專利名稱：一種鉛離子熒光dna探針及鉛離子濃度的熒光測定方法
技術領域：
本發明涉及鉛離子濃度的檢測分析領域，具體地涉及一種鉛離子熒光DNA探針及利用該探針進行鉛離子濃度的熒光測定方法。
背景技術：
鉛是分布廣、有蓄積性的環境污染物。鉛是性質穩定的重金屬元素，其對人體極為有害，尤其嚴重危害兒童的健康。隨著工業和其他行業的迅速發展，人們對鉛的大量使用， 使得鉛污染已經從職業環境向水、大氣、食品、醫藥等人們的日常生活環境擴展。在環境檢測、口岸快速篩查、消費品安全、廢水處理和工業過程中，對鉛的靈敏、快速的篩查和準確的定量十分重要。目前，在分析實驗室內對于痕量鉛的主要測試方法集中在原子吸光光譜法(洪穎，陳國松，張紅漫等，《廣東微量元素科學》2004, 11 (4) 62飛6 ； 許財欽，《中國公共衛生》，2005，21 (3)，361)，ICP-AES法(陳文新，方奕文，光譜實驗室， 2003(20) 4，495 497)，ICP-MS法(陳虹，張素珍，吳小均，《安徽農業科學》，2010，38 (23)， 12509 12513)。這些方法對鉛的檢出限在10 μ g/kg lmg/kg，而這些方法均需要大型設備和燃燒氣，成本較高，不易微型化。雙硫腙測定鉛具有較好穩定性和高靈敏度(測定范圍在1(Γ 400mg/kg)，已建立了成熟的國標方法(GB7470-87《水質鉛的測定雙硫腙分光光度法》)，但由于試驗過程中涉及有毒有機溶劑，該方法不利于環境保護。另一方面，納米生物技術的快速發展為檢測技術變革提供了新的方向。隨著能夠與金屬離子選擇性結合的離子載體紛紛出現，人們在此基礎上發展了多種重金屬離子的檢測方法。脫氧核酶(DNAzyme)是一種具有使RNA水解作用的單鏈DNA分子，又稱為催化性 DNA，它可以通過體外篩選(SELEX)技術得到。部分脫氧核酶的活性與某些金屬離子密切相關，且脫氧核酶具有易于合成和修飾、高穩定性和環境友好等優點(Lu Y. Chem. Eur. J. [J],2002，8(20) :4588^4596 ；Li J.,Zheng W.，Kwon A. H.，et al.. Nucleic Acids Res. [J]，2000，28 (2) :481-488 ；Xiao Y. ,Rowe A. A.，Plaxco K. ff. . J. Am. Chem. Soc [J]， 2007,129(2) :262-263)。其中Yi Lu小組利用對Pb2+敏感的17E脫氧核酶(DNAzyme)分子開發了一系列檢測Pb2+的熒光、比色傳感器(Li J. et. al, J. Am. Chem. Soc. , 2000， 122:10466-10467 ；Liu J. et. al. , Anal. Chem. , 2003，75: 6666-6667)。這些傳感器多是在17E脫氧核酶及其底物鏈上標記熒光信號分子及猝滅分子，利用Pb2+切割后脫氧核酶構象變化導致的熒光信號變化來定量Pb2+濃度。這些傳感器由于需要進行DNA鏈的雙標記，甚至三標記，成本較高。同時，由于在室溫下，切割后的底物鏈可能重新與17E脫氧核酶雜交，為了獲得較低的熒光背景，試驗操作溫度須嚴格控制在4°C以下，實驗條件較嚴格。 因此，現有利用17E脫氧核酶及底物鏈多標記探針檢測Pb2+的方法存在著操作難點多、不易推廣等不足。本發明解決了現有技術利用17E脫氧核酶檢測Pb2+的方法中的實驗條件要求高、 需對DNA探針多次標記、操作復雜等缺點，提出一種由17E脫氧核酶及FAM熒光素標記的底物鏈組成的單標記、高靈敏的新型鉛離子熒光DNA探針，以納米金膠作為FAM熒光素的猝滅劑，進行鉛離子濃度的熒光檢測。本發明不僅保持了 17E脫氧核酶的高靈敏度、高特異性， 還大大降低了鉛離子的檢測成本。

發明內容
本發明提出了一種鉛離子熒光DNA探針，包括17E脫氧核酶以及底物鏈雜交組成的雙鏈，所述底物鏈的5’末端以FAM熒光素修飾；
其中，所述17E脫氧核酶的序列為
5' -CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT _3’ ；
所述底物鏈的序列為
5，-FAM-ACTCACTATMGGAAGAGATG-3，；
所述FAM熒光素如以下結構式(II)所示。
權利要求
1.一種鉛離子熒光DNA探針，其特征在于，所述探針包括17E脫氧核酶以及底物鏈雜交組成的雙鏈，所述底物鏈的5’末端以FAM熒光素修飾；其中，所述17E脫氧核酶的序列為5' -CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT _3’ ；所述底物鏈的序列為5，-FAM-ACTCACTAIMGGAAGAGATG-3，；所述FAM熒光素如以下結構式(II)所示。
2.如權利要求I所述的鉛離子熒光DNA探針，其特征在于，所述探針如以下結構式(I) 所示。
3.一種利用如權利要求I所述鉛離子熒光DNA探針進行鉛離子濃度的熒光測定方法， 其特征在于，以17E脫氧核酶及底物鏈雜交組成的鉛離子熒光DNA探針作為鉛離子的識別元件，以底物鏈5’末端修飾的FAM熒光素作為熒光信號分子，以納米金膠作為熒光猝滅劑， 利用FAM熒光素與所述鉛離子熒光DNA探針單雙鏈結合時的熒光信號差異，對待測樣品中的鉛離子濃度進行熒光檢測。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述鉛離子熒光DNA探針是由所述17E脫氧核酶及底物鏈在95°C、15min的退火條件下雜交組成。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，在鉛離子存在的情況下，所述鉛離子熒光 DNA探針中的底物鏈的第九及第十個核苷酸之間打開，所述鉛離子熒光DNA探針解鏈。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述解鏈后的鉛離子熒光DNA探針中的底物鏈與所述納米金膠結合，所述FAM熒光素猝滅。
7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述熒光檢測在激發波長為494nm，發射波長520nm處進行。
8.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述鉛離子濃度的檢出限為2nmol/L。
全文摘要
本發明涉及鉛離子濃度的檢測分析領域，公開了一種鉛離子熒光DNA探針，包括17E脫氧核酶以及底物鏈雜交組成的雙鏈，底物鏈末端以FAM熒光素修飾。本發明還公開了一種利用探針進行鉛離子濃度的熒光測定方法，以鉛離子熒光DNA探針作為鉛離子的識別元件，以底物鏈末端修飾的FAM熒光素作為熒光信號分子，以納米金膠作為熒光猝滅劑，利用FAM熒光素與鉛離子熒光DNA探針單雙鏈結合時的熒光信號差異，對待測樣品中的鉛離子濃度進行熒光檢測。本發明方法靈敏度高，對鉛離子選擇性好，且具有成本低、操作方便、檢測快速等優點。
文檔編號C12Q1/68GK102586429SQ20121001833
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者衛碧文, 吳繼魁, 張俊玲, 林莉, 高歡 申請人:上海出入境檢驗檢疫局機電產品檢測技術中心