專利名稱：一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及疫苗技術領域，尤其是涉及一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法。
背景技術：
甲魚，學名中華鱉，歷來是藥膳 及滋補佳品。20世紀80年代，溫室養殖的興起，使原本奉為稀珍的甲魚的產量大幅提高，隨之而起的是疾病的肆意流行。傳統防治多使用抗生素和化學藥品進行，對于病毒性疾病，非但沒有起到治療效果，反而對甲魚造成毒害，污染環境，并導致藥物殘留，打擊消費者的消費信心。2007年以來，在浙江地區，尤以杭州、寧波地區甲魚生態養殖場暴發一種系統性敗血癥，主要癥狀為系統性出血性敗血，研究人員經流行病學調查、組織切片與超薄切片觀察和人工感染試驗等研究，確定一種新型球狀病毒是其原發性致病因子，該新型球狀病毒為甲魚系統性敗血癥球狀病毒。甲魚系統性敗血癥球狀病毒式從發病甲魚中分離的一種新型病毒。該病毒能導致甲魚系統性出血、敗血，來勢猛，7-10天內累積死亡率可達90-100%。疫苗是指為了預防、控制傳染病的發生、流行，用于人體預防接種的疫苗類預防性生物制品，其能有效控制疾病的發生，使用后沒有污染，無任何殘留，能有效地保護生態環境和食用產品的品質，并且長期使用也不會產生耐藥性。疫苗主要包括滅活疫苗以及亞單位疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗，其中滅活疫苗指選用免疫原性好的細菌、病毒、立克次體、螺次體等，經人工培養，再用物理或化學方法將其殺滅制成。此種疫苗失去繁殖能力，但保留免疫原性。死疫苗進入人體后不能生長繁殖，對機體刺激時間短，要獲得持久免疫力需多次重復接種。相對于亞單位疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗，滅活疫苗以其便于制作、簡單易行等優點具有無可替代的優勢。針對甲魚系統性敗血癥疾病，目前國內外均無相關防治方法的研究，更沒有關于甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法的相關研究報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種利用本發明人從患系統性敗血癥的甲魚體內分離得到的甲魚系統性敗血癥球狀病毒作為生產疫苗的病毒株，制備出安全、有效、免疫力強的甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗并提供其制備方法，該滅活疫苗的制備方法簡單、易行。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為
I、病毒特性
甲魚系統性敗血癥球狀病毒(Soft-shelled turtle systemic septicemiasphericalvirus, STSSSV)，毒株為 pl015 株，保藏號為 CGMCC No. 5378，于 2011 年 10 月 21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。該病毒無囊膜，直徑23-40nm，細胞核內、外均可增殖。
2、一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗，本疫苗含有保藏號為CGMCCNo. 5378的經滅活的甲魚系統性敗血癥球狀病毒。3、一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗的制備方法，步驟如下
(1)病毒純化
取患系統性敗血癥的甲魚，將發病甲魚內臟組織剪碎，按質量體積比Ig :10ml比例將甲魚內臟加入到TNE緩沖液中 ，于4 °C下，8000r/min離心20min后，取上清液于4 °C下，35000g離心Ih ;然后取底部核心部位白色沉淀，重懸于5mlTNE緩沖液中，4°C冰箱冰浴過夜，將過夜的沉淀輕輕吹打均勻，于4°C下，8000r/min離心20min，取上清液于4°C下，35000g離心lh，得到的白色沉淀即為純化病毒；
(2)抗原滅活
將步驟(I)得到的純化病毒用0. 9%無菌生理鹽水稀釋到病毒蛋白終濃度0. 5-lmg/ml,然后加入終體積0. 5%的福爾馬林于37°C恒溫水浴鍋滅活24h，每2-3h進行振蕩混勻，得到無菌的滅活病毒；
(3)乳化
將步驟(2)得到的滅活病毒與弗式完全佐劑按體積比I :1混合后，于4°C間歇振蕩乳化6-8h得到甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗。所述的TNE 緩沖液配制方法Tris 3. 0289g、NaCl 6. 00g、EDTA 0. 9306g 補足雙蒸水至500ml，調整pH 7. 6，高壓滅菌，4°C冷藏備用。與現有技術相比，本發明的優點在于本發明一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法，具有如下優點
(I)本發明首次提出了甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法，本發明是唯一的、高效的生產工藝，本身具有領先性。(2)按本發明生產甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗對生產條件要求不高，便于操作和實施，制備過程簡單、易實現。(3)自然條件下，病毒主要通過甲魚吞食病鱉和帶毒池水浸泡而傳染，達不到本發明效力檢驗中注射的病毒劑量(注射劑量按體重< 100g，注射0. Iml ；100g <體重< 200g，注射0. 2ml ;200g<體重< 300g，注射0. 3ml ;體重> 300g，注射0. 4ml)，故自然環境中的保護率可能更高。綜上所述，本發明一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗具有安全、有效、免疫力強，該滅活疫苗的制備方法簡單、易行。甲魚系統性敗血癥球狀病毒(Soft-shelledturtle systemic septicemiasphericalvirus, STSSSV)，毒株為 P1015 株，保藏號為 CGMCC No. 5378，于 2011 年 10 月 21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。


圖I為純化的甲魚系統性敗血癥球狀病毒粒子的電鏡觀察結果。
具體實施例方式以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
一、具體實施例
本發明一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗，本疫苗含有保藏號為CGMCCNo. 5378的經滅活的甲魚系統性敗血癥球狀病毒。該甲魚系統性敗血癥球狀病毒(Soft-shelled turtle systemic septicemia spherical virus, STSSSV),毒株為 P1015株，保藏號為CGMCC No. 5378，于2011年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。該病毒無囊膜，直徑23-40nm，細胞核內、外均可增殖。具體制備方法如下
(1)病毒純化
取患系統性敗血癥的甲魚，將發病甲魚內臟組織剪碎，按質量體積比Ig IOml比例將甲魚內臟加入到TNE緩沖液中，于4°C下，8000r/min離心20min后，取上清液于4°C下，35000g離心Ih ;然后取底部核心部位白色沉淀，重懸于5mlTNE緩沖液中，4°C冰箱冰浴過夜，將過夜的沉淀輕輕吹打均勻，于4°C下，8000r/min離心20min，取上清液于4°C下，35000g離心lh，得到的白色沉淀即為純化病毒；
(2)抗原滅活
將步驟(I)得到的純化病毒用0. 9%無菌生理鹽水稀釋到病毒蛋白終濃度0. 5mg/ml,然后加入終體積0. 5%的福爾馬林于37°C恒溫水浴鍋滅活24h，每2-3h進行振蕩混勻得到無菌的滅活病毒；
(3)乳化
將滅活病毒與弗式完全佐劑按體積比I : I混合后，于4°C間歇振蕩乳化6h得到甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗。TNE 緩沖液配制方法Tris 3. 0289g、NaCl 6. 00g、EDTA 0. 9306g 補足雙蒸水至500ml，調整pH 7. 6，高壓滅菌，4°C冷藏備用。除上述實施例外，病毒蛋白終濃度還可以為lmg/ml或0. 75mg/ml ;歇振蕩乳化時間還可以為7h或者8h。二、檢驗方法
I、成品檢驗充分乳化的滅活疫苗為乳白色油乳劑，取一滴滴于水上5min不散開，4°C放置15日不分層。2、無菌檢測取IOOul甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗，涂布牛肉瓊脂平板，28°C倒置培養24-48h，觀察有無細菌生長。無菌生長為合格。3、安全檢測
a.取滅活疫苗接種雞胚，每胚0.15ml，34°C培養10天，觀察雞胚死亡情況；
b.取滅活疫苗接種甲魚,每只0.3ml，觀察甲魚10天內死亡情況；
雞胚接種3-10d和甲魚接種15d內無死亡為合格。4、效力檢驗
(I)免疫
不同規格甲魚由后腿肌注疫苗，另設對照組按體重注射相應劑量生理鹽水。充分乳化后對甲魚進行免疫，注射劑量按體重〈100g，注射0. Iml ；100g〈體重〈200g，注射0. 2ml ；200g〈體重〈300g，注射0. 3ml ;體重〉300g，注射0. 4ml。另設對照組，按體重注射相應劑量生理鹽水。
(2)由甲魚發病組織 粗提高濃度病毒液作為攻毒液
a.取患系統性敗血癥典型發病癥狀的甲魚解剖，取內臟放入埋在冰里的燒杯；
b.將內臟組織剪碎按m/v=lg10ml加入TM緩沖液勻漿，于4°C，6000g條件下，離心20min,取上清液；
c.將離心所得沉淀用少量TM緩沖液重懸，再次勻漿，于4°C，6000g離心20min，合并兩次離心所得上清液；
d.將合并所得上清液經孔徑0.45 y m的濾膜過濾除去破碎組織后，再將濾液經0. 22um針式濾頭過濾除菌，按體積每毫升濾液加入1000IU青霉素和1000 u g鏈霉素；
e.放入4°C冰箱冰浴過夜即得攻毒液。(3)取已免疫15天的甲魚進行攻毒實驗，實驗組注射經上述方法制備的攻毒液，劑量同免疫劑量，每組50只，觀察第3-10日內死亡情況。結果注射生理鹽水的對照組攻毒后死亡率均為100%;注射滅活疫苗組，用攻毒液注射攻毒后死亡率均低于50%，結果表明疫苗對甲魚有明顯保護效力。滿足以上四種檢驗要求視為合格。
權利要求
1.一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗，其特征在于本疫苗含有保藏號為CGMCC No. 5378的經滅活的甲魚系統性敗血癥球狀病毒。
2.一種根據權利要求I所述的甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于步驟如下 (1)病毒純化 取患系統性敗血癥的甲魚，將發病甲魚內臟組織剪碎，按質量體積比Ig :10ml比例將甲魚內臟加入到TNE緩沖液中，于4 °C下，8000r/min離心20min后，取上清液于4 °C下，35000g離心Ih ;然后取底部核心部位白色沉淀，重懸于5mlTNE緩沖液中，4°C冰箱冰浴過夜，將過夜的沉淀輕輕吹打均勻，于4°C下，8000r/min離心20min，取上清液于4°C下，35000g離心lh，得到的白色沉淀即為純化病毒； (2)抗原滅活 將步驟(I)得到的純化病毒用O. 9%無菌生理鹽水稀釋到病毒蛋白終濃度O. 5-lmg/ml,然后加入終體積O. 5%的福爾馬林于37°C恒溫水浴鍋滅活24h，每2-3h進行振蕩混勻，得到無菌的滅活病毒； (3)乳化 將步驟(2)得到的滅活病毒與弗式完全佐劑按體積比I :1混合后，于4°C間歇振蕩乳化6-8h得到甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗。
3.根據權利要求2所述的一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述的TNE緩沖液配制方法Tris 3. 0289g、NaCl 6. 00g、EDTA O. 9306g補足雙蒸水至500ml，調整pH 7. 6，高壓滅菌，4°C冷藏備用。
全文摘要
本發明公開了一種甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗及其制備方法，特點是該疫苗含有保藏號為CGMCCNo.5378的經滅活的甲魚系統性敗血癥球狀病毒，其制備方法包括將病甲魚內臟剪碎加入TNE緩沖液中，離心取上清液，再離心取白色沉淀，重懸于TNE緩沖液中，將沉淀離心后，取上清液再離心得到白色沉淀即純化病毒的步驟，將純化病毒用無菌生理鹽水稀釋到病毒蛋白終濃度0.5-1mg/ml，然后加入終體積0.5%的福爾馬林恒溫水浴鍋滅活的步驟；將滅活病毒與弗式完全佐劑按體積比11完全乳化得到滅活疫苗的步驟，優點是首次提出了甲魚系統性敗血癥球狀病毒滅活疫苗具有安全、有效、免疫力強，其制備方法簡單、易行。
文檔編號C12N7/06GK102626514SQ20121001872
公開日2012年8月8日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者劉聯國, 周永強, 彭嬌, 李登峰 申請人:寧波大學