結合導致顯著增加的細胞表面CD83的表達(圖6A)和分泌性IL-12p70和IL_12p40的產生(圖 6B) ο其它細胞因子和趨化因子，包括TNFa、IL-6、MCP-l、MIP-la、IL-la和IL-Ib也顯著增加(數據未顯示)。這是重要的，因為CLEC-6可以作為體內DC激活的共刺激分子。總而言之，從圖I到圖6提供的數據證明通過CLEC-6的信號傳導可以激活DC，且CLEC-6作為DC 激活的有效共刺激分子。通過CLEC-6刺激的DC誘導強的體液免疫應答-DC通過提供T-依賴型和T-非依賴型B細胞反應的信號(20-23)并轉移抗原至B細胞(24、25)而在體液免疫應答中起著重要作用。除DC外，經TLR9的信號傳導作為第三級信號是有效B細胞反應所必需的(26、27)。 因此，我們測試了在TLR9配體CpG存在下CLEC-6在DC介導的體液免疫應答中的作用。6 天GM/IL-4DC用抗CLEC-6mAb進行刺激，然后與純化的B細胞共培養。如圖7a所示，與在 CpG存在下用對照mAb刺激的DC相比，用抗CLEC_6mAb激活的DC導致顯著增強的B細胞增殖(經CFSE稀釋測定)和漿細胞分化(⑶38+CD20—細胞群增加)。⑶38+⑶20—B細胞具有漿細胞的典型形態，但不表達⑶138 (數據未顯示)。大多數增殖細胞不表達CCR2、CCR4、CCR6 或CCR7 (數據未顯示)。用ELISA測定產生的總免疫球蛋白(Ig)的量(圖7b)。抗CLEC-6與針對其他凝集素L0X-1和DC-ASGPR的mAb進行比較。與圖7a中的數據一致，B細胞與用抗CLEC-6激活的DC —起培養顯著增加了總IgM、IgG和IgA的產生。用抗L0X-1刺激的DC導致B細胞產生類似水平的IgM、IgG和IgA。但與用抗CLEC-6和抗LOX-ImAb刺激的DC不同，用抗 DC-ASGPRmAb刺激的DC導致IgG和IgA的量顯著降低，表明通過CLEC-6和L0X-1的信號傳導誘導B細胞免疫球蛋白類別轉換。除總Ig外，由L0X-1觸發激活的DC比用對照mAb刺激的DC對產生流感病毒特異性IgM、IgG和IgA更強烈(數據未顯示)。抗CLEC-6激活的DC導致增強的B細胞應答的機制涉及增殖誘導配體(APRIL)。 DC產生的B淋巴細胞刺激蛋白(BLyS，BAFF)和APRIL是重要的分子，DC通過它們能夠直接調控人B細胞的增殖和功能(28-31)。圖7C中的數據表明通過CLEC-6刺激的DC增加胞內 APRIL和分泌性APRIL的表達水平，但不增加表達BLyS (數據未顯示)。測量在混合培養物中的B細胞上的BLyS和APRIL受體的表達水平，但是沒有顯著差異(數據未顯示)。抗CLEC-6mAb直接影響人B細胞-CD19+B細胞表達CLEC-6 (圖I)，表明CLEC-6在B 細胞生物學中的作用。圖8a的數據顯示觸發B細胞上的CLEC-6導致分泌性IL-8和MIP-Ia 的產生增加，表明CLEC-6也對B細胞激活起作用。相對于對照mAb，除IL-8和MIP-Ia外，用抗CLEC-6mAb刺激B細胞時也觀察到IL-6和TNFa輕微增加(數據未顯示)。抗CLEC_6mAb 激活的B細胞分泌的總IgG, IgM和IgA的量增加(圖Sb)。這些觀察結果證明了在上述抗CLEC-6活性劑對B細胞生物學的間接影響(即經 DC發揮作用)的研究中CLEC-6的直接作用。總而言之，這些數據揭示體內給予所述活性劑將刺激抗體的產生的高度可能性-例如作為疫苗的佐劑，或者(如下所示)作為直接載體用于將抗原靶向DC和其它抗原呈遞細胞以引發有效的抗原特異性抗體反應。T細胞應答中的CLEC-6的作用-經CLEC-6刺激的DC表達的共刺激分子的水平增強和產生的細胞因子和趨化因子的量增加(圖1、2和3)，表明CLEC-6在細胞免疫應答以及體液免疫應答中發揮著作用。這通過混合淋巴細胞反應(MLR)來測定。純化的同種異源T 細胞的增殖被用CLEC-6特異性的mAb激活的DC顯著增強(圖9a)。通過CLEC-6激活的DC，在用Flu Ml的HLA-A2抗原表位(圖9B上部的兩個圖片) 以及重組Flu Ml蛋白(圖9B下部的兩個圖片)脈沖刺激DC時，還導致增強的Flu Ml特異性CD8T細胞應答，這表明用抗CLEC-6激活的DC增強了蛋白抗原的交叉呈遞。對于治療性應用例如疫苗，如果通過CLEC-6的信號傳導導致DC對原始⑶8T細胞致敏(priming)和交叉致敏的能力發生改變將是有益的。實際上，圖9C的數據顯示用抗CLEC-6mAb激活的DC 導致Mart-I特異性CD8T細胞致敏的顯著增強(圖9C上部兩個圖片)以及交叉致敏的顯著增強(圖9C下部兩個圖片)。總而言之，圖9A、B和C的數據表明CLEC-6在增強DC功能，引起抗原特異性CD8T細胞應答的增強中起著重要作用。為了確認CLEC-6在疫苗中的潛在用途，抗CLEC_6rAb_抗原復合物與對照rAb-抗原復合物在抗原特異性CD8T細胞應答方面進行比較。用IOnMrAb-Mart-I融合蛋白負載 IFNDC，并且與自體同源⑶8T細胞進行共培養10天。然后用抗⑶8和Mart-I四聚體染色細胞。圖9d的數據顯示抗CLEC-6rAb-抗原相對于對照而言誘導了顯著增強的Mart-I特異性CD8T細胞應答(圖9D上部兩個圖片)。圖9D下部兩個圖片的數據是在20ng/ml LPS(來自大腸桿菌)存在下獲得的數據。為了進一步測試抗CLEC-6rAb用于疫苗應用的用途，mDC用抗CLEC-6-Flu HAl復合體或對照rAb_Flu HAl復合體負載。純化的自體同源⑶4T細胞共培養7天，然后通過CFSE稀釋測定HAl-特異性⑶4T細胞增殖。如圖9E(上部兩個圖片) 所示，抗CLEC-6rAb HAl比對照rAb-HAl誘導了更大的HAl-特異性⑶4T細胞增殖。圖9E 下部兩個圖片中的數據是在20ng/ml LPS (來自大腸桿菌)存在下獲得的數據，該LPS掩蓋了 CLEC-6特異性作用。下面顯示的數據作為采用抗CLEC-6抗原復合物用于疫苗接種目的的臨床前驗證。總之，它們表明這些原型疫苗能夠將抗原導向靶標DC，并且設想與通過結合CLEC-6的相關激活一起以攝取、加工以及呈遞給特異性記憶和原初T細胞，并且引起它們的后續擴增。僅僅這種性質足以引發抗原特異性細胞應答，其是癌癥疫苗(殺死癌癥細胞)或病毒疫苗(清除感染細胞)的關鍵組成部分。而且，HAl-特異性D4的擴增表明抗CLEC-6原型疫苗使T細胞群類型擴增，這是激發抗原-特異性體液(抗體)應答的關鍵。上述數據顯示抗CLEC-6活性劑對Ig類別轉換的作用進一步增強了這些疫苗的高度潛在的獨特特性。非人靈長類動物體內DC表達CLEC-6-為檢測非人靈長類動物(食蟹猴)的血DC 是否對抗人CLEC-6mAb有反應，用抗CLEC_6mAb和針對其它細胞標記物⑶3、⑶14、⑶11c、 ⑶27、⑶56和⑶16的抗體來染色猴PBMC。圖10中的數據表明⑶14和⑶IIc+細胞被抗 LOX-ImAb 染色。然而，CD3+、CD16+、CD27+ 和 CD56+ 細胞不表達 CLEC-6。這些數據是重要的，因為驗證了猴作為本發明預期的各種治療性抗CLEC-6活性劑的效果和安全性的臨床前研究的相關模型。考慮任何本說明書中討論的實施方案可通過本發明的任何方法、試劑盒、試劑或組合物實現，反之亦然。此外，本發明的組合物可用于完成本發明的方法。應理解，本文描述的特定實施方案以例證的方式顯示而不作為本發明的限制。不背離本發明的范圍的前提下，可以在多種實施方案中使用本發明的基本特征。本領域技術人員將識別或僅使用常規實驗能夠確定本文描述的特定操作的許多等價物。這樣的等價物被認為是在本發明的范圍之內并被權利要求書所覆蓋。在說明書中提到的所有出版物和專利申請指示了本發明所屬領域技術人員的技能水平。所有出版物和專利申請均引入本文作為參考，其程度如同各單個出版物或專利申請特別且單獨地指出引入本文作為參考一樣。詞語"一"當和術語"包括"、“包含”、“含有”在權利要求書和/或說明書中一起使用時可以表示"一個(種)"，但是也與"一個(種)或多個(種)"、"至少一個 (種)"和"一個(種)或一個(種)以上"的意思一致。在權利要求書中術語"或"的使用用于表示"和/或"，除非盡管公開的內容支持指代唯一的替換物以及"和/或"的定義，但是權利要求書中明確指出指的是唯一的替換物或替換物是相互排斥的。貫穿本申請，術語"大約"用于表示數值包括裝置、使用來測定該值的方法的固有誤差變異，或存在于研究受試者之中的變化。如本說明書和權利要求書中所用，詞語"包括"(及其任何形式)、"具有"(及其任何形式)、"包含"(及其任何形式)或"含有"(及其任何形式)是包含的或開放的并且不排除另外的、未列舉的元件或方法步驟。
本文使用的術語"或其組合"指在該術語之前列舉的項目的所有排列與組合。例如，"A、B、C或其組合"意指包含A、B、C、AB、AC、BC或ABC至少一個，以及如果在特定的情況下順序是重要的，還包含BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。繼續這個例子，明確包括的是包含一個或多個項目或術語的重復的組合，諸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、 CABABB等等。熟練的技術人員可以理解在任何組合中通常沒有對項目或術語數目的限制， 除非從上下文中是顯然的。按照本申請公開的內容而不需要過度的實驗，能夠制備及實施本文公開及請求保護的所有組合物和/或方法。雖然本發明的組合物和方法已經就優選的實施方案進行了描述，但是本領域技術人員清楚，在不背離本發明的構思、精神及范圍的前提下，可以將變化應用于本文所描述的組合物和/或方法以及本文所描述的方法的步驟中或步驟的序列中。 所有這樣的對本領域技術人員而言顯而易見的類似替代和修改被認為在所附的權利要求書所定義的本發明的精神、范圍及構思的范圍之內。參考文獻I. Figdor, C. G. , Y. van Kooyk, and G. J. Adema. 2002. C-type lectinreceptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol 2 :77-84.2. Pyz, E.，A. S. Marshall, S. Gordon, and G. D. Brown. 2006. C-typeIectin-like receptors on myeloid cells. Ann Med 38 :242-251.3 . Brown. G . D . 2 0 0 6. Dectin-I a signalling non-TLR pattern-recognitionreceptor. Nat Rev Immunol 6 :33-43.4. Gei jtenbeek，T. B.，D. J. Krooshoop, D. A. Blei js，S. J. van Vliet， G. C. van Duijnhoven，V. Grabovsky, R. Alon，C. G. Figdor，and Y. van Kooyk.2000. DC-SIGN-ICAM-2interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunoll 353-357.5. Gei jtenbeek，T. B.，R. Torensma，S. J. van Vliet, G. C. van Dui jnhoven, G. J. Adema, Y. van Kooyk, and C. G. Figdor. 2000. Identification of DC-SIGN，anovel dendritic cell-specific ICAM_3receptor that supports primary immuneresponses. Cell 100 :575-585.6. d f Ostiani, C. F.，G. Del Sero, A. Bacci, C. Montagnoli，A. Spreca,
A.Mencac c i, P. Ricciardi-Castagnoli, and L. Romani. 2000. Dendritic ceIlsdiscriminate between yeasts and hyphae of the fungus Candida albicans. Implications for initiation of T helper cell immunity in vitro and in vivo.J ExpMed 191 :1661-1674.7 . Fradin，C .，D . Poulain，and T . J o u au 1 1. 2000. beta-1， 2_linkedoligomannosides from Candida albicans bind to a 32~kilodalton macrophagemembrane protein homologous to the mammalian lectin galectin-3. Infect Immun68 :4391-4398.8. Cambi，A.，K. Gi jzen，J. M. de Vries, R. Torensma, B. Joosten，G. J. Adema, M. G.Netea，B.J.Kullberg，L.Romani，and C.G.Figdor.2003.TheC-type lectin DC-SIGN(CD209)is an antigen—uptake receptor for Candidaalbicans on dendriticcells.Eur J Immunol 33 :532-538.9. Netea, M. G.，J. W. Meer, I. Verschueren, and B. J. Kullberg. 2002. CD40/CD401igand interactions in the host defense against disseminated Candidaalbicans infection the role of macrophage-derived nitric oxide. Eur J Immunol32 1455-1463.10. Lee，S. J.，S. Evers, D. Roeder，A. F. Par low, J. Risteli，L Risteli，Y. C. Lee， T. Feizi，H. Langen, and M. C. Nussenzweig. 2002. Mannosereceptor—mediated regulation of serum glycoprotein homeostasis. Science295 :1898-1901.11. Maeda，N.，J. Nigou，J. L. Herrmann，M. Jackson，A. Amara, P. H. Lagrange， G.Puzo, B. Gicquel, and 0. Neyrolles.2003.The cell surface receptorDC-SIGN discriminates between Mycobacterium species through seIectiverecognition of the mannose caps on lipoarabinomannan. J Biol Chem278 :5513-5516.12. Tailleux，L，0. Schwartz, J. L Herrmann，E. Pivert，M. Jackson，A. Amara, L.Legres, D.Dreher, L.P.Nicod，J. C. Gluckman, P.H.Lagrange，B.Gicquel, and
0.Neyrolles. 2003. DC-SIGN is the major Mycobacteriumtuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med 197 :121-127.13. Gei jtenbeek，T. B.，S. J. Van Vliet, E. A. Koppel，M. Sanchez-Hemandez, C. M. Vandenbroucke—Grauls，B. Appelmelk. and Y. VanKooyk. 2003. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function. JExp Med 197 :7-17.14. Cooper, A. M.，A. Kipnis，J. Turner，J. Magram，J. Ferrante , and
1.M.Orme.2002. Mice lacking bioactive IL_12can generate protective, antigen-specific cellular responses to mycobacterial infection only if the IL_12p40subunit is present. J Immunol 168 :1322-1327.15. Bates，E. E.，N. Fournier，E. Garcia，J. Valladeau，I. Durand，J. J. Pin， S. M. Zurawski，S. Patel，J. S. Abrams，S. Lebecque，P. Garrone, and S. Saeland. 1999. APCs express DCIR，a novel C-type lectin surface receptor containing animmunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif. J Immunol 163 :1973-1983.16. Bendtsen，J. D.，H. Nielsen，G. von Hei jne，and S. Brunak. 2004. Improved prediction of signal peptides SignalP 3.0. J Mol Biol 340 :783-795.17. Shulman，M.，C. D. Wilde, G. Kohler, M. J. Shulman, N. S. Rees, D. Atefi， J. T. Horney, S. B. Eaton，W. Whaley, J. T. Galambos，H. Hengartner, L. R. Shapiro, and L Zemek. 1978.18. Banchereau, J.，F. Briere，C. Caux，J. Davoust, S. Lebecque，Y. J. Liu,
B.Pulendran, and K.Palucka. 2000. Immunobiology of dendritic cells.AnnuRev Immunol 18 :767-811.19. Jeannin，P.，B. Bottazzi，M. Sironi，A. Doni，M. Rusnati，M. Presta，V. Maina， G. Magistrelli，J. F. Haeuw, G. Hoeffel, N. Thieblemont, N. Corvaia，C. Garlanda, Y. Delneste, and A.Mantovani.2005. Complexity andcomplementarity of outer membrane protein A recognition by cellular andhumoral innate immunityreceptors. Immunity 22 :551-560.20. Wykes, Μ.，and G. MacPherson. 2000. Dendritic cell-B-cellinteraction dendritic cells provide B cells with CD40_independent proliferationsignals and CD40_dependent survival signals. Immunology 100 l-3.21. Balazs，M.，F. Martin, T. Zhou, and J. Kearney. 2002. Blood dendriticcells interact with splenic marginal zone B cells to initiate T—independent immuneresponses. Immunity 17 :341-352.22. Kikuchi，T.，S. Worgall, R. Singh, M. A. Moore, and R. G. Crystal. 2000. Dendritic cells genetically modified to express CD401igand and pulsedwith antigen can initiate antigen-specific humoral immunity independent ofCD4+T cells. Nat Med 6 :1154-1159.23. Dubois，B.，J. M. Bridon, J. Fayette, C. Barthelemy, J. Banchereau,
C.Caux, and F.Briere. 1999. Dendritic cells directly modulate B cell growth anddifferentiation. J Leukoc Biol 66 :224-230.24. Qi, H.，J. G. Egen，A. Y. Huang, and R. N. Germain. 2006. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells.Science 312 :1672-1676.25. Bergtold, A.，D. D. Desai，A. Gavhane, and R. Clynes. 2005. Cellsurface recycling of internalized antigen permits dendritic cell priming of B cells. Immunity 23 :503-514.26. Ruprecht，C. R.，and A. Lanzavecchia. 2006. Toll-like receptorstimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur JImmunol 36 :810-816.27. Bernasconi，N. L，E. Tfaggiai，and A. Lanzavecchia. 2002. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memoryB cells. Science 298 2199-2202.28. Moore, P. A.，0. Belvedere, A. Orr, K. Pier i , D. W. LaFleur, P. Feng,
D.Soppet，M. Charters，R. Gentz，D. Parmelee, Y. Li，0. Galperina，J. Giri，V. Roschke，
B.Nardelli, J. Carrel I, S. Sosnovtseva, W. Greenfield，S. M. Ruben, H. S. Olsen, J. Fikes， and D. M. Hilbert. 1999. BLyS member of the tumor necrosisfactor family and B lymphocyte stimulator. Science 285 :260-263.29. Gross, J. A.，J. Johnston，S. Mudri, R. Enselman，S. R. Dillon，K. Madden，W. Xu, J. Parrish-Novak, D. Foster, C. Lonon-Day, M. Moore, A. Littau，A. Grossman, H. Haugen, K. Foley, H. Blumberg, K. Harrison, W. Kindsvogel，and C. H. Clegg. 2000. TACI and BCMA are receptors for a TNFhomologue implicated in B—cell autoimmune disease. Nature 404 :995_999.30. Craxton, A.，D. Magaletti，E. J. Ryan, and E. A. Clark. 2003. Macrophage-and dendritic cell-dependent regulation of human B~cel!proliferation requires the TNF family ligand BAFF. Blood 101 :4464-4471.
31. MacLennan，I.，and C. Vinuesa. 2002. Dendritic cells，BAFF, andAPRIL innate players in adaptive antibody responses. Immunity 17 :235-238.
權利要求
1.一種用于將髓樣樹突細胞與漿細胞樣樹突細胞分開的方法，所述方法包括利用 CLEC-6表達將表達CLEC-6的髓樣樹突細胞、B細胞或單核細胞與不表達CLEC-6的漿細胞樣樹突細胞分離。
2.表達CLEC-6特異性抗體或其片段的雜交瘤，其中所述CLEC-6特異性抗體或其片段激活抗原呈遞細胞以表達新的表面標記物、分泌一種或多種細胞因子或既表達新的表面標記物又分泌一種或多種細胞因子。
3.根據權利要求2的雜交瘤，其中所述雜交瘤選自克隆12H7、12E3、9D5、20H8及其組合。
4.一種模塊式rAb載體,其包含CLEC-6特異性抗體結合結構域，該結合結構域與一種或多種包含粘附蛋白-錨定蛋白結合對的一半的抗原載體結構域連接。
5.根據權利要求4的rAb，其中所述抗原特異性結合結構域包含抗體的至少一部分。
6.根據權利要求4的rAb，其中所述抗原特異性結合結構域包含與粘附蛋白-錨定蛋白結合對的一半構成融合蛋白的抗體的至少一部分。
7.根據權利要求4的rAb，其還包含與抗原結合的粘附蛋白-錨定蛋白結合對的互補性一半，所述與抗原結合的粘附蛋白-錨定蛋白結合對的互補性一半與所述的模塊式rAb 載體形成復合物。
8.根據權利要求4的rAb，其還包含與抗原構成融合蛋白的粘附蛋白-錨定蛋白結合對的互補性一半。
9.根據權利要求4的rAb，其中所述抗原特異性結構域包括全長抗體、抗體可變區結構域、Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段、Fv片段，以及Fabc片段和/或具有部分Fe結構域的Fab片段。
全文摘要
本發明包括利用新的抗CLEC-6抗體及其片段用于調控免疫細胞的活性的組合物和方法。
文檔編號C12N5/0786GK102586186SQ20121001810
公開日2012年7月18日 申請日期2008年2月22日 優先權日2007年2月23日
發明者G.祖拉夫斯基, J.F.班徹羅, S.吳, S.祖拉夫斯基, 李大鵬 申請人:貝勒研究院