專利名稱：一種鑒別小孢粉孢牛肝菌的特異引物及鑒別方法
技術領域：
本發明涉及一種小孢粉孢牛肝菌(7>70貝7狀fflicro^oi^s S. Z. Fu, Q. B. Wang & Y. J. Yao)的特異引物及其PCR鑒別方法，屬于利用分子生物學方法鑒別食毒不清牛肝菌技術領域。
背景技術：
云南特殊的立體氣候、復雜的土壤結構和豐富的植物物種及其多樣的植被類型，孕育了豐富的野生菌資源多樣性，其中牛肝菌又是種類最多的野生菌資源，這些資源在增加山區農戶家庭收入中有重要的作用，有的偏遠地區，野生菌的收入約占家庭年收入1/3-1/2。在野生菌資源中牛肝菌資源是分布最廣、種類最多、形態相似性較高、形態學鑒定相對較難、資源量最大的類群。牛肝菌類群真菌組織呈肉質、易生蟲和腐爛，所以為了便于儲藏和攜帶，牛肝菌常常被加工成干片銷售，而牛肝菌經加工成干片后形態變化大，導致品質高的和品質低的混淆，有毒種和可食種或食毒不清的種混淆，導致野生食用菌產品混淆嚴重，品質層次不齊，給消費者人生安全帶來潛在危害。小孢粉孢牛肝菌(7 microsporus) 在云南分布區域廣、產量高、可食性不清晰，采集者和中間貿易商常常將其加工成干片混于其它可食或品質較高的牛肝菌中銷售，偶有造成中毒事件發生。而目前鑒別小孢粉孢牛肝菌的方法主要是形態學分類法。要從混雜的商品牛肝菌中準確鑒別出食毒不清的小孢粉孢牛肝菌需要有一定大型真菌分類學基礎，但消費者往往不具備這方面的知識，因此，一方面導致中毒事件的發生，另一方面，縱容了不法經銷商。目前，國內外對小孢粉孢牛肝菌的研究主要集中的形態分類及系統學研究方面，應用其特異引物對該菌進行快速鑒別或檢測的研究未見報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種小孢粉孢牛肝菌鑒別的PCR方法及其特異引物，能對混合牛肝菌樣品或小孢粉孢牛肝菌進行快速鑒別。每一個物種都有其獨有的遺傳物質DNA，它不會隨環境及表型變化而變化。隨著分子生物學的快速發展，在細胞外進行物種特有DNA片段或序列操作成為了現實，即運用物種的特異引物，通過PCR擴增，并應用瓊脂糖凝膠電泳檢測其特有片段，實現物種的快速鑒別成為現實。本發明設計了鑒別小孢粉孢牛肝菌的特異引物TMf和TMr，其DNA序列為 TMf=GTC TTT CKC CAT CCC AAC CAA CG
TMr :GAA TCC AAA CMA CTC CAG CCC CG
用上述特異引物鑒別小孢粉孢牛肝菌的方法按以下步驟進行
1)牛肝菌樣品DNA提取；
2)以上述DNA為模板，用特異引物TMf和TMr進行PCR擴增反應，擴增條件94°C變性 5 min，然后進入連續35個循環(94°C變性0. 5 min，58. 2°C退火0. 5 min，72°C延伸2 min), 循環結束后于72°C延伸5 min；3)取上述PCR擴增產物在質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠上電泳，銹化乙錠染色，紫外透射儀檢測擴增片段有無及大小，鑒別牛肝菌樣品中是否混有食毒不清的小孢粉孢牛肝菌。本發明的方法采用一對特異引物，通過PCR反應即能有效地鑒別混合牛肝菌中是否混有小孢粉孢牛肝菌。具有快速和高效的特點，一般從拿到牛肝菌混合樣品到鑒定出結果僅需2-3小時。這對打擊摻假的不法商販，從源頭上凈化牛肝菌市場，有效保護消費者的食用安全具有重要的實際意義。


圖1為牛肝菌混合樣品中小孢粉孢牛肝菌特異引物擴增的DNA片段瓊脂糖凝膠電泳圖，電泳圖說明見表1。表 1
—序號 |a Ib Ic
樣品|Mark I表2|表3
(表2與表3混合牛肝菌樣品物種目錄的區別在于表2中有L123 Tylopilus ndcivspoi~us，a 3中沒有，Mark的分子量為2)。
具體實施例方式
實施例1、混合牛肝菌樣品采集目錄，見表2和表3。表2混合牛肝菌樣品物種目錄1_
權利要求
1.一種鑒別小孢粉孢牛肝菌鑒的特異引物，其特征在于特異引物TMf和TMr，其DNA序列為TMf=GTC TTT CKC CAT CCC AAC CAA CGTMr :GAA TCC AAA CMA CTC CAG CCC CG 。
2.一種用權利要求1所述的特異引物鑒別小孢粉孢牛肝菌的方法，其特征在于按以下步驟進行(1)牛肝菌樣品DNA提取；(2)以上述DNA為PCR擴增的模板，用特異引物TMf和TMr進行PCR擴增；(3)取上述(2)的PCR擴增產物在質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠上電泳，銹化乙錠染色，紫外透射儀檢測擴增片段有無及大小。
3.根據權利要求2所述的特異引物鑒別小孢粉孢牛肝菌的方法，其特征在于所述步驟(2)中PCR擴增條件是94°C變性5 min，然后進入連續35個循環，每個循環為94°C變性.0.5 min，58. 2°C退火 0. 5 min，72°C延伸 2 min，循環結束后于 72°C延伸 5 min。
全文摘要
本發明是一種鑒別小孢粉孢牛肝菌(T.microsporus)的特異引物及鑒別方法。特異引物TMf和TMr，其DNA序列為TMfGTCTTTCKCCATCCCAACCAACG；TMrGAATCCAAACMACTCCAGCCCCG。通過牛肝菌樣品DNA提取、以該DNA為PCR擴增的模板，用特異引物TMf和TMr進行PCR擴增、PCR擴增產物在濃度為1%的瓊脂糖凝膠上電泳，銹化乙錠染色，紫外透射儀檢測擴增片段來進行鑒別混合牛肝菌樣品中是否混有食毒不清的小孢粉孢牛肝菌。本發明的方法具有快速和高效的特點，一般從拿到牛肝菌混合樣品到鑒定出結果僅需2-3小時。
文檔編號C12R1/645GK102559906SQ20121002410
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月3日 優先權日2012年2月3日
發明者張小雷, 李樹紅, 柴紅梅, 蘇開美, 趙永昌, 趙靜 申請人:云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所