專利名稱：白菜tt8基因家族及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及甘藍型油菜(Brassica napus)及其親本物種白菜(Brassica rapa)和甘藍(Brassica οleracea) ΤΤ8 (TRANSPARENT TESTA 8，透明種皮8 ；又稱bHLH42，BASIC HELIX-LOOP-HELIX 42，堿性螺旋-環-螺旋42)基因家族及其應用。
背景技術：
十字花科(Brassicaceae)的蕓薹屬(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和觀賞植物品種，為人類提供營養價值豐富的食用油、蔬菜和觀賞植物，并為畜牧業提供飼料，具有重要的經濟價值。在蕓薹屬物種中，異源四倍體物種甘藍型油菜是由2個二倍體物種白菜和甘藍通過種間雜交后再加倍而形成的。甘藍型油菜是世界第二大油料作物，在全世界廣泛種植，栽培面積和產量僅次于大豆。白菜和甘藍也是重要的油料、蔬菜和觀賞作物。對甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍功能基因的比較基因組學研究將為揭示它們之間的遺傳進化關系提供理論基礎，并為蕓薹屬作物的性狀改良提供應用基礎。籽粒顏色是甘藍型油菜的重要性狀之一。甘藍型油菜黃籽品系具有種皮薄、皮殼率低、粗纖維含量低、含油量高、餅粕蛋白含量高等優點，與黑籽品系相比，餅粕的經濟價值和油的品質都有所提高。雖然白菜和甘藍中均存在表型穩定的天然黃籽基因型，但自然界中不存在天然的甘藍型油菜黃籽基因型。已有的甘藍型油菜黃籽材料主要通過遠緣雜交等方式而創造，存在黃籽率和黃籽度不高，表型不穩定，易受環境影響而變異，選育效率低，育種周期長，負相關性狀難以克服等缺點，遠遠不能滿足生產要求。因此，獲得穩定遺傳的甘藍型油菜黃籽性狀成為甘藍型油菜育種的重要目標。長期以來，全世界眾多研究者對該性狀進行了廣泛研究，但到目前為止對于黃籽性狀形成的分子機理仍不清楚，更沒有通過轉基因分子育種創造黃籽性狀的任何報道。類黃酮是植物的重要次生代謝物質，具有多種生物學功能，其中花青素苷(anthocyanin, AN)、原花青素(proanthocyanidin，PA)和黃酮醇是十字花科等植物器官表面著色的重要成分。蕓薹屬和擬南芥(Arabidopsis thaliana)同屬十字花科，具有較近的親緣關系。在擬南芥種皮中，原花青素主要積累在內種皮和有顏色的合點區域，是種皮色素的核心成分。擬南芥TT8 (AtTT8)基因編碼一個bHLH型正調控轉錄因子(AtbHLH42)，在積累有花青素苷和原花青素的細胞中被誘導表達，TT2、TT8和TTGl形成一個轉錄因子復合物，調控黃酮合成途徑的“晚期”結構基因如DFR、BAN等的表達，從而調控原花青素、花青素苷、種皮粘液的積累。擬南芥《8突變體的種子顯示透明種皮即黃籽性狀。因此，在蕓薹屬中對TT8基因進行同源克隆和功能鑒定，是篩選甘藍型油菜黃籽位點的重要途徑，也可用于蕓薹屬物種中與原花青素、花青素苷、種皮粘液相關性狀的分子育種。
蕓薹屬和擬南芥起源于同一祖先，約在1700 1800萬年前發生分離，蕓薹族植物發生了基因組水平的三倍化，即蕓薹屬基本種白菜(AA組，5^Mbp)、甘藍(CC組，696Mbp)和黑芥(BB組，632Mbp)等的基因組約相當于擬南芥基因組(157Mbp)的3倍，而甘藍型油菜(AACC組，1132Mbp)的基因組相當于甘藍和白菜兩個基因組之和，約相當于擬南芥基因組的6倍，也就是說，在擬南芥中為單拷貝的基因在甘藍和白菜中可能分別有3個對應的拷貝，而在甘藍型油菜中可能有6個拷貝。目前，TT8基因在甘藍型油菜、白菜、甘藍等蕓薹屬物種中的成員數、蛋白特征、進化關系、表達的組織特異性、黃籽等性狀的關系以及轉基因分子育種等都未見報道。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT8基因家族。為達到上述目的，本發明采用cDNA末端快速擴增(RACE)技術，分別克隆了甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT8基因家族成員的全長cDNA和對應的基因組序列，并對其進行了系統分析。結果顯示所述白菜TT8 (BrTTO)基因家族包括以下2個成員BrTT8_l基因和BrTT8_2基因；所述BrTT8-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrTT8_2基因的全長cDNA序列如 SEQ ID No. 4 所示；所述甘藍TT8(BoTT8)基因家族包括以下2個成員BoTT8_l基因和BoTT8_2基因；所述BoTT8-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 6所示，BoTT8_2基因的全長cDNA序列如 SEQ ID No. 8 所示；所述甘藍型油菜ΤΤ8(&ιΤΤ8)基因家族包括以下2個成員ΒηΤΤ8-1基因和ΒηΤΤ8-2基因；所述ΒηΤΤ8-1基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 10所示，BnTT8_2基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 12所示。進一步，所述BrTT8-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 1所示，BrTT8_2基因的基因組序列如SEQ ID No. 3所示；所述BoTT8-l基因的基因組序列如SEQ ID No. 5所示，BoTT8-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 7所示；所述&ιΤΤ8_1基因的基因組序列如SEQID No. 9所示，ΒηΤΤ8-2基因的基因組序列如SEQ IDNo. 11所示。上述3個物種的6條ΤΤ8基因之間具有很高的同源性，基因組序列的一致性為69. 7 99. 9%，mRNA —致性為85. 8% 99. 8%，編碼區的一致性為93. 2% 99. 9%，其中BnTT8-l基因與ΒοΤΤ8-1基因的一致性高達99. 9%，ΒηΤΤ8_2基因與BrTT8_l基因的一致性高達99. 1%。它們與AtTTS基因也具有很高的同源性，基因組序列的一致性為44. 2 52. 4%,mRNA的一致性為78. 0% 82. 1%，編碼區的一致性為80. 83. 6%。6個TT8基因編碼的蛋白之間具有很高的同源性，一致性為89. 6% 100%，相似性為90. 6% 100%，其中&1TT8-1蛋白與BoTT8-l蛋白的相似性和一致性均為99. 6%，BnTT8_2蛋白與BrTT8-l蛋白的相似性和一致性均為100%。它們與AtTT8蛋白也具有很高的同源性，一致性為71. 5 % 77. 2 %，相似性為77. 4 % 84. 1 %。系統進化分析表明，AtTT8先與BrTT8_2聚在一起，BnTT8-2先與BrTT8-l聚在一起，然后這兩個小類聚在一起；BnTT8_l與ΒοΤΤ8_1聚在一起，ΒοΤΤ8-2雖然單獨，但與ΒηΤΤ8-1與ΒοΤΤ8_1也很近。從基因結構、蛋白結構、核酸序列同源性、氨基酸序列同源性、系統進化等方面均表明，BnTTS-I基因起源于BoTTS-I基因，BnTT8-2基因起源于BrTT8-l基因，且這6個TT8基因都是AtTT8基因的垂直同源基因。TT8基因家族主要在白菜、甘藍、甘藍型油菜的生殖器官中表達，以發育中的種子表達最高，并隨著種子的發育進程而逐漸下降。此外，TT8基因家族在白菜和甘藍型油菜的黑、黃籽材料間的總體表達存在著較明顯的差異，且不同的基因成員表現出不同的黑、黃籽差異表達模式，而TT8基因家族總體及其成員在甘藍黑、黃籽材料中的表達無明顯差異，說明TT8基因家族表達下調與白菜和甘藍型油菜的黃籽性狀有關，而TT8基因家族不是甘藍黃籽性狀的重要原因。基于上述結果，利用本發明的BrTT8、BoTT8、&iTT8基因家族中的任一種或多種基因或基因截短片段，可以構建TT8基因重組表達載體和轉化體，用于TT8基因的正義表達、反義抑制、RNA干擾等。本發明的目的之二在于提供所述甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT8基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應用。進一步，所述甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT8基因家族在甘藍型油菜黃籽性狀的分子育種中的應用。為達到上述目的，本發明將BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族成員的全長cDNA序列分別插入PCAMBIA2301G載體中(插入片段由CaMV35S啟動子驅動，由Nos終止子終止轉錄)，構建了正義植物表達載體 pBrTT8-l、pBrTT8-2、pBoTT8-2 和 pBnTT8_l，用 Flower Dip法將它們轉化擬南芥突變體(種子為透明種皮)，通過卡那霉素(Kan)抗性篩選得到了 BnTTS-I轉基因植株，該轉基因植株T2代種子的種皮顏色恢復了野生型的深褐色，證明甘藍型油菜等蕓薹屬的TT8基因具有與AtTTS基因對應的功能。因此，本發明的TT8基因家族在種子性狀的分子育種中具有應用價值。當然，將甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT8基因家族中任一種基因的基因組序列或全長cDNA序列正義插入pCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子與Nos終止子之間，都可以構建正義植物表達載體。同時，本發明還選取&1TT8-1基因的部分編碼序列(如SEQ ID No. 10中第837 1653位堿基所示)，將其反義片段插入pCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子和Nos終止子之間，構建了反義植物表達載體pBnTTSA，并通過農桿菌介導的下胚軸侵染法轉入甘藍型油菜典型黑籽品種湘油15號，得到了抑制內源&1TT8基因表達的轉基因株系。研究發現，⑶S染色檢測呈陽性的反義轉基因植株收獲種子的顏色與對照相比有明顯變淺，雖然沒有達到標準的金黃色性狀，但已比較接近黃籽。反義&1TT8轉基因后代植株的主體形態特征與非轉基因的對照植株無明顯差異，但是轉基因種子普遍飽滿度下降，粒形偏離球形，千粒重由對照的3. 15g下降到2. 54go說明&1TT8基因除了參與調控種皮色素合成以外，還參與調控了一些其它種子性狀如種子大小，可用于蕓薹屬作物種皮顏色、種子大小等種子性狀的分子育種。當然，將甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT8基因家族中任一種基因的全部或部分編碼序列反義插入PCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子與Nos終止子之間，都可以構建反義植物表達載體。本發明的有益效果在于本發明提供了 TT8基因在甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍中的成員數、各成員的全長cDNA序列和基因組序列、編碼蛋白特征、進化關系、表達的組織特異性等，并確認了 TT8基因家族表達下調與白菜和甘藍型油菜的黃籽性狀有關，由此本發明提供了 TT8基因在蕓薹屬作物種子性狀改良特別是甘藍型油菜黃籽性狀的分子育種中的應用，應用前景好。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中圖1為BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族5，cDNA末端擴增的瓊脂糖凝膠電泳。圖2為BrTT8、BoTT8、BnTT8基因家族3，cDNA末端擴增的瓊脂糖凝膠電泳。圖3為BrTT8、B0TT8和BnTT8基因家族成員全長cDNA的擴增，其中A和B分別為 FBnTT816+RBrTT819、FBnTT816+RBrTT821 擴增 BrTT8 基因家族全長 cDNA ；C 和 D 分別為 FBoTT8+RBoTT8-l、FBoTT8+RBoTT8_2 擴增 BoTT8 基因家族全長 cDNA ；L· 禾口 F 分別為FBoTT8+RBoTT8-l、FBrTT8+RBrTT8-l 擴增 BnTT8 基因家族全長 cDNA。圖4為BnTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成員及AtTT8基因mRNA的核苷酸序列比對。圖5為&iTT8、BrTT8、BoTT8基因家族成員及AtTT8基因的聚類分析。圖6為&iTT8、BrTT8和BoTT8基因家族成員的Southern雜交鑒定。圖7為&iTT8、BrTT8和BoTT8基因家族蛋白及AtTT8蛋白的氨基酸序列比對。圖8為&iTT8、BrTT8和BoTT8基因家族編碼蛋白與其它植物TT8蛋白的聚類分析。圖9為RT-PCR檢測&iTT8、BrTT8和BoTT8基因家族總體和各成員在不同組織器官中的表達。圖10為RT-PCR檢測&iTT8、BrTT8和BoTT8基因家族總體和各成員在黑、黃籽近
等基因系生殖器官中的表達。圖11為pCAMBIA2301G正義植物表達載體中T-DNA區域中的表達元件。圖12為ρΒηΤΤ8-1載體轉化擬南芥tt8突變體T1代轉化子的篩選，其中A為T1代植株的Kan抗性篩選，B為Kan抗性的T1代植株苗期，C為Kan抗性的T1代植株初花期。圖13為Kan抗性的擬南芥T1代植株的⑶S染色鑒定。圖14為擬南芥野生型種子(A)、BnTTS-I轉化擬南芥tt8突變體后的T2代種子(B)、擬南芥tt8突變體種子(C)。圖15為反義植物表達載體p&iTT8A構建過程中的電泳檢測，其中A為從pMD18_T上酶切BnTT8A，B為從pCAMBIA2301G上切下1. 9kb的GUS基因，C為pBnTT8A的檢測。圖16為反義植物表達載體ρΒηΤΤ8Α的T-DNA區段圖。圖17為Ρ&1ΤΤ8Α轉化湘油15后的部分再生抗Kan植株。圖18為p&iTTSA轉化湘油15后(右)與對照(左)的葉片⑶S染色。圖19為p&iTTSA轉化湘油15后各T3株系的種子(CK為非轉基因對照)。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
優選實施例采用的植物材料白菜材料均來自于白菜型油菜亞種(B.rapa ssp.oleifera)，包括典型黑籽系06K130和黃籽系06K1M ；甘藍材料均來自于羽衣甘藍變種(B. oleracea var. acephala)，包括典型黑籽系06K158和黃籽系06K165 ；甘藍型油菜材料包括典型黑籽系5B、黑籽品種湘油15號、籽色近等基因系黑籽系Ll和黃籽系L2，均由重慶市油菜工程技術研究中心提供，大田常規種植。優選實施例采用的主要試劑及試劑盒Taq DNA聚合酶(5U/ μ 1)購自上海生工生物工程技術服務有限公司；DNA分子量標準λ-HindIII digest DNA Marker和DL_2000pIusMarker、LATaq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)、pMD18_T 載體試劑盒、RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3· O 購自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內切酶EcoRI、EcoRV等購自美國New EnglandBiolabs公司；限制性內切酶Mel等、T4DNA連接酶(lOU/μ 1)購自立陶宛MBI Fermentas公司；MS 基本培養基(Murashige&Skoog medium, including vitamins)購自荷蘭 DuchefaBiochemie公司；柱式小量植物組織RNA抽提試劑盒、小量膠回收試劑盒、小量質粒抽提試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，GeneRacer Kit購自美國hvitrogen公司，Southern雜交與檢測的試劑(盒)、尼龍膜購自德國Roche公司。優選實施例采用的主要儀器PTC-200Programmable Thermal Controller PCR儀購自美國MJ Research公司，UVP HL-2000雜交紫外交鏈儀購自美國UVP公司，其它均為分子生物與學基因工程常用儀器。—、甘藍型油菜及其親本物種白菜和甘藍TT16基因家族的克隆1、白菜、甘藍和甘藍型油菜基因組總DNA的提取取大田常規條件下栽培的甘藍型油菜5B、白菜06K130和甘藍06K158的嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組總DNA，采用電泳法和分光光度法評價核酸樣品的質量和濃度。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，提取的3個物種的基因組總DNA完整性好，平均分子量均大于λ -HindIII DNA Marker的231Λ條帶，RNA消化比較完全，經分光光度法檢測純度較高，可以直接用于PCR擴增及Southern雜交。2、白菜、甘藍和甘藍型油菜各器官總RNA的提取取大田常規條件下栽培的白菜06K130、甘藍06K158、甘藍型油菜5B的根(Ro)、下胚軸(Hy)、子葉(Co)、莖(St)、葉(Le)、蕾(Bu)、花(Fl)、開花后10天的種子(IOD)、開花后20天的種子(20D)、開花后30天的種子(30D)和莢果皮(SP)共11個器官；以及大田常規條件下栽培的白菜06K1M、甘藍06K165，甘藍型油菜Ll和L2的蕾、花以及發育不同階段的種子(甘藍型油菜取10D、20D和30D的種子；白菜和甘藍取IOD和30D的種子)等主要生殖器官；采用柱式小量植物總RNA抽提試劑盒提取各器官總RNA，采用電泳法和分光光度法評價核酸樣品的質量和濃度。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，提取的3個物種的總RNA特征條帶清晰，且無明顯RNA降解和DNA污染，經分光光度法檢測純度較高，能夠滿足RACE操作的基本要求。3、白菜、甘藍和甘藍型油菜RACE第一鏈cDNA的獲得分別取白菜06K130、甘藍06K158、甘藍型油菜5B的蕾、花、10D、20D、30D種子的總
RNA混合，采用GeneRacer Kit按其說明書進行一系列的RACE操作，分別獲得白菜、甘藍、甘藍型油菜第一鏈cDNA (3’端和5’端同時錨定有人工接頭序列)，PCR放大后進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示，3個物種的總cDNA呈現出大小在200bp 101Λ的拖帶，重心區域在500bp 41Λ之間，最核心區在1. 5kb左右，說明反轉錄完全，得到了高質量的RACE總cDNA，可用于克隆白菜、甘藍和甘藍型油菜TT8基因家族完整的cDNA末端。4、白菜、甘藍和甘藍型油菜TT8基因家族5，cDNA末端的克隆采用Vector NTI Suite 9. 0 對來自擬南芥(NM_1170502，AJ277509)、牽牛花(Ipomoeatricolor) (AB154370)、百合(Lilium) (AB222076)、紫花牽牛(Ipomoea purpurea)(AB154369)、矮牽牛(Ipomoea nil) (AB232775)的TT8或編碼bHLH轉錄因子的核酸序列進行多重比對，針對5’和3’末端的最保守區域設計了 2個正向引物(FTT8-3和FTT8-3N)和2個反向引物(RTT8-5和RTT8-5N)(表1)作為擴增白菜、甘藍和甘藍型油菜TT8基因家族成員cDNA末端的特異引物。分別以白菜、甘藍和甘藍型油菜第一鏈cDNA為模板，用引物組合5，P+RTT8_5進行5，cDNA末端的 RACE—擴。50μ 1 標準Taq PCR擴增體系為10XPCR Buffer 5 μ l,25mmol/L 的 MgCl23y l,10mmol/L 的 dNTPs 1μ l,10ymol/L 的正向引物 1μ l,10ymol/L 的反向引物1 μ 1，5U/ μ 1的Taq酶0. 5 μ 1，模板2 μ 1，加雙蒸水至總體積為50 μ 1。PCR擴增程序為94°C預變性2分鐘；再94°C變性1分鐘，52 °C退火1分鐘，72 °C延伸1分鐘，共30個循環；最后72°C延伸10分鐘。再以一擴產物為模板，用引物組合5，NP+RTT8-5N進行5，cDNA末端的RACE巢擴，PCR擴增體系與一擴相同但模板改為0. 1 μ 1，PCR擴增程序為94°C預變性2分鐘；再94°C變性1分鐘，56°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，共28個循環；最后72°C延伸10分鐘。PCR產物進行1. O %瓊脂糖凝膠電泳檢測，BrTTS獲得了一條600bp左右的寬帶，BoTT8獲得了一條^Obp的條帶，BnTT8獲得了一條350-550左右的很亮的寬帶(圖1)。采用小量膠回收試劑盒回收目標片段，與PMD18-T載體連接，再轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，用含有氨芐青霉素(Amp)、IPTG和X-gal的LB平板培養至藍白斑清晰，挑取白斑單菌落，用含有Amp的LB液體培養基增菌培養后，取菌液進行PCR鑒定，結果陽性克隆子表現出明顯的長度多態性，每個物種挑選多個代表性單克隆子委托上海英竣生物工程技術有限公司進行測序。表15’和3’ RACE中的基因特異引物(GSP)和GeneRacer試劑盒引物
權利要求
1.白菜TT8基因家族，其特征在于，包括以下2個成員BrTT8-l基因和BrTT8-2基因；所述BrTT8-l基因的全長cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrTT8_2基因的全長cDNA序列如 SEQ ID No. 4 所示。
2.根據權利要求1所述的白菜TT8基因家族，其特征在于，所述BrTTS-I基因的基因組序列如SEQ ID No. 1所示，BrTT8-2基因的基因組序列如SEQ ID No. 3所示。
3.含有權利要求1或2所述的白菜TT8基因家族中任一種或多種基因或基因保守片段的重組表達載體。
4.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為正義植物表達載體，是將白菜TT8基因家族中任一種基因的基因組序列或全長cDNA序列正義插入PCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子與Nos終止子之間而得到。
5.根據權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為反義植物表達載體，是將白菜TT8基因家族中任一種基因的全部或部分編碼序列反義插入PCAMBIA2301G載體的CaMV35S啟動子與Nos終止子之間而得到。
6.含有權利要求3至5任一項所述重組表達載體的轉化體，所述轉化體為微生物。
7.權利要求1或2所述的白菜TT8基因家族在蕓薹屬作物種子性狀的分子育種中的應用，所述種子性狀為種皮顏色和種子大小。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述蕓薹屬作物為甘藍型油菜。
全文摘要
本發明公開了白菜TT8基因家族，包括BrTT8-1基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.2所示)和BrTT8-2基因(全長cDNA序列如SEQ ID No.4所示)二個成員，該基因家族可應用于蕓薹屬作物種皮顏色和種子大小等種子性狀的分子育種。
文檔編號C12N15/82GK102559701SQ20121001850
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月19日 優先權日2012年1月19日
發明者張瑞熙, 李加納, 林吶, 柴友榮, 殷家明, 肖霞, 許本波, 謝伶俐, 趙文軍 申請人:西南大學