專利名稱：基因免疫制備人神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程和分子免疫學領域，特別是涉及一種基因免疫制備人神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體的方法。
背景技術：
人神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是參與糖酵解途徑的烯醇化酶中的一種，存在于神經組織和神經內分泌組織中。NSE在腦組織細胞的活性最高，外周神經和神經分泌組織的活性水平居中，最低值見于非神經組織、血清和脊髓液。它被發現在與神經內分泌組織起源有關的腫瘤中，特別是SCLC (小細胞肺癌)中有過量的NSE表達，導致小細胞肺癌患者的血清中NSE明顯升高。神經元特異性烯醇化酶臨床意義:神經元特異性烯醇化酶(NSE)是一種在臨床上很有應用價值的分子學標記物。這是從2個方面的應用來評述的，一是NSE可以作為肺癌和兒童神經母細胞瘤的腫瘤標記物，用于小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)的鑒別診斷；監測小細胞肺癌和神經母細胞瘤的病情、治療反應和預報復發。二是NSE的活性改變同神經損傷所致的許多神經性疾病關系密切。NSE在SCLC和神經母細胞瘤等內分泌腫瘤中顯示出很高的免疫活性，并可在血清中直接檢出。雖然NSE并不構成是SCLC的早期診斷指標，但特別是用于臨床相關疾病的診斷和治療，以及生物制品的生產和純化等。最重要和最有意義的是，NSE活性水平變化，可以用來監測SCLC和神經母細胞瘤患 者的病情發展，評價治療效果，預報復發，其方法要比X線胸透檢查來得早和方便，因此，NSE在臨床中已被做為一個十分有用的血清學的腫瘤標記物予以應用。為了進一步研究及臨床診斷和治療的需要，有學者設法從相關癌組織或癌細胞對NSE進行提取分離制備。但采用生物化學的方式進行提取制備不僅十分繁瑣且得不償失。為此國內外學者采用基因工程的方法制備NSE和NSE單克隆抗體。目前制備NSE單克隆抗體方法的技術背景:用雜交瘤成功制備單克隆抗體技術發明至今已有30多年的歷史，到目前為止單克隆抗體的種類非常繁多，已廣泛地用于生命科學等領域，以往常規制備單克隆抗體的方法主要是從相關的細胞或組織中提取抗原或購買商品抗原用于免疫實驗動物。抗原的來源不同其生物學性質有很多差別，特別是一些真核細胞表達的蛋白質在制備和純化過程中使用的試劑影響蛋白質的空間結構，由此導致蛋白質的免疫原性的改變。用于制備抗體的抗原來源影響抗體生產的關鍵問題，有些抗原來源非常困難，甚至沒有商品試劑，也沒有標準品，在這種情況下制備單克隆抗體比較復雜，首先需要鑒定提取的抗原是否正確，否則免疫原錯誤必導致抗體的錯誤；因此，抗原是制備抗體的關鍵問題。隨著分子生物學技術的發展，得到任何一個已知蛋白質的基因序列，且克隆基因和進行基因工程表達已是一個十分成熟的技術，所以大量的基因工程制備的蛋白質非常多，用于免疫動物也非常方便，許多生物公司均可以提供一定數量的純化蛋白質，只是價格較高，另外不同公司的產品和實驗人員制備的蛋白質在某些性質上還有差別，有時同一種蛋白質在免疫原性上差別很大，甚至與生理條件下天然蛋白的免疫原性相差甚遠；由于蛋白質的空間結構(一級結構以上)在抗原制備過程中發生改變導致有些抗原性丟失，或暴露出非生理條件下的抗原決定簇。因為抗體用于診斷和治療等過程時，抗體識別的抗原是天然結構，是具有一定空間結構的單體或多聚體，所以制備抗體的理想蛋白質抗原應該是具有天然結構的蛋白質，另外對于真核細胞產生的蛋白質在某些情況下還要考慮糖基化對蛋白質的影響。有些蛋白質是否糖基化將影響蛋白質的免疫原性；由于原核細胞沒有糖基化系統。因此通過大腸桿菌基因工程制備的抗原沒有糖基化，所以有些必須糖基化的蛋白質抗原不能用大腸桿菌制備，糖基化對有些蛋白是必須的，其影響抗原的決定簇，因此有些免疫原必須來源真核細胞(從細胞中提取或真核細胞表達)。目前，制備NSE單抗多數以原核表達制備抗體，抗體針對天然蛋白的親和力一直不好，以至于此抗體實用價值很低，同時人神經元特異性烯醇化酶(NSE)在體液中及細胞體外分泌的量極低，也增加了天然NSE蛋白純化的難度。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種基因免疫制備人神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體的方法。本發明的技術方案概述如下:一種基因免疫制備人神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體的方法，其特征是包括如下步驟:`(I)以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列為上、下游引物，通過RT-PCR,從人肝癌細胞株BEL7402中擴增人NSE分子的cDNA全長，經TA克隆后進行DNA序列分析，確定正確的NSE基因序列SEQ ID N0.3，所述NSE為人神經元特異性烯醇化酶的簡稱；(2)將SEQ ID N0.3所示基因序列定向連接入真核分泌型載體pGEM_T的NcoI和XhoI位點之間，形成質粒pGEM-T-NSE ；(3)將質粒pGEM-T-NSE轉染入BEL7402細胞中，通過細胞培養，從細胞裂解液中純化出NSE重組蛋白；(4)用所述質粒pGEM-T-NSE多點注射于Balb/c小鼠的股四頭肌；(5)取經步驟(4)免疫的小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞；(6)將所述雜交瘤細胞用參有熒光標記的步驟(3)獲得的NSE重組蛋白的甲基纖維素制備的半固體培養基培養；(7)將步驟(6)培養獲得的雜交瘤細胞利用步驟(3)獲得的NSE重組蛋白通過ELISA，WB和免疫組化至少一種方法篩選能產生針對NSE蛋白表位單抗的陽性雜交瘤細胞株;(8)將步驟(7)獲得的陽性雜交瘤細胞株注射于Balb/c小鼠腹腔內使所述小鼠產生腹水；用蛋白G柱親和純化得到人神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體。本發明所能達到的有益效果:本發明制備的NSE單克隆抗體，具有高親和力及高特異性。
本發明制備的NSE單克隆抗體具有與人體NSE抗原更為接近的免疫學反應，因此，適用于研制臨床相關腫瘤標志物診斷的試劑盒。本發明制備的NSE單克隆抗體可針對天然的NSE抗原。本發明制備的NSE單克隆抗體是由真核表達的質粒直接免疫動物獲得。因此，使NSE分子真正作為診斷腫瘤性疾病的指示分子。本發明在NSE單克隆抗體的制備方法利用參有熒光標記的NSE轉染蛋白的甲基纖維素制備半固體培養基培養雜交瘤細胞，縮短了雜交瘤細胞前期篩選時間，使NSE單克隆生產實施更加簡單，操作更加容易，周期更短，制備更容易產業化和標準化。
具體實施例方式實驗材料:Taq DNA聚合酶，dNTP，限制性內切酶NcoI和XhoI，引物Oligo-dT，弓丨物T7和SP6，T4DNA連接酶，BEL7402細胞株，SCLC細胞株，pGEM-T載體，PMD-18T載體，大腸桿菌JM109菌株，脂質體復合物(大連TAKARA公司)；逆轉錄酶，TMB, DAB, MBS (Roche公司)；Trizol試劑，DMEM培養基(GIBCO);胎牛血清(GIBCO) ；Balb/c小鼠(中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心)；質粒DNA提取試劑盒和凝膠DNA回收試劑盒(Axygen公司)；焦碳酸二乙酯(DEPC)，蛋白胨和酵母粉，氨芐青霉素，瓊脂糖，氨基蝶呤，PEG-1500，HT, HAT，Tris，蛋白酶K，弗氏不完全佐劑，OPD, EDTA, RNA酶，Ni柱，BSA, PAGE (聚丙烯酰胺)(sigma公司);丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，十二烷基磺酸鈉(SDS)，甲基纖維素，過硫酸銨，TEMED (FLUKA)，BCA蛋白定量試劑，蛋白質透析袋(Pierce公司);HRP標記羊抗鼠IgG、FITC標記的鼠抗人IgG,突光標記物FITC (R and D system),雙氧水,蛋白G純化膠,IgY,丙酮，流式細胞儀(BD公司);硫酸，磷酸鹽，甲醛等(天津化工廠);LipofectAMINE DNA轉染試劑(Invitrogen公司)；細胞培養板，移液管(corning公司)；鼠抗人NSE單克隆抗體5E2(hystest)o上述實驗材料均為商品。引物SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0.2合成(北京三博遠志生物技術有限責任公司)；所需的全部儀器設備:PCR儀(Hybaid);低溫離心機，二氧化碳培養箱(美國Themo3100);加樣器，恒溫水浴鍋，基因槍(德國^pendorf);倒置顯微鏡(上海，H0508);生物安全柜(TECH, B2);酶標儀,核酸蛋白檢測儀，PH儀，(美國biorad);分析天平(SatoriusBS110S);超低溫冰箱(FORMA);液氮罐(成都液氮容器廠，YS-30-125);普通離心機(北京醫用離心機廠，LD5-2A);紫外分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司，751⑶)；蛋白轉膜儀，蛋白電泳儀(bio-rad)實施例1(I)NSE基因進行克隆和分析:逆轉錄PCR擴增NSE cDNA:用Trizol試劑(一種動物組織核細胞、細菌、真菌等提取總RNA的試劑盒)從500萬個BEL7402 (人肝癌細胞)提取經氨基蝶呤處理48小時的細胞總核糖核酸(RNA)，純化后用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理沉淀所得液體30μ I。由于DEPC可破壞核糖核酸酶(RNase)活性，因此可去除RNase的污染。在進行逆轉錄時，加入4 μ I的5倍緩沖液(pH為7.2的PBS)、I μ I引物Oligo-dT(0.5μ g/μ 1)、2μ I的10mMol/L濃度的脫氧核苷三磷酸(dNTP)、10 μ 1RNA、2 μ I去離子水，充分混勻，并置于70°C恒溫水浴10分鐘；然后，再置于冰上2分鐘；加入I μ I逆轉錄酶(50U，Roche)，混勻，再置于42°C水浴90分鐘，其逆轉錄體積共20 μ I。根據人NSE基因序列設計一對引物:SEQ ID N0.1 5，-GAATTCATGTCCATAGATAGAAGCTG-3，SEQ ID N0.2 5，-TCTAGAAGAGGACAGATCACACACTG-3，上游引物選取SEQ ID N0.1引入NcoI酶切位點；下游引物選取SEQ ID N0.2引入XhoI酶切位點；再進行PCR擴增，即加入5 μ I的10倍緩沖液(pH為7.2的PBS)，4 μ I dNTP(2.5mMol/L),1μ I (200ng)上游引物 1，1μ I (200ng)下游引物 2，5 μ I cDNA，I μ I (2.5U)TaqBI, 33 μ I去離子水；PCR擴增體積共50 μ I。混勻，置PCR儀上擴增:94°C 60秒，55°C 60秒，720C 120秒，共進行30個循環，最后補加72°C五分鐘。最后，用10 μ IPCR產物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，切下292bp位置的DNA條帶，用凝膠DNA回收試劑盒回收DNA片段用于TA克隆。TA克隆和DNA序列分析:純化的PCR產物與PMD-18T載體重化大腸桿菌組，轉大腸桿菌JM109菌株，涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養基上，37°C培養過夜，次日挑取10個白色的單菌落擴大培養，用質粒DNA提取試劑盒純化質粒，雙酶切NcoI和XhoI鑒定插入片段，在所選的10個克隆中均有插入片段，片段大小為2423bp。NSE重組TA克隆用T7和SP6引物雙向測序，結果與GenBank的NSE序列比較證明本次克隆的cDNA是人NSE基因，全長2423個堿基，用SEQ ID N0.3表 示。(2) NSE基因亞克隆入真核分泌型表達載體采用真核分泌型表達載體pGEM-T，其可將重組基因表達的蛋白分泌到細胞外。用NcoI和XhoI分別酶切NSE TA克隆質粒和pGEM_T質粒，用凝膠電泳和凝膠DNA回收試劑盒，分別純化NSE和pGEM-T的DNA片段，然后利用T4DNA連接酶進行連接反應。連接反應體積共15μ 1，即1.5μ I的10倍的緩沖液(pH為7.2的PBS)，8.Ομ I NSE DNA片段(SEQID N0.3),4.5μ I的pGEM-T ΝΑ,Ι.Ομ I的T4DNA連接酶，混勻，置4 °C冰箱過夜:加入300 μ I感受態的大腸桿菌JM109，置冰浴中I小時，42°C水浴90秒，再于冰水浴中5分鐘；加LB培養基1ml，混勻，置37°C培養I小時，離心收集沉淀，將沉淀的菌體涂于含氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB瓊脂培養基上，于37°C過夜培養。挑取10個菌落擴大培養，用試劑盒小提質粒DNA，再用內切酶和電泳鑒定重組質粒，所挑選的10個質粒均含有NSE基因，電泳顯示可以切下大約2423bp的DNA片段，NSE重組質粒，命名為pGEM-T-NSE。(3) pGEM-T-NSE DNA 的大量制備將pGEM-T-NSE轉入大腸桿菌JM109菌株，形成重組菌，重組菌于37°C活化培養過夜，然后接種于50ml的LB培養基中(含氨芐青霉素50pg/ml)，37°C振蕩培養5小時，再轉入500mL LB培養基中繼續培養5小時，離心回收菌體；按質粒DNA提取試劑盒程序提取質粒DNA ;在最后洗脫時選用無菌蒸餾水。純化的質粒DNA用紫外分光光度計檢測純度和定量。500ml培養的菌體可以提取400 μ g質粒DNA，冰箱中凍存備用。利用pGEM-T-NSE載體，轉染真核細胞，純化蛋白在6孔板中接種1-3X 105BEL7402細胞/孔，加入2ml體積百分濃度為20%胎牛血清DMEM培養基，置CO2孵箱中37°C培養過夜。待細胞長到80%單層時，在無菌離心管中配制如下溶液:①溶液A:將2 μ g待轉染的超純DNA (pGEM_T_NSE)稀釋到100 μ I DMEM培養基中。②溶液B:將 25 μ I LipofectAMINE 稀釋到 100 μ I DMEM 培養基中。③混合溶液A和B，輕輕混勻，室溫放置45分鐘。④用2ml DMEM培養基輕輕洗滌細胞，加入0.8ml DMEM培養基/孔，將脂質體復合物滴加到孔中，輕輕搖晃混勻，置CO2孵箱中37°C孵育24小時。⑤用20%胎牛血清DMEM培養基替換轉染液，繼續培養。⑥72小時后通過WB實驗檢測蛋白質的表達。⑦真核蛋白純化:準備2X 101°轉染后的BEL7402細胞，用0.2mM EDTAlml消化細胞，超聲破碎后，以15000轉/分鐘離心，收集上清，以PBS稀釋一定體積過Ni柱，用咪唑與pH為7.2的PBS緩沖液按體積比為1:1混合，從O-1OOmM梯度洗脫，分管接流出液，用SDS-page確定蛋白為NSE蛋白。之后蛋白加入甘油，使甘油的體積濃度為10%，放置小于零下70°C的超低溫冰箱中，以備后期使用。⑧蛋白質的熒光標記:取步驟⑦獲得的NSE蛋白lmg，于PBS緩沖溶液中37°C透析2小時后，加入MBS2mg37°C反應2小時。加入熒光標記物FITC2mg37°C反應4小時后PBS緩沖溶液中透析12小時。透析袋中即為連接好熒光標記物FITC的NSE蛋白。之后蛋白加入甘油，使甘油的體積濃度為10%，放置小于零下70°C的超低溫冰箱中，以備后期使用。(4)基因免疫制備NSE單克隆抗體NSE基因免疫Balb/c小鼠:免疫過程:取4周齡Balb/c純系雌性小鼠3只(其中一只不免疫作為對照)，每只鼠兩側股四頭肌分別注入50 μ g, pGEM-T-NSE (每側50pL);對照鼠注入等量的生理鹽水；每15天免疫一次，總共免疫5次，第二次免疫后10天開始檢測血清中抗體；于末次免疫后一周進行細胞融合。(5)取經步驟(4)免疫的小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合:A:飼養細胞制備:Balb/c小鼠拉頸處死，取其胸腺，置于IOmlDMEM培養液中，在鋼網上研磨分散細胞，棄大塊組織，將細胞調成5X IO6個/ml，96孔培養板每孔100 μ I。B:骨髓瘤細胞準備:小鼠骨髓瘤細胞為SP2/0細胞株,融合前細胞生長良好,細胞濃度為5X IO6個/ml。C:細胞融合:2.0X IO7個SP2/0骨髓瘤細胞與2.0X IO8個經步驟(4)免疫的Balb/c小鼠的脾細胞混勻，離心，棄上清，輕微振蕩混勻，于37°C水浴中，在90秒內滴加Iml體積濃度為50%的PEG-1500水溶液，然后滴加20mlDMEM培養基，離心，棄上清，再洗一次，離心，棄上清,得到雜交瘤細胞。(6)在含15%胎牛血清、1%甲基纖維素的DMEM半固體培養基50ml (含HAT)，再加入無菌處理過的，用熒光素FITC標記過的NSE蛋白10 μ g，混勻，向每直徑3.5cm培養皿倒3ml,(同時設有單獨Balb/c小鼠的脾細胞和單獨SP2/0骨髓瘤細胞對照)。細胞培養箱避光培養。每日觀察細胞生長狀態，10天左右出現克隆。于熒光顯微鏡下挑取有明顯熒光反應的細胞團，此細胞團即為針對NSE蛋白的陽性克隆。用移液器吸出細胞團于加入15%胎牛血清的DMEM培養基的96孔板中培 養3-5天。(7)雜交瘤培養上清NSE抗體的檢測:用直接ELISA檢測雜交瘤培養上清中的抗體，用NSE抗原包被ELISA板，加入培養上清，沖洗后加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，孵浴和沖洗后，加顯色底物TMB，然后測492nm的光密度，以高于陰性對照光密度2倍以上為陽性克隆。結果在融合后兩周的培養上清中有38孔顯示NSE抗體陽性。選擇效價高的幾個孔進行克隆化。陽性雜交瘤細胞株克隆化和擴大培養:培養孔內的多克隆細胞采用有限稀釋法進行克隆化，用含有HAT的培養基制備小鼠胸腺細胞作為飼養細胞，培養孔內的多克隆細胞進行稀釋至每孔含有100，10和I個細胞(100 μ I)，培養觀察，對只有一個克隆雜交瘤的培養上清進行檢測。選擇陽性克隆轉入24孔培養板中進行擴大培養，每孔1ml，培養5天后，加入4ml的15%胎牛血清的DMEM培養基，混勻，分入4個培養孔中，繼續培養5天，然后轉入培養瓶中進行擴大培養，選擇抗體陽性，且效價穩定的克隆進行進一步擴大和凍存。(8) NSE單克隆抗體大量制備和純化:Balb/c小鼠腹腔注入0.5ml弗氏不完全佐齊U，一周后每只小鼠腹腔注入5X IO5個步驟(7)所得到的雜交瘤細胞，然后當有明顯腹水形成時，針頭穿刺放腹水。收集的腹水12000轉/分鐘離心5分鐘，棄除沉淀，其上清液采用正辛酸-硫酸胺法進行提取，并用蛋白G柱親和層析純化，得到經過純化的NSE單克隆抗體:將純化后的NSE單克隆抗體用蛋白定量試劑(BCA)定量抗體，分裝保存。(9)NSE單克隆抗體的鑒定:A:雙抗體夾心ELISA:用體積比為1:200稀釋后的腹水包被固相；加入不同濃度的NSE蛋白，然后加堿性磷酸酶標記抗NSE的IgY，用堿性磷酸酶底物顯色，測450nm的光密度。B:免疫組化:制備SCLC細胞`涂片，分成兩組:一組為SCLC細胞；另一組為氨基喋呤誘導48小時的SCLC細胞，用EDTA消化培養兩組細胞，使其分散，用PBS洗一次，稀釋成5X105個/ml，每組細胞涂點為30μ I ;室溫干燥，丙酮固定5分鐘，然后用1%的雙氧水處理30分鐘；再用3%的BSA封閉30分鐘。然后加抗體(1:400稀釋)，孵浴和沖洗，加HRP標記羊抗鼠IgG,沖洗后加DAB底物顯色,光鏡下觀察結果，同時用商品試劑盒對照進行。最后，經過十二烷基磺酸鈉(SDS)-PAGE (聚丙烯酰胺)凝膠電泳法檢測其抗體純度；同時，進行抗體的IgG類型、亞類鑒定、以及抗體的結合位點和親和力測定等。結果得到兩株結合位點不同、且穩定分泌NSE抗體的雜交瘤細胞株，雜交瘤細胞克隆號為:1E4、7C6。所產的NSE單克隆抗體分別命名為1E4、7C6之后，置于低溫冰箱中保存，即可備為后續應用。效果:利用實施例1中得到最優的兩株抗NSE單克隆抗體1E4、7C6與hystest公司鼠抗人NSE單克隆抗體5E2進行比較試驗，流式細胞技術進行對比試驗，方法如下:取3支IOml離心管分別加入I X IO8個SCLC細胞，在其中各加入IOml甲醛固定2小時，PBS洗滌三次，800轉/分鐘，離心五分鐘，棄上清。取抗體1E4、7C6與5E2各I μ g分別加入IOml離心管中，37°C反應I小時，再加入FITC標記的鼠抗人IgG，37°C反應1.5小時，在流式細胞儀中測得10000個細胞中所能結合的抗體的平均熒光數值。其讀值為，1E4103、7C6 102、5E2 IO2 50通過流式細胞實驗，可以明確這三種抗體與人的天然NSE蛋白有結合，因此對于疾病檢測試劑盒與科研實驗有著很好的用途及市場前景。通過實驗得到的各單克隆抗體的平均熒光數值可以看出，抗體1E4平均熒光值大于抗體5E2，進而抗體1E4的親和力要好于抗體5E2。
弓丨物Oligo-dT:本品為多聚胸腺嘧啶，因為Oligo (dT)與mRNA的Poly(A)尾巴可以發生特異性結合，所以用Oligo (dT)特異結合到mRNA上Poly (A)尾端，以此可以特異地將mRNA從總RNA中分離出來。本發明操作的注意事項:本發明制備的產生NSE抗體的雜交瘤細胞常規保存于液氮中，定期復蘇和鑒定。雜交瘤細胞在小鼠體內誘導產生的腹水，以及后續純化的抗體等均應保存于低溫，并且在應用時稀釋液中應含有0.1%的牛血清白蛋白:長期保存腹水，或純化的抗體應存于深低溫(攝氏零下70°c);每一個批 次制備的抗體或腹水小樣分裝保存，避免反復凍融。
權利要求
1.一種基因免疫制備人神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體的方法，其特征是包括如下步驟: (1)以SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列為上、下游引物，通過RT-PCR,從人肝癌細胞株BEL7402中擴增人NSE分子的cDNA全長，經TA克隆后進行DNA序列分析，確定正確的NSE基因序列SEQ ID N0.3，所述NSE為人神經元特異性烯醇化酶的簡稱； (2)將SEQID N0.3所示基因序列定向連接入真核分泌型載體pGEM_T的NcoI和XhoI位點之間，形成質粒pGEM-T-NSE ； (3)將質粒pGEM-T-NSE轉染入BEL7402細胞中，通過細胞培養，從細胞裂解液中純化出NSE重組蛋白； (4)用所述質粒pGEM-T-NSE多點注射于Balb/c小鼠的股四頭肌； (5)取經步驟(4)免疫的小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合得到雜交瘤細胞； (6)將所述雜交瘤細胞用參有熒光標記的步驟(3)獲得的NSE重組蛋白的甲基纖維素制備的半固體培養基培養； (7)將步驟(6)培養獲得的雜交瘤細胞利用步驟(3)獲得的NSE重組蛋白通過ELISA方法篩選能產生針對NSE蛋白表位單抗的陽性雜交瘤細胞株； (8)將步驟(7)獲得的陽性雜交瘤細胞株注射于Balb/c小鼠腹腔內使所述小鼠產生腹水；用蛋白G柱親和純化得到人神經 元特異性烯醇化酶單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種基因免疫制備人神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體的方法，步驟為以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為引物,通過RT-PCR,得到NSE基因SEQ ID NO.3；將NSE基因接入pGEM-T，形成質粒pGEM-T-NSE；轉染入BEL7402細胞中，培養，從細胞裂解液中純化出NSE重組蛋白；用質粒注射小鼠；取免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合得雜交瘤細胞；培養；篩選能產生針對NSE蛋白表位單抗的陽性雜交瘤細胞；將陽性雜交瘤細胞株注射于小鼠腹腔內使產生腹水；純化得到人神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體。本發明縮短了雜交瘤細胞前期篩選時間，使生產簡單，操作容易，周期更短。
文檔編號C12N15/60GK103087193SQ201210576048
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者魏丙卓 申請人:天健生物制藥(天津)有限公司