專利名稱：酶和酶的活性部位特異性陪伴分子的組合的制作方法
技術領域：
本申請提供了通過將活性部位特異陪伴分子(ASSC)與蛋白質替代治療聯合來提高所施用蛋白質穩定性和功效的改良的蛋白質替代療法。本申請進一步提供了包含純化蛋白質和ASSC的組合物。
背景技術：
蛋白質缺乏病蛋白質是在細胞內根據特定基因的基因組核苷酸序列通過轉錄、翻譯和其它過程合成的。蛋白質缺乏病可以由編碼基因的突變引起，該突變導致(i)蛋白質不能合成；(ii) 缺乏生物學活性的蛋白質的合成；或(iii)包含正常或部分生物學活性、但不能夠適當加工以達到蛋白質的天然區室的蛋白質的合成。源于遺傳突變的蛋白質缺乏病也叫做遺傳病。除了源于遺傳突變的蛋白質缺乏病外，一些蛋白質缺乏病可以由疾病或者疾病治療(例如化學療法)的副作用或者營養不量的后果引起。當前療法蛋白質的缺乏會導致多種疾病，一些疾病是由突變的、錯折疊的蛋白質引起的(構象疾病-下同)。用于治療蛋白質缺乏病的一種當前療法是蛋白質替代療法，該方法一般涉及靜脈內、皮下或肌內灌注純化形式的相應野生型蛋白質，或者植入生物易蝕固體形式的蛋白質以便持續釋放。由于所灌注的蛋白質會被迅速地降解，所以蛋白質替代療法的一個主要的復雜因素是蛋白質治療有效量的實現和維持。克服該問題的當前方法是多次高成本的高劑量灌注。蛋白質替代療法具有幾個額外的限制，例如大規模產生、純化和貯藏正確折疊蛋白質上的困難、得到糖基化的天然蛋白質上的困難、抗蛋白質免疫反應的產生以及在具有明顯牽涉中樞神經系統的疾病中不能夠穿過血-腦屏障。使用包含編碼功能蛋白質的核酸序列的重組載體的基因治療，或者使用表達功能蛋白質的經遺傳修飾的人細胞的基因治療，也可以用來治療蛋白質缺乏病和能從蛋白質替代中受益的其它疾病。雖然該方法有希望，但由于技術難題使該方法受到了限制，例如載體不能夠感染或轉導正在分裂的細胞、靶基因的低表達、以及基因一旦被遞送后對表達的調節。第三，治療蛋白質缺乏病的相對較新的方法涉及到小分子抑制劑的使用以降低所缺乏酶蛋白質的天然底物，從而改善病理學。此種“底物剝奪”的方法已經在稱作溶酶體貯積病或鞘糖脂貯積疾病的一類大約40種相關酶疾病中被具體地描述。這些可遺傳疾病的特征是缺乏能夠催化降解細胞內糖脂的溶酶體酶，導致脂類不正常積累，這打亂了細胞的功能。計劃用于治療的小分子抑制劑對于抑制參與糖脂合成的酶是特異的，該種抑制降低了需要由所缺乏酶降解的細胞內糖脂的量。該方法也受到了限制，因為糖脂對于生物學功能是必需的，并且過度的剝奪會引起副作用。具體而言，糖脂能夠被腦用來從神經元的神經節苷脂傳遞信號到其它神經元。如果糖脂太少或太多，神經元傳遞信號的能力受到阻礙。如下作為特異陪伴分子進行討論的第四種方法使突變型蛋白質免受內質網內的降解。蛋白質在內質網內的加工蛋白質在細胞質內合成，并且新合成的蛋白質以很大程度未折疊的狀態分泌進入內質網(ER)的腔內。通常，蛋白質折疊受自組裝原則的控制。新合成的多肽根據它們的氨基酸序列折疊成它們的天然構象(Anfinsen等,Adv. Protein Chem. 1975 ；29 :205-300)。在體內，蛋白質折疊是復雜的，因為環境溫度和高蛋白質濃度的結合會刺激聚集過程，在該過程中通常埋于疏水核心內的氨基酸會與它們相鄰的氨基酸發生非特異的相互作用。為了避免出現這種問題，通常通過特定的一組稱作分子侶伴的蛋白質促進蛋白質的折疊，分子侶伴阻止了初生多肽鏈的聚集并且能夠結合到未折疊的蛋白質上以致于蛋白質以天然構象重折疊(Hartl，Nature 1996 ；381 :571-580)。分子侶伴實際上存在于所有類型的細胞和大部分細胞區室內。一些參與蛋白質的轉運并且允許細胞在諸如熱休克和葡萄糖饑餓的應激條件下存活(Gething等，Nature 1992 ；355 :33-45 ；Caplan, Trends Cell.Biol. 1999 ；9 :262-268 ；Lin 等，Mol. Biol. Cell. 1993 ；4 :109-1119 ;Bergeron等，Trends Biochem. Sci. 1994 ；19 :124-128)。在分子侶伴中，Bip(免疫球蛋白重鏈結合蛋白，Grp78)是特征最清楚的ER的陪伴分子(Haas，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1991 ；167 :71-82)。像其它分子侶伴一樣，Bip與ER內的許多分泌蛋白和膜蛋白在這些蛋白質的整個成熟過程中發生相互作用，雖然在折疊平穩進行過程中這種相互作用通常很弱并且是短壽命的。一旦完成天然蛋白質的構象，分子侶伴不再與蛋白質相互作用。結合到在折疊、裝配或正確糖基化方面失敗的蛋白質上后的Bip變得穩定， 并且導致了蛋白質通過ER相關途徑的降解。該過程作為ER內的“質量控制”系統起作用， 保證了只有那些正確折疊和裝配的蛋白質能夠轉運出ER用于進一步的成熟，并且錯折疊的蛋白質滯留其中進行隨后的降解(Hurtley等，Annu. Rev. Cell. Biol. 1989 ；5 :277-307)。某些DNA突變導致氨基酸替代，這種替代進一步阻止并且在許多情況下排除突變型蛋白質的正確折疊。為了糾正這些錯折疊，研究人員嘗試了使用多種分子。已經表明在一些疾病中高濃度的甘油、二甲基亞砜(DMSO)、三甲胺-N-氧化物(TMAO)或者重水抑制降解途徑并增加突變型蛋白質的細胞內轉運(Brown等，Cell Stress Chaperones 1996 ；1 117-125 ；Burrows 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000 ；97 :1796-801)。雖然其功能機制還不清楚，但是這些化合物被認為是能夠促進一般蛋白質折疊的非特異的化學陪伴分子。雖然它們對于細胞內蛋白質折疊缺陷的生物化學檢查是有用處的，但起功效時要求該類化合物的高劑量使得它們在臨床上應用困難或不適宜用于臨床。這些化合物還缺乏特異性。特異的陪伴分子策略先前的專利和公開描述了拯救內源性酶蛋白質特別是錯折疊的溶酶體酶免受通過ER質量控制機制而降解的治療策略。該策略使用對與特定溶酶體病相關的缺陷溶酶體酶特異的小分子可逆競爭性抑制劑。該策略如下由于突變型酶蛋白質在ER內不正確折疊(Ishii 等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996 ；220 ;812_815)，酶蛋白質被滯留于正常的轉運途徑(ER—高爾基體一內體一溶酶體)并且被快速地降解。因此，促進突變型蛋白質正確折疊的功能性化合物將作為針對突變型蛋白質的位點特異的陪伴分子而在促進從ER質量控制系統內順利逃脫。由于已知酶的一些抑制劑占據酶的催化中心，導致了體外其構象的穩定。這些特異的陪伴分子可以稱作活性部位特異陪伴分子(ASSC)。在Fan 等的美國專利號 6，274，597,6, 583，158,6, 589，964 和 6，599，919 和 2002 年 11月26日申請的待決美國申請系列號10/304，396 (此處完全引用作為參考)中已經專門闡述了參與溶酶體貯積病的酶的策略。例如，半乳糖的小分子衍生物，I-脫氧半乳糖野尻霉素(nojirimycin) (DGJ),是一種突變型法布里(Fabry)酶α -半乳糖苷酶A ( a-Gal Α)的有效的競爭性抑制劑，能夠有效提高中性pH下突變型α-Gal A(R301Q)的體外穩定性并且增強從具有R301Q或者Q279E突變的法布里病人中建立的淋巴母細胞中突變型酶的活性。 此外，過量表達突變型(R301Q) a -Gal A的轉基因小鼠經口施用DGJ會在主要器官大量地提高酶活性(Fan等，Nature Med. 1999 ；5 :112-115)。對錯折疊蛋白質的成功拯救取決于特異抑制劑在體內達到的濃度，該濃度低于酶的完全抑制濃度，相比之下底物剝奪方法中需要酶的抑制濃度。除了溶酶體貯積病外，現在認為大量并且多種疾病也是由于采用非天然蛋白質構象所導致的構象疾病，這可能導致蛋白質在ER內滯留并最終導致蛋白質的降解(Kuznetsov 等，N. Engl. J. Med. 1998 ；339 1688-1695 ；Thomas 等，Trends Biochem. Sci. 1995 ；20 :456-459 ；Bychkova 等，FEBSLett. 1995 ；359 :6_8 ；Brooks, FEBS Lett. 1997 ； 409 :115-120)。ASSC表現出拯救除了酶外的突變型蛋白質的表達。例如，發現小的合成化合物會穩定突變型形式的腫瘤抑制基因蛋白P53的DNA結合結構域，因此允許蛋白質維持活性構象(Foster等,Science 1999 ；286 :2507-10)。已經表明通過小分子受體拮抗物和配體可以搖救受體的合成(Morello 等，J. Clin. Invest. 2000 ； 105 :887-95 ;Petaja_Repo 等， EMBO J. 2002 ；21 :1628-37)。已經證明甚至通過使用通道阻斷藥物或底物對膜通道蛋白質和其它質膜轉運蛋白進行藥學搖救(Rajamani等，Circulation 2002 ；105 :2830-5 ；Zhou 等，J. Biol. Chem. 1999 ；274 :31123-26 ；Loo 等，J. Biol. Chem 1997 ；272 :709-12)。上述所有文獻顯示ASSC有能力特異地拯救包括但不限于酶、受體、膜通道蛋白質和DNA轉錄因子在內的突變型蛋白質。除了突變型蛋白質以外，ASSC還表現出能夠穩定野生型蛋白質，導致它們的產量和穩定性提高。如在一個實例中，已經證明特定ASSC即DGJ能夠增加用編碼野生型a -Gal A序列的載體轉染的C0S-7細胞內野生型a -Gal A的數量和活性。ASSC拯救過量表達的野生型酶，否則這些酶會滯留于ER質量控制系統，因為在C0S-7細胞中所述酶的過量表達和過量產生超過了該系統的容量并且導致聚集和降解(見03年2月28日申請的美國申請系列號 10/377，179)。總之，當應用蛋白質替代治療例如施用替代蛋白質治療蛋白質缺乏病或其它疾病時，本領域需要提高生物學功效和成本效率的方法。發明概述本發明提供了增強純化蛋白質穩定性的方法，該方法包括將于可藥用載體中的蛋白質與活性部位特異陪伴分子相互接觸。
純化的蛋白質可以是重組蛋白質并且可以是保留活性的全長的或截短的蛋白質。本發明還提供了通過將于可藥用載體中的蛋白質與活性部位特異陪伴分子相互接觸使得蛋白質在體外的貯存期限得到提高的方法。可藥用載體中的蛋白質可以是冷凍干燥的或者是水溶液。本發明進一步提供了延長純化蛋白質在用于可藥用載體中的蛋白質施用的個體內的半衰期和體內活性的方法，該方法包括將蛋白質與于可藥用載體中的活性部位特異陪伴分子相接觸。本發明提供了用于對患有需要進行蛋白質替代的疾病(例如蛋白質缺乏疾病)的個體進行治療的方法，其包括對個體施用純化的替代蛋白質和能夠穩定替代蛋白質的活性部位特異陪伴分子(ASSC)。在一個實施方案中，替代蛋白質是一種與構象疾病相關的蛋白質。在一個優選地實施方案中，構象疾病是溶酶體貯積病。在一個實施方案中，溶酶體貯積病是法布里病。在另一個實施方案中，溶酶體貯積病是戈謝病。本發明還提供了在蛋白質替代治療的同時增強突變型內源性蛋白質的穩定性的方法，該蛋白質由于在ER內的缺陷性的折疊和加工而變得缺乏。隨著所施用的對應于突變型蛋白質的替代蛋白質穩定性的增加，內源性蛋白質的穩定性和因此而來的活性增強了。本發明進一步提供了通過將宿主細胞與包含針對蛋白質的ASSC的培養基相接觸而增加由非哺乳動物宿主細胞產生的重組蛋白產量的方法。本發明進一部提供了于可藥用載體中的包含純化蛋白質和針對純化蛋白質的 ASSC的組合物。附圖
簡述圖I表明使用部位特異陪伴分子I-脫氧半乳糖野尻霉素(DGJ，I μ Μ)的野生型和突變型a-Gal A穩定性分別提高，野生型a-Gal A是從用帶有人野生型a-Gal A cDNA的重組桿狀病毒感染的Sf-9細胞的培養基中純化的，突變型a -Gal A是從過量表達人突變型(R301Q) α-Gal A的轉基因小鼠的心臟勻漿液中收集的。實驗前，將小鼠用作為飲用水的 O. 5mM DGJ處理一周。將突變型(A)和野生型(B)的酶在濃度為1μΜ(〇)，0. 1μΜ(·)， O. 03μΜ(4)或ΟμΜ(沒有DGJ ; )的DGJ存在的條件下，分別于37°C和42°C用O. IM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(PH7. O)進行預培育，對于突變型酶為37°C對于野生型酶為42°C。 酶活性報導為與未進行預培育的酶相比的相對值。DGJ可以作為穩定劑防止突變型和野生型酶的變性/降解。發明詳述本發明通過將蛋白質與活性部位特異陪伴分子(ASSC)相接觸有利地改進了用于治療疾病或病癥的蛋白質替代療法的療效。本發明的優點體現在(a)提高非哺乳動物細胞產生蛋白質的效率；(b)增加治療蛋白質的穩定性，表現為更長的貯存期限和更好的體內半衰期和活性；(C)在體內轉運包括跨細胞膜轉運時維持蛋白質活性部位的結構；和(d)拯救內源性突變型蛋白質，該蛋白質在合成過程中發生錯折疊并隨后從內質網中清除掉。本發明進一步提供了包含蛋白質和特異性穩定蛋白質的活性部位特異陪伴分子 (ASSC)的制劑。
本發明是以這樣的發現為基礎的，即在遺傳病和其它疾病的治療中ASSC能夠作為蛋白質替代療法的聯合治療而使用。使用本領域已知的方法可以對ASSC進行篩選和鑒定。一旦鑒定出一種對特定疾病有用的ASSC，則可將ASSC施用于接受蛋白質替代治療的病人，以增強替代蛋白質在恰當細胞區室中的吸收、提高循環中蛋白質的穩定性，以及根據需要提高在轉運進入細胞期間的蛋白質的穩定性。在制造、貯存和體內使用過程中，陪伴分子可以穩定蛋白質的活性形式。定義在每個術語所使用的本發明上下文中和其所使用的特定上下文中，本說明書中使用的術語通常具有本領域中其通常的含義。為了在描述本發明的組合物和方法以及怎樣使用它們方面對醫師提供額外的指導，一些術語在下面討論，或者在說明書的其它地方討論。具體定義.術語“蛋白質替代”是指將非天然的、純化的蛋白質導入患有該蛋白質缺乏病的個體中。所施用的蛋白質可以從天然來源得到(例如用于治療RSV和單核細胞增多癥的人丙種球蛋白)或者通過重組表達得到(如下面比較詳細的描述)。該術語還指純化蛋白質向個體的導入，此處所述的個體需要施用純化蛋白質或者從純化蛋白質的施用中受益，例如患有蛋白質缺乏的個體。所導入的蛋白質可以是純化的、經體外產生的重組蛋白或者從諸如胎盤或動物乳汁的離體組織或液體中或者植物中純化的蛋白質。術語“通過蛋白質缺乏表征的疾病”指存在由蛋白質缺乏或數量不足導致的出現病理變化的任何疾病。該術語包含導致生物學失活蛋白質產物的蛋白質折疊疾病，即構象疾病。在傳染性疾病、免疫抑制、器官衰竭、腺問題、放射病、營養缺乏、中毒、或其它環境或外部創傷中可涉及到蛋白質不足。術語“穩定正確構象”指化合物或肽或其它分子與在體外例如在制劑中和體內與野生型蛋白質或者能夠行使野生型功能的突變型蛋白質結合從而使野生型或突變型蛋白質的結構可以維持其天然或正確形式的能力。這種作用通過(i)蛋白質貯存期限的提高；
(ii)每單位量的蛋白質的較高的活性；或者(iii)體內效能更強中的一種或多種實踐性地證明了。這通過表達時提高的從ER中的產量、對由于溫度提高或離液劑的存在所導致對解折疊的較大抗性以及通過相似的方法實驗性地觀察到。如此處所使用，術語“構象病”或“構象疾病”指采用的蛋白質構象所導致的疾病， 其中所述的蛋白質構象不能被具有正常生物學活性的野生型蛋白質在天然條件下正常地形成，這種疾病會導致蛋白質在ER中滯留和破壞。降低的蛋白質水平導致生理性不平衡， 其表現為一種疾病或病癥。在一個具體的實施方案中，構象疾病是溶酶體貯積病。如此處所使用，術語“活性部位”指蛋白質具有一些特異生物學活性的區域。例如，它可以是結合底物或其它結合配偶體(partner)的部位和貢獻直接參與產生和打斷化學鍵的氨基酸殘基的部位。在本發明中活性部位可以包括酶的催化位點、抗體的抗原結合位點、受體的配體結合結構域、調節物的結合結構域或者分泌蛋白質的受體結合結構域。活性部位還可以包括反式激活、蛋白質-蛋白質相互作用、或轉錄因子和調節物的DNA結合結構域。如此處所使用，術語“活性部位特異陪伴分子”指能夠特異地與蛋白質活性部位可逆相互作用并且增強穩定分子構象形成的包括蛋白質、肽、核酸、糖類在內的任何分子。如此處所使用，“活性部位特異陪伴分子”不包括存在于細胞ER中的內源性普通陪伴分子如Bip、鈣聯接蛋白或鈣網蛋白，或者通常的非特異化學陪伴分子如重水、DMSO或ΤΜΑ0。一般定義如此處所使用術語“純化的”指在降低或消除無關材料即污染物存在的條件下被分離的材料，其中所述無關材料包括最終所得材料之來源的天然材料。例如，純化的蛋白質優選地基本上沒有在細胞內能與其結合的其它蛋白質或核酸；純化的核酸分子優選地基本上沒有在細胞內的蛋白質或其它無關核酸分子。如此處所使用，術語“基本上沒有”在材料的分析測試上下文中可以操作性地使用。優選地，基本上不含雜質的純化的材料為至少95%的純度；更加優選地，至少97%的純度，并且更加優選地還可以至少99%的純度。純度可以通過層析、凝膠電泳、免疫測定、組成分析、生物學鑒定和本領域已知的其它方法估計出來。在一個特定的實施方案中，純化的意思是指污染物的水平低于施用于人或非人動物的規管局所接受的水平。在優選的實施方案中，術語“大約”和“約”通常指根據測量的性質和精度而定的測量數量的可接受程度的誤差。一般地，例證的誤差程度在給定數值或數值范圍的20%以內，優選地在10 %以內，并且更加優選地在5 %以內。備選地，并且尤其是在生物學系統中， 術語“大約”和“約”可指給定數值的一個數量級內的數值，優選地在10倍或5倍以內，并且更加優選地在2倍以內。除非另外聲明，當文中指出數字的量是近似的時，是指不進行表述性的陳述而引用的術語“大約”或“約”。“基因”是編碼功能性“基因產物”的核苷酸序列。通常，基因產物是功能性蛋白質。 然而，基因產物還可以是細胞內其它類型的分子，例如RNA (例如tRNA或者rRNA)。為了本發明的目的，基因產物還指在細胞內可以發現的mRNA序列。術語“表達”意思是指通過活化參與相應基因或DNA序列轉錄和翻譯的細胞內功能而允許或導致基因或DNA序列中的信息變成表現形式，例如產生RNA (例如rRNA或mRNA) 或蛋白質。DNA序列由細胞表達以形成諸如RNA(例如mRNA或rRNA)和蛋白質的“表達產物”。表達產物本身例如最終的RNA或蛋白質可以稱作被細胞“表達的”。術語“轉染”意思是指將外源核酸導入細胞內。術語“轉化”意思是指將“外來的”(即外部的或細胞外的)基因、DNA或RNA序列導入宿主細胞以致于宿主細胞表達導入的基因或序列以產生目的物質，其中所述的目的物質在本發明中一般是指被所導入基因或序列編碼的RNA，也可以是被所導入基因或序列編碼的蛋白質或酶。所導入的基因或序列還可以稱作“克隆的”或“外來的”基因或序列，可以包括調節或控制序列(例如被細胞的遺傳機制所使用的起始、終止、啟動子、信號、分泌或其它序列)。基因或序列可包括非功能性序列或未知功能序列。接受并表達所導入DNA或RNA的宿主細胞已經被“轉化了”并且是一個“轉化體”或“克隆”。導入宿主細胞的DNA或RNA可以來自于許多來源，包括與宿主細胞同一屬或種的細胞或不同屬或種的細胞。術語“載體”、“克隆載體”和“表達載體”意思是指運載體，通過該運載體將DNA或 RNA序列(例如外來基因)導入宿主細胞從而轉化宿主和促進所導入序列的表達(例如轉錄和翻譯)。術語“表達系統”意思是指在適宜條件下的宿主細胞和相容的載體，該適宜條件例如為了表達由載體攜帶的并已導入宿主細胞的外來DNA所編碼的蛋白質。常用的表達系統包括大腸桿菌(E. coli)宿主細胞和質粒載體、昆蟲宿主細胞例如Sf9、Η 5或S2細胞和桿狀病毒載體和表達系統、以及哺乳動物宿主細胞和載體。
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術語“突變型”和“突變”意思是指遺傳物質例如DNA中的任何可檢測的變化或此種變化的任何過程、機制或結果。它包括基因結構(例如DNA序列)發生改變的基因突變、源于任何突變過程的基因或DNA、或由修飾的基因或DNA序列表達的任何表達產物(如 RNA、蛋白質或酶)。如此處所使用術語“突變型蛋白質”是指從含有能導致蛋白質序列改變的遺傳學突變的基因翻譯而來的蛋白質。在一個特定的實施方案中，此種突變導致蛋白質在通常存在于ER內的條件下不能達到其天然構象的能力。在實現此種構象上的失敗導致了蛋白質被降解，而不是通過蛋白質轉運系統中它們的正常途徑轉運至它們在細胞內的正常位置。 其它突變可以導致活性的降低或周轉更快。“野生型基因”指編碼在體內具有正常生物學功能活性的蛋白質的核酸序列。野生型核酸序列可含有不同于已知公布的、能導致對生物學活性影響很小或沒有的氨基酸替代的改變的、核苷酸的變化。術語野生型也可包括為了編碼相對于內源或天然蛋白質能夠提高或增強活性的蛋白質而經過改造的核酸序列。“野生型蛋白質”指由野生型基因編碼的蛋白質，當在體內表達或導入時該蛋白質具有功能性生物學活性。術語“正常的野生型活性”指蛋白質在細胞內的正常的生理功能。 蛋白質的功能性可通過已知的用于確定蛋白質功能性的任何方法測試。術語“經遺傳修飾的”指在導入包含編碼基因產物的編碼序列和控制編碼序列表達的調節元件的核酸之后，表達特定基因產物的細胞。核酸的導入可以通過包括基因尋靶和同源重組在內的本領域已知的方法來實現。如此處所使用，該術語還包括已經經過工程改造例如通過基因活化技術表達或過量表達內源性基因或基因產物的細胞，此處所述的基因和基因產物不能由該細胞正常表達。短語“可藥用”，不論其是否與本發明的藥用組合物聯合使用，指當施用于人時能夠生理性耐受的并且一般不產生不利反應的分子和組合物。優選地，如此處所使用，術語 “可藥用”意思是指聯邦政府或州政府規管局認可的或者美國藥典或其它用于動物的并且更加具體地用于人的一般公認的藥典中列出的。術語“載體”指化合物與其一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此類藥用運載體可以是無菌液體例如水和油。水或水溶液、 鹽溶液和水溶右旋糖和甘油溶液優選用作載體，特別是用于可注射溶液。適當的藥用運載體在 E. W. Martin 的 “Remington，s Pharmaceutical Sciences”,第 18 版中進行了描述。術語“治療有效量”和“有效量”指足以導致治療反應的化合物的量。在ASSC和蛋白質以復合物形式施用的實施方案中，術語“治療有效量”和“有效量”指足以導致治療反應的復合物的量。治療反應可以是使用者(例如臨床醫生)所識別的作為對治療有效反應的任何反應。因此，治療反應通常是疾病或病癥的一種或多種癥狀的緩解。值得注意，為了本發明的目的，由于當體內施用時ASSC的稀釋(和隨后的由于平衡的變化導致的結合轉換)、生物利用率和代謝，在純化的治療蛋白質的體外產生、運輸或貯存過程中呈抑制性效應的ASSC濃度也可構成“有效量”。通過蛋白質缺乏所表征的疾病當前有大約1100種已知的遺傳性疾病是以蛋白質缺乏或在特定的組織中喪失功能為特征的。理論上這些疾病可以通過蛋白質替代治療來治療。本發明的方法著眼于對當前適用于蛋白質替代治療的蛋白質的共治療(co-therapy)，該蛋白質替代治療可以是現在可得的或者在將來是可得的。在此種疾病中，個體的一些細胞或所有細胞缺乏足夠功能的蛋白質、包含失活形式的蛋白質或者包含對于生物學功能而言不足夠的水平。更進一步，被鑒定為由能夠導致蛋白質缺乏的蛋白質折疊改變的突變和突變型蛋白質在ER滯留所產生的構象性失調的疾病名單正在增加。它們包括囊性纖維化、α I-抗胰蛋白酶缺乏、家族性高膽固醇血癥、法布里病、阿爾茨海默氏病(Selkoe， Annu. Rev. Neurosci. 1994 ； 17 :489-517)、成骨不全(Chessler 等，J. Biol. Chem. 1993 ； 268 :18226-18233)、糖類缺乏的糖蛋白綜合癥(Marquardt 等，Eur. J. Cell. Biol. 1995 ； 66 :268-273)、馬-蘭綜合癥(Bradford 等，Biochem. J. 1999 ；341 :193-201)、遺傳性盲 (Kaushal 等，Biochemistry 1994 ；33 :6121_8)、格蘭茨曼血小板無力癥(Kato 等，Blood 1992 ；79 :3212-8)、遺傳性凝血因子 VII 缺乏病(Arbini 等，Blood 1996 ；87 :5085-94)、眼皮膚白化病(Halaban 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000 ；97 =5889-94)和蛋白質 C 缺乏病(Katsumi等，Blood 1996 ；87 :4164-75)。最近，在X-連鎖的疾病腎上腺腦白質營養不良(ALD)中一個突變導致缺陷的過氧化物酶體轉運蛋白的錯折疊，它可以通過低溫培養受影響細胞來進行拯救(Walter等，Am. J. Hum. Genet. 2001 ；69 :35-48)。一般公認的是突變在基因的整個序列中均勻發生。因此，可以預測來源于所缺乏蛋白質的錯折疊的表型會存在于許多其它遺傳病中。溶酶體貯積病許多遺傳性蛋白質缺乏病是酶的缺乏。如上面所指出，一大類遺傳性酶的疾病涉及到溶酶體酶的突變并且稱作溶酶體貯積病(LSD)。溶酶體貯積病是一組由鞘糖脂、 糖原、粘多糖積累導致的疾病。溶酶體疾病的例子包括但不限于戈謝病(Beutler等， The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,第 8 版，2001 ;Scriver 等著，3635-3668 頁，McGraw-Hill, New York)、GMl 神經節苷脂病(相同，3775-3810 頁)、 巖藻糖苷忙積癥(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 1995. Scriver, C. R.，Baudet, A. L.，Sly, ff. S.和 Valle, D.著，2529-2561 頁，McGraw-Hill, New York)、粘多糖貯積病(相同，3421-3452頁)、龐皮病(相同，3389-3420頁)、胡-沙綜合癥(Hurler-Scheie disease) (Weismann 等，Science 1970 ; 169, 72-74)、尼曼病 A 和 B (The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,第 8 版，2001. Scriver 等著， 3589-3610 頁，McGraw-Hill，New York)和法布里病(相同，3733-3774 頁)。LSD 和它們相關的缺乏酶的名單可以從下面的表I中找到。在下面具體討論了 2種疾病。法布里病法布里病是由溶酶體α -半乳糖苷酶A(a -Gal Α)活性缺乏所引起的鞘糖脂代謝白勺X-連鎖的先天性障礙(Desnick等,The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,第 8 版，Scriver 等著，3733-3774 頁，McGraw-Hill, New York 2001 ;Brady 等， N. Engl. J. Med. 1967 ;276，1163-1167)。這種酶的缺陷導致具有α-半乳糖殘基的中性鞘糖脂主要是神經酰胺己三糖苷(GL-3)在體液和組織的溶酶體中進行性沉積。發病率估計在男性中為大約I : 40，000，并且在全世界范圍內的不同人種群中均有報道。在典型的發病男性中，臨床表現形式包括血管角皮瘤、肢端感覺異常、少汗癥、以及特征性角膜和晶狀體渾池(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,第 8 版，2001, Scriver等著,3733-3774頁，McGraw-Hill, New York)。發病男性的預期壽命縮短了，并且由于心臟、腦和/或腎臟的血管性疾病導致通常在第4個或第5個十年內出現死亡。與此相比，患有溫和的“心臟變異”的患者具有正常a -Gal A酶活性的5_15%，并且存在左心室肥大和心肌癥。當沒有這種心臟變異的人嚴重發病時而這種心臟變異患者基本上仍沒有癥狀。最近發現在帶有不可解釋的左心室肥大心肌癥的成年男性患者中有11%的人存在心臟變異，這表明法布里病的發病頻率比先前估計的要高(Nakao等，N. Engl. J. Med. 1995 ； 333，288-293)。a -Gal A 基因位于 Xq22 (Bishop 等，Am. J. Hum. Genet. 1985 ；37 A144)并且已經報道了編碼a -Gal A的全長cDNA和完整的12_kb基因組序列(Calhoun等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985 ；82 ;7364_7368 ；Bishop 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986 ；83 4859-4863 ;Tsuji 等，Eur. J. Biochem. 1987 ； 165 ;275_280 ;和Kornreich等，Nucleic Acids Res. 1989 ；17 :3301-3302)。對導致法布里病的突變的遺傳異質性已經進行了標記(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,第 8 版，2001, Scriver 等著， 3733-3774頁，McGraw-Hill，New York. ;Eng等，Am. J. Hum. Genet. 1993 ；53 :1186-1197 ；Eng 等，Mol. Med. 1997 ；3 :174-182 ;和 Davies 等，Eur. J. Hum. Genet. 1996 ；4 :219-224)。到目前為止，除了小的缺失和插入和較大的基因重排外，多種錯義、無義和剪接突變也已經進行了報道。戈謝病戈謝病是能夠破壞脂肪葡糖腦苷脂的溶酶體酶β -葡糖腦苷脂酶的缺乏病。于是脂肪主要在肝臟、脾臟和骨髓中積累。戈謝病能夠導致痛、疲勞、黃疸、骨損傷、貧血甚至死亡。戈謝病有三種臨床表型。具有在生命的早期或早期成年人出現的I型的患者由于貧血、 低血小板數量、肝臟和脾臟的增大、骨骼的弱化和一些情況下的肺臟和腎的損傷，容易碰傷和出現疲勞。沒有涉及腦的征兆。在II型中，早期發作，在3個月時出現肝臟和脾臟增大并且廣泛涉及到腦。在2歲前的死亡率很高。III型的特征是肝臟和脾臟增大并且腦抽搐。 β -葡糖腦苷脂酶基因定位于人lq21染色體。其蛋白質前體包含536個氨基酸并且其成熟的蛋白質長度是497個氨基酸。雖然來源于任何人種群的個體都可能患此病，但是認為在來源于東歐的猶太人 (德系猶太人(Ashkenazi))的后代中戈謝病更加普遍。在德系猶太人的群體中，戈謝病是最常見的遺傳病，發病率大約1/450。在一般大眾中，大約在100，000人中有一個戈謝病患者。根據國家高雪氏基金(National Gaucher Foundation), 2，500個美國人患有戈謝病。其它酶缺乏疾病葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏病是最常見的X-連鎖的人類酶缺乏病。G6H) 酶催化對于核糖的產生是必要的氧化還原反應，而核糖是DNA和RNA的主要成分。G6H)還參與維持細胞內NADPH的足夠水平。在許多生物合成反應中NADPH是所需要的輔因子。帶有該種缺乏病的個體的臨床癥狀包括新生兒黃疸、腹痛和/或背痛、眩暈、頭痛、呼吸困難 (不規則呼吸)和心悸。除了遺傳病外，其它的酶缺乏病可以由來源于原發和繼發疾病的組織或器官損傷引起。例如，由酒精中毒引起的損傷的胰腺組織或胰腺炎導致缺乏消化中需要的胰酶。當前，胰腺炎可以用酶替代治療來進行治療。表I :溶酶體貯積病，與之相關的缺陷酶，以及小分子活性部位特異陪伴分子
權利要求
1.提高非哺乳動物宿主細胞產生重組α -半乳糖苷酶A的方法，其中宿主細胞包含含有編碼重組α-半乳糖苷酶A的核酸序列的表達載體，其中α-半乳糖苷酶A不是以無生物學活性構象錯折疊的突變α-半乳糖苷酶Α，所述方法包括將宿主細胞培養于包含I-脫氧半乳糖野尻霉素的培養基中。
全文摘要
本發明提供了通過將蛋白質替代治療與活性部位特異的陪伴分子(ASSC)相結合以提高所施用蛋白質的穩定性和功效而改進蛋白質替代治療的方法。本發明進一步提供了包含純化蛋白質和ASSC的組合物和施用該組合物的治療方法。
文檔編號C12N9/24GK102586205SQ20121003289
公開日2012年7月18日 申請日期2004年2月2日 優先權日2003年1月31日
發明者樊建強 申請人:紐約大學西奈山醫學院