專利名稱：一種脂肪干細胞的獲取方法
技術領域：
本發明涉及一種脂肪干細胞的獲取方法。
背景技術：
脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞。研究發現脂肪干細胞在特定條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、脂肪細胞、神經細胞等，同時具有較低的免疫原性和免疫調節功能，移植同種異基因ADSCs將不會引起強烈的免疫反應和后期的排斥反應，為ADSCs的同源異體移植提供了有利條件。此外，ADSCs來源廣泛，可以通過脂肪抽吸術或脂肪切除術從任何人體內獲得，安全無痛苦，且在體外培養穩定，擴增速度快，不易衰老。因此，ADSCs成為目前研究的新熱點，不論在再生醫學還是基因治療方面都具有重大的應用潛力。為了便于人們有效儲存和使用脂肪干細胞資源，目前我公司建立了脂肪干細胞庫，并取得了 “人脂肪成體干細胞的獲取方法及該干細胞庫的構建方法”的國家專利(專利號:ZL201010120944. 4)。目前脂肪干細胞基本的分離方法是將脂肪組織通過膠原酶I消化孵育lh，消化產物濾網過濾去除未消化組織塊，離心后用DMEM完全培養液重懸細胞，最后接種到細胞培養瓶中培養，4-5天后換新鮮培養液，待細胞長滿后消化傳代。我們在細胞提取培養的過程中發現，傳統的細胞分離方法存在一些問題，比如I 型膠原酶消化細胞不夠徹底，會有很多未消化的組織塊存在；將細胞接種至培養瓶中培養時，PO代和Pl代培養的細胞中也有較多的組織塊和大量雜細胞，導致P2>3代凍存時細胞純度不夠。為克服上述技術的不足，我們在實際操作中改進和優化了脂肪干細胞的分離方法，使得組織消化的更徹底，培養過程中純度更高，從而保證了更為優質的種子細胞來源。

發明內容
本發明的目的在于克服以上分離提取技術的不足，而提供的一種脂肪干細胞的獲取方法，其具有成本低、應用前景廣闊，可為臨床和研究提供大量干細胞資源的特點。本發明提供了一種脂肪干細胞的獲取方法，其采用混合膠原酶對脂肪組織進行消化，所述混合膠原酶由I型膠原酶、II型膠原酶和IV型膠原酶組成。本發明的混合膠原酶的l%(m/v)母液配制方法為100ml D-hank' s溶液中加入 0. 5g I型膠原酶、0.25g II型膠原酶、0.25g IV型膠原酶。使用混合膠原酶消化脂肪組織時的終濃度為0. 15^0. 2%(m/v)。消化得到的脂肪干細胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中培養。脂肪干細胞接種于培養瓶中培養后將原有培養液輕輕吸棄，更換新鮮培養液，繼續培養24h 后再次換新鮮培養液。 優選地，所述脂肪干細胞為人脂肪干細胞。
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在一個特別優選的實施方案中，本發明的脂肪干細胞獲取方法包括下列步驟 (1)配制混合膠原酶對原有膠原酶進行優化，在采用I型膠原酶的基礎上按比例加入
了 II型膠原酶和IV型膠原酶，使得組織消化更為徹底；
1%混合膠原酶配制方法100ml D-hank' s溶液中加入0. 5g I型膠原酶、0. 25g II型膠原酶、0.25g IV型膠原酶。(2)獲取和分離人脂肪組織取人脂肪組織，用PH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復離心沖洗，離心去除多余的水溶液和血液。(3)膠原酶消化加入與所取脂肪組織等體積的0. 3^0.4% (m/v)混合膠原酶 D-Hank' s緩沖液消化(混合膠原酶終濃度為0. 15^0. 2% (m/v))。(4)組織塊過濾將底層細胞用pH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復吹打， 清洗干凈；清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織，離心棄去上清液，獲得干細胞。(5)培養人脂肪干細胞將獲得的干細胞接種于培養瓶，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM的培養液，置于37° C、CO2含量為5%的培養箱中培養。(6)換液培養24h_4 !后將原有培養液輕輕吸棄，更換新鮮高糖DMEM完全培養液，棄去非貼壁細胞，將培養瓶放入37° C孵箱中培養；
繼續培養24h后再次換新鮮培養液，將培養瓶放入37° C孵箱中培養。(7)傳代待細胞生長達到80%融合，在培養瓶中加0. 25%(m/v)胰酶-EDTA進行消化傳代，獲得傳代培養后的人脂肪成體干細胞；待細胞傳至P2代凍存。(8)檢測細胞凍存過程中進行免疫表型檢測、生物學效力檢測、細胞分化能力檢測等以確定其是否達到合格標準。


圖Ia為本發明實施例-1的人脂肪干細胞Ρ(ΓΡ2代培養照片，終濃度為0. 2%(m/v)膠原酶I消化獲取的脂肪干細胞Ρ(ΓΡ2代細胞培養情況，其中A為分離培養后48h，B為Pl代接種后24h，C為P2代接種后24h。圖Ib為本發明實施例-2的人脂肪干細胞Ρ(ΓΡ2代培養照片，終濃度為0. 15%(m/ ν)混合膠原酶消化獲取的脂肪干細胞Ρ(ΓΡ2代細胞培養情況，其中A為分離培養后48h，B 為Pl代接種后24h, C為P2代接種后24h。圖Ic為本發明實施例-3的人脂肪干細胞Ρ(ΓΡ2代培養照片，終濃度為0. 2% (m/v) 混合膠原酶Ρ(ΓΡ2代細胞培養情況，其中A為分離培養后48h，B為Pl代接種后Mh，C為 P2代接種后Mh。圖Id為本發明實施例-4的人脂肪干細胞Ρ(ΓΡ2代培養照片，終濃度為0. 2%混合膠原酶Ρ(ΓΡ2代細胞培養，24h,48h后換液。其中A為分離培養24h換液后細胞形態，B為分離培養4 換液后細胞形態，C為Pl代接種后24h形態，D為P2代接種后24h形態。圖2為本發明實施例-5的人脂肪干細胞向成骨、成脂細胞誘導分化實驗結果，脂肪干細胞向成脂、成骨分化；A是油紅-0染成脂誘導后細胞脂滴，B是茜素紅-S染成骨誘導細胞。圖3為本發明實施例-5的人脂肪干細胞對淋巴細胞增殖抑制實驗結果，不同濃度 ADSC與人外周血單核細胞(hPBMC)共培養(M5 M1表示ADSC PBMC=O. 01 廣1 1)組與不含ADSC的hPBMC單獨培養組(對照組)相比，上清中TNF-α (人腫瘤壞死因子)量顯著低于后者(#:Ρ<0. 01)，說明不同濃度ADSC對激活的外周血淋巴細胞分泌TNF-α均有抑制作用， 且呈正相關。圖4為本發明實施例-5的人脂肪干細胞表型檢測結果，脂肪干細胞表達CD73、 CD105、CD90、CD49d 等，百分率 >95%，不表達 CD19、CD14、CD34、CDllb、CD45 , HLA-DR 等百分率<2%，符合要求，其中FITC是異硫氰酸熒光素，PE是藻紅蛋白。
具體實施例方式為更進一步闡述本發明為達成預定目的所采取的技術手段及功效，以下采用終濃度分別為0. 15%(m/v)、0. 2%(m/v)的混合膠原酶進行脂肪消化，同時用終濃度為0. 2%(m/v) 膠原酶I消化脂肪進行對比，消化后的細胞接種至細胞培養瓶中培養，培養過程中對細胞狀態進行記錄。結合附圖中細胞狀態確定膠原酶消化較佳實施例，同時進一步優化原代細胞第一次換液的時間。在此基礎上對依據本發明提出的人脂肪干細胞的獲取方法進行特征及其功效說明。實施例-1
(1)取50mL脂肪組織，用pH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復離心沖洗，離心去除多余的水溶液和血液；
加入與所取脂肪組織等體積的0. 4% (m/v)膠原酶I進行消化，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化60分鐘，再置于離心機中以2000轉/分鐘的轉速離心5分鐘，去除表層脂肪。 將底層細胞用PH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織；組織過濾時可見有較多成塊未完全消化組織存在； 將濾液以1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，獲得SVF細胞。(2)將獲得的SVF細胞加入IOmL含10%胎牛血清的高糖DMEM的培養液，接種于 T-75培養瓶，置于37°C、5%0)2飽和濕度的培養箱中培養。(3)培養4 后將原有培養液輕輕吸棄，更換含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液， 棄去非貼壁細胞，將培養瓶放入37° C孵箱中培養；
待細胞生長達到80%融合，在培養瓶中加0. 25% (m/v)胰酶-EDTA進行消化，并按 2 X IOVcm2接種至75cm2細胞培養瓶中，獲得傳代培養后的人脂肪成體干細胞。(4)對Ρ(ΓΡ2代細胞進行連續觀察，如圖Ia所示，PO代細胞在4 后可見有細胞開始貼壁生長，但雜細胞非常多，通過換液、消化傳代后，Pl代雜細胞有所減少，傳代至P2 后雜細胞進一步減少，但仍可見少量雜細胞存在。實施例-2
(1)取50mL脂肪組織，用pH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復離心沖洗，離心去除多余的水溶液和血液；
加入與所取脂肪組織等體積的0.3% (m/v)混合膠原酶進行消化，在37°C溫度條件下均勻震蕩消化60分鐘，再置于離心機中以2000轉/分鐘的轉速離心5分鐘，去除表層脂肪。 將底層細胞用PH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織；組織過濾時可見有較多成塊未完全消化組織存在；將濾液以1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，獲得SVF細胞。(2)將獲得的SVF細胞加入IOmL含10%胎牛血清的高糖DMEM的培養液，接種于 T-75培養瓶，置于37°C、5%0)2飽和濕度的培養箱中培養。(3)培養4 后將原有培養液輕輕吸棄，更換含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液， 棄去非貼壁細胞，將培養瓶放入37° C孵箱中培養；
待細胞生長達到80%融合，在培養瓶中加0. 25%(m/v)胰酶-EDTA進行消化，并按按 2 X IOVcm2接種至75cm2細胞培養瓶中，獲得傳代培養后的人脂肪成體干細胞。(4)對Ρ(ΓΡ2代細胞進行連續觀察，如圖Ib所示，PO代細胞在接種時大量雜細胞存在，培養4 后可見有細胞開始貼壁生長，Pl代雜細胞減少，傳代至P2后雜細胞進一步減少，但仍可見雜細胞存在。實施例-3
(1)取50mL脂肪組織，用pH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復離心沖洗，離心去除多余的水溶液和血液；
加入與所取脂肪組織等體積的0.4% (m/v)混合膠原酶進行消化，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化60分鐘，再置于離心機中以2000轉/分鐘的轉速離心5分鐘，去除表層脂肪。將底層細胞用PH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織；組織過濾時可見未完全消化組織塊較實施例-1 和-2中明顯減少；
將濾液以1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清液，獲得SVF細胞。(2)將獲得的SVF細胞加入IOmL含10%胎牛血清的高糖DMEM的培養液，接種于 T-75培養瓶，置于37°C、5%0)2飽和濕度的培養箱中培養。(3)培養4 后將原有培養液輕輕吸棄，更換含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液， 棄去非貼壁細胞，將培養瓶放入37° C孵箱中培養；
待細胞生長達到80%融合，在培養瓶中加0. 25%(m/v)胰酶-EDTA進行消化，并按按 2 X IOVcm2接種至75cm2細胞培養瓶中，獲得傳代培養后的人脂肪成體干細胞。(4)對Ρ(ΓΡ2代細胞進行連續觀察，如圖Ic所示，PO代細胞培養24h后即可見有細胞開始貼壁生長，在4 換液后觀察細胞發現雜細胞明顯少于實施例-1和_2，Pl代雜細胞進一步減少，傳代至P2后細胞呈梭形，狀態良好，生長較為一致，而雜細胞基本不存在。實施例-4
(1)取50mL脂肪組織，用pH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復離心沖洗，離心去除多余的水溶液和血液；
加入與所取脂肪組織等體積的0.4% (m/v)混合膠原酶進行消化，在37° C溫度條件下均勻震蕩消化60分鐘，再置于離心機中以2000轉/分鐘的轉速離心5分鐘，去除表層脂肪。 將底層細胞用PH值為7. 2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織，將濾液以1000轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清液， 獲得SVF細胞。(2)將獲得的SVF細胞加入IOmL含10%胎牛血清的高糖DMEM的培養液，接種于 T-75培養瓶，置于37°C、5%0)2飽和濕度的培養箱中培養。(3)培養24h后觀察細胞狀態，可見有少量細胞貼壁，將原有培養液輕輕吸棄，更換含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液，棄去非貼壁細胞，將培養瓶放入37° C孵箱中培養； 繼續培養24h后，對培養的脂肪干細胞再次更換含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液， 棄去非貼壁細胞，將培養瓶放入37° C孵箱中培養；
待細胞生長達到80%融合，在培養瓶中加0. 25%(m/v)胰酶-EDTA進行消化，并按按 2 X IOVcm2接種至75cm2細胞培養瓶中，獲得傳代培養后的人脂肪成體干細胞。(4)對Ρ(ΓΡ2代細胞進行連續觀察，如圖Id所示，細胞原代培養24h后即有少量細胞貼壁，此時更換培養液，將未貼壁細胞去除，繼續培養24h后再次更換新鮮培養液后，雜細胞進一步減少，細胞傳代至Pl代后基本沒有雜細胞存在，培養至P2代后細胞純度進一步提尚。這種方法雖然會去除掉部分未貼壁的脂肪干細胞，但同時雜細胞和組織塊很快的被洗掉，細胞在新鮮的環境中可以更快的自我更新，得到的細胞純度更高。實施例-5
用終濃度為0. 2%(m/v)的混合膠原酶消化脂肪并分離獲取脂肪干細胞后，進行免疫表型檢測、生物學效力檢測、細胞分化能力檢測等以確定其是否達到合格標準。其中細胞分化能力檢測是指在誘導培養條件下，脂肪干細胞向脂肪、成骨分化能力的檢測，判定標準為向脂肪和成骨細胞分化成功的視為合格細胞。如圖2所示，脂肪干細胞分別加入成脂、成骨誘導分化培養液誘導分化14天后，分別用油紅-0染色、茜素紅-S染色，染色結果表明，成脂誘導后的細胞產生了脂滴并且經油紅-0染色后脂滴為紅色，說明脂肪干細胞向成脂誘導成功；而成骨誘導后的細胞產生了大量鈣鹽并且可用茜素紅-S染為紅色，說明脂肪干細胞向成骨誘導成功。其中生物學效力檢測是將脂肪干細胞與PBMC (外周血單個核細胞)共培養，加入 PHA (英文全稱phytohaemagglutinin，中文全稱植物血凝素)對PBMC進行刺激，在培養結束后對培養液上清中的TNF- α值進行ELISA定量檢測，判定標準為人脂肪成體干細胞與 PBMC共培養后，能顯著抑制后者增殖(Ρ<0. 05)。結果發現不同濃度ADSC與人外周血單核細胞(hPBMC)共培養(M5 Ml表示ADSC:PBMC=0. 01 Γ 1)組與不含ADSC的hPBMC單獨培養組(對照組)相比，上清中TNF-α量顯著低于后者(Ρ<0. 01)，說明不同濃度ADSC對激活的外周血淋巴細胞分泌TNF-α均有抑制作用，且與脂肪干細胞的濃度呈正相關，說明脂肪干細胞免疫調節作用符合標準，如圖3所示。免疫表型檢測是用直接免疫熒光法檢測，所用抗體為小鼠抗人的單克隆抗體 CD29、CD44、CD73、CD90、CD14、CD31、CD45、CD49d、HLA-DR。細胞用 D-Hank，s 液洗后加入抗體，在4° C溫度下孵育30分鐘，再用D-Hank’ s洗細胞兩次，用500 μ 1 D-Hank' s吹打、混勻細胞，之后用流式細胞儀檢測。檢測結果如圖4所示，脂肪成體干細胞中的CD19、CD34、 CD14、CDllb, CD45 及 HLA-DR 呈陰性，小于 2% ； CD73、CD90、CD105 和 CD49d 呈陽性，大于 95%，該脂肪干細胞視為合格細胞。在說明書中，本發明已參照其特定的實施例做了描述，但是，很顯然仍可以做出各種修改和變換而不背離本發明的精神和范圍。因此，本發明的說明書和附圖被認為是說明性的而非限制性的。
權利要求
1.一種脂肪干細胞獲取方法，其特征在于采用混合膠原酶對脂肪組織進行消化，所述混合膠原酶由I型膠原酶、II型膠原酶和IV型膠原酶組成。
2.根據權利要求1的脂肪干細胞獲取方法，所述混合膠原酶的l%(m/v)母液配制方法為:100ml D-hank，s溶液中加入0. 5g I型膠原酶、0. 25g II型膠原酶、0. 25g IV型膠原酶。
3.根據權利要求1的脂肪干細胞獲取方法，使用所述混合膠原酶消化脂肪組織時的終濃度為 0. 15^0. 2%(m/v)。
4.根據權利要求3的脂肪干細胞獲取方法，使用所述混合膠原酶消化脂肪組織時的終濃度為 0. 2%(m/v)。
5.根據權利要求1的脂肪干細胞獲取方法，在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液中培養消化得到的脂肪干細胞。
6.根據權利要求5的脂肪干細胞獲取方法，消化得到的脂肪干細胞接種于培養瓶中培養Μ-4 !后將原有培養液輕輕吸棄，更換新鮮培養液，繼續培養24h后再次換新鮮培養液。
7.根據權利要求6的脂肪干細胞獲取方法，消化得到的脂肪干細胞接種于培養瓶中培養24h后將原有培養液輕輕吸棄，更換新鮮培養液，繼續培養24h后再次換新鮮培養液。
8.根據權利要求1-7中任一項的脂肪干細胞獲取方法，所述脂肪干細胞為人脂肪干細胞。
9.根據權利要求8的脂肪干細胞獲取方法，包括(1)配制l%(m/v)混合膠原酶母液100mlD-hank' s溶液中加入0. 5g I型膠原酶、 0. 25g II型膠原酶、0. 25g IV型膠原酶；(2)獲取和分離人脂肪組織取人脂肪組織，用pH值為7.2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復離心沖洗，離心去除多余的水溶液和血液；(3)膠原酶消化加入與所取脂肪組織等體積的0.4%(m/v)混合膠原酶消化，再置于離心機中以2000轉/分鐘的轉速離心5分鐘，去除表層脂肪；(4)組織塊過濾將底層細胞用pH值為7.2-7. 4的D-Hank’ s平衡鹽液反復吹打，清洗干凈；清洗下來的液體經100目篩網過濾，去除未消化組織，將濾液以1000轉/分鐘離心 5分鐘，棄去上清液，獲得干細胞；(5)培養人脂肪干細胞將獲得的干細胞按2XIOVcm2接種于培養瓶，加入IOmL含10% 胎牛血清的高糖DMEM培養液，置于37° C、CO2含量為5%的培養箱中培養；(6)換液培養24h后將原有培養液輕輕吸棄，更換新鮮的含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養液，棄去非貼壁細胞，將培養瓶放入37° C孵箱中培養；繼續培養24h后再次換新鮮培養液，將培養瓶放入37° C孵箱中培養；(7)傳代待細胞生長達到80%融合，在培養瓶中加0.25%(m/v)胰酶-EDTA進行消化， 并按1 :3傳代，獲得傳代培養后的人脂肪干細胞；待細胞傳至P2代凍存；(8)檢測細胞凍存過程中進行免疫表型檢測、細胞計數及活力測定、生物學效力檢測、 細胞分化能力檢測等以確定其是否達到合格標準。
全文摘要
本發明涉及一種脂肪干細胞的獲取方法。具體的，本發明采用混合膠原酶對脂肪組織進行消化，在培養液中培養消化得到的脂肪干細胞，經過換液，傳代，檢測制得合格脂肪干細胞。本發明克服了傳統的細胞分離方法中存在的膠原酶消化細胞不夠徹底，細胞純度不夠的問題，改進和優化了脂肪干細胞的分離方法，使得組織消化的更徹底，培養過程中純度更高，從而保證了更為優質的種子細胞來源。
文檔編號C12N5/0775GK102443566SQ201210018269
公開日2012年5月9日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者劉廣洋, 劉擁軍, 朱德琳, 王斌, 聶艷波 申請人:天津和澤干細胞科技有限公司